王 丹,李艷霞,高 華,楊新玲*

(1新疆醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,烏魯木齊 830063;2新疆醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院康復(fù)科;3新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科;*通訊作者,E-mail:poplar862@sohu.com)

帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是當(dāng)今僅次于阿爾茨海默病的第二大神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。該病在60-65歲人群中發(fā)病率約為0.5%-1%,而在80歲以上人群中其發(fā)病率上升至1%-3%[1,2]。PD患者可有漸進(jìn)性的運(yùn)動(dòng)障礙,如靜止性震顫、肌強(qiáng)直、運(yùn)動(dòng)遲緩及姿勢步態(tài)異常;以及復(fù)雜的非運(yùn)動(dòng)癥狀包括精神癥狀如抑郁、焦慮、認(rèn)知功能減退和視幻覺,自主神經(jīng)功能障礙如便秘、直立性低血壓、性功能障礙,感覺癥狀如嗅覺減退、疼痛、肢體麻木,以及睡眠紊亂[3]。PD的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,目前尚未完全明確,目前研究認(rèn)為老齡化、基因和環(huán)境因素均可能與PD發(fā)病相關(guān)[4]。雖然帕金森病中神經(jīng)元變性的分子機(jī)制仍不完全明確,目前比較明確的是,遺傳因素對該病的發(fā)病有重要的影響。最近的全基因組關(guān)聯(lián)研究[5-7]已經(jīng)確定了幾個(gè)常見的基因,包括α-synuclein基因、LRRK2基因、Parkin基因、DJ-1基因、UCHL1基因、NURR1基因、PINK1基因、FBX07基因、PLA2G6基因、GIGyF2基因、GBA基因和ATP13A2(PARK9)基因等。近幾年,ATP13A2基因成為PD基因遺傳發(fā)病機(jī)制研究的熱點(diǎn)之一。報(bào)道顯示[8-10],ATP13A2基因是PD的易感致病基因,但在不同種族人群中,帕金森病患者ATP13A2基因的突變類型和突變頻率還有所差異。新疆地區(qū)有著特殊的地理和人文環(huán)境,但目前對于新疆地區(qū)不同民族帕金森病患者ATP13A2基因多態(tài)性尚缺乏相關(guān)研究。我們通過SangerDNA測序技術(shù)檢測并分析新疆地區(qū)漢族、維吾爾族帕金森病患者5個(gè)SNP位點(diǎn)的多態(tài)性,探討ATP13A2基因多態(tài)性與帕金森病之間的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2013-08～2018-03就診于新疆醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科的散發(fā)性PD患者218例為病例組,平均年齡(63.34±10.38)歲。漢族患者143例:其中男67例,女76例;維吾爾族患者75例:其中男45例,女30例。以上PD患者均符合以下納入標(biāo)準(zhǔn):①患者的臨床表現(xiàn)均符合英國帕金森病協(xié)會腦庫臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)[11];②長期生活在新疆地區(qū)(2代及以上);③臨床資料完整且完善量表評估。排除標(biāo)準(zhǔn):①腦血管病、外傷、腦炎、藥物等所引起的帕金森綜合征、帕金森疊加綜合征、家族性帕金森綜合征、肝豆?fàn)詈俗冃曰颊?②伴有各種嚴(yán)重器質(zhì)性疾病患者,如心肺功能不全、血液病、惡性腫瘤、肝腎功能不全者。同時(shí)選取就診于新疆醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院的健康體檢者234例為對照組,其中維吾爾族90例,漢族144例。男性113例,女性121例,平均年齡(62.06±9.44)歲。病例組與對照組在年齡、性別、民族方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。該研究經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)倫理委員會認(rèn)可,所有受試者均簽署知情同意書。

1.2 研究方法

抽取外周靜脈抗凝血2 ml,置于含800 μl乙二胺四乙酸(EDTA)的抗凝管中,使用天根生化科技(北京)有限公司的血液基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA,并嚴(yán)格按照試劑盒中配套說明書操作。在紫外線分光光度計(jì)上,以稀釋DNA的緩沖液為對照測定基因組DNA在260 nm和280 nm處的吸光度(A)值,這兩處波長的吸光度分別反映堿基中的共軛健和蛋白的含量。當(dāng)A260/A280為1.7-1.9,判定為DNA樣本合格。將提取的DNA樣本放于-20 ℃保存、備用。

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 引物設(shè)計(jì)是通過檢索美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)公共數(shù)據(jù)庫中ATP13A2基因序列,根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則并參照相關(guān)文獻(xiàn)[12]進(jìn)行設(shè)計(jì),確定引物序列后由上海生工公司合成(引物參數(shù)見表1)。

表1ATP13A2基因序列PCR引物

Table1PCRprimersforATP13A2gene

位點(diǎn) 引物序列(5′-3′)PCR產(chǎn)物長度(bp)rs56367069F3:TCCATCTGCCTGTCGCTGTA311R3:TGGAGTCCACCCACTCTTCCrs2076603F:ACCCACCATTCAGTCTCCCAT492R:ATTCTGTGCCAATGCCCAACCrs56379718F4:TTCCTACTCCAGCCCCGTT363R4:AAGAGCGGGACCTGCCTAATrs151117874F4:TGCCTCCCCAAATGACCTTTC484R4:CTCACTGCGCTTCTCTAGCCrs147277743F3:CCCACCCACTCTGAGGACTA365R3:CAAGGGCCCAAAAAGATGCC

F:上游引物;R:下游引物

1.2.2 PCR反應(yīng)條件 反應(yīng)體系共30 μl:10×PCR Buffer(Mg2+plus)3 μl,上下游引物(5 μmol/L)各1.5 μl,dNTP Mixture(2.5 mmol/L)3 μl,TaKaRa TaqTM Polymerase(5 U/μl)3 μl,DNA模板10-20 ng,加去離子水至30 μl。整個(gè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)在美國ABI公司生產(chǎn)的Verity 96well PCR儀中進(jìn)行。反應(yīng)條件為:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性30 s,65 ℃(-1 ℃/cycle)退火30 s,72 ℃延伸60 s,反復(fù)15個(gè)循環(huán);95 ℃變性30 s,52 ℃退火30 s,72 ℃延伸60 s,反復(fù)20個(gè)循環(huán),保存于4 ℃。所得PCR產(chǎn)物加樣10 μl于2%瓊脂糖凝膠中,以120 V電泳30 min,于紫外光凝膠成像儀下觀察,確定所得產(chǎn)物為所需研究片段。5個(gè)反應(yīng)位點(diǎn)反應(yīng)條件基本相同。

1.2.3 SangerDNA測序 實(shí)驗(yàn)中對于判斷ATP13A2基因5個(gè)位點(diǎn)的突變,我們?nèi)CR所得產(chǎn)物10 μl,送上海生工生物公司與基因組ATP13A2基因標(biāo)準(zhǔn)序列比對,直接測序以確定DNA序列。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

該實(shí)驗(yàn)為病例-對照研究,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)選用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 20.0進(jìn)行分析。年齡為計(jì)量資料,若符合正態(tài)分布,兩組比較采用t檢驗(yàn),若不符合正態(tài),數(shù)據(jù)用中位數(shù)±四分位間距表示，采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。性別及族別為計(jì)數(shù)資料,采用χ2檢驗(yàn)。基因頻率和基因型的分布采用基因計(jì)數(shù)法,基因型資料采用Hardy-Weinberg遺傳平衡定律的吻合度檢驗(yàn),計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和率(%)表示,兩組間相互比較采用χ2檢驗(yàn)和(或)Fisher精確概率法。采用Logistic回歸分析各位點(diǎn)與帕金森病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料

剔除部分DNA質(zhì)檢不合格樣本,所得出的一般資料結(jié)果見表2。病例組與對照組之間性別、年齡、族別差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。病例組≤50歲早發(fā)性帕金森病(EOPD)27例,>50歲晚發(fā)型帕金森病(LOPD)191例。對照組≤50歲33例,>50歲201例。

表2帕金森病例組與對照組一般臨床資料的比較

Table2Characteristicsoftheincludedpopulation

組別女/男(例)年齡(歲)漢族/維吾爾族(例)病例組106/11264.00±15.00143/75對照組121/11362.50±16.00144/90χ2/U0.430-1.8330.802P0.512?0.067#0.371?

*Pearson Chi-square;#Mann-WhitneyUtest

2.2 Hardy-Weinberg檢驗(yàn)

本研究經(jīng)Hardy-Weinberg平衡定律吻合度檢驗(yàn)法檢驗(yàn)后,病例組與對照組的基因型分布均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律,吻合度良好(見表3)。

2.3 ATP13A2基因多態(tài)性分析

ATP13A2基因的五個(gè)位點(diǎn)經(jīng)PCR擴(kuò)增后為大小不等的片段(見圖1)。218例PD患者及234例健康對照組經(jīng)DNA測序,ATP13A2基因rs56367069(Arg294Gln)位點(diǎn)基因型均為GG型,未見AG型或AA型突變;rs56379718(Gly49Ser)位點(diǎn)基因型均為CC型,未見CT型或TT型突變;rs151117874(Thr12Met)位點(diǎn)基因型均為GG型,未見AG型或AA型突變。218例PD患者中rs147277743(Ala746Thr)位點(diǎn)基因型僅有1例漢族患者為AG型(見圖1A),且該患者為早發(fā)型帕金森患者(EOPD);其余217例PD患者基因型均為GG型,未發(fā)現(xiàn)有AA型。rs2076603位點(diǎn)基因型有AA、AG、GG三種(見圖1B-D),其分布頻率見表3。

表3帕金森病例組與對照組基因多態(tài)性檢測結(jié)果例(%)

Table3ResultsofpolymorphismtestbetweenPDgroupandcontrolgroupcases(%)

基因位點(diǎn)n基因型等位基因 GGAGAA GAHWE(P)rs56367069 病例組218218(100)0(0)0(0)436(100)0(0)- 對照組234234(100)0(0)0(0)468(100)0(0)-rs151117874 病例組218218(100)0(0)0(0)436(100)0(0)- 對照組234234(100)0(0)0(0)468(100)0(0)-rs147277743 病例組218217(99.54)1(0.46)0(0)435(99.77)1(0.23)0.972923 對照組234234(100)0(0)0(0)468(100)0(0)-rs2076603 病例組21888(40.37)93(42.66)37(16.97)269(61.70)167(38.30)0.15 對照組23472(30.77)109(46.58)53(22.65)253(54.06)215(45.94)0.341rs56379718 CCCTTT CT 病例組218218(100)0(0)0(0)436(100)0(0)- 對照組234234(100)0(0)0(0)468(100)0(0)-

HWE：Hardy-Weinberg平衡定律吻合度檢驗(yàn);-：未能進(jìn)行檢驗(yàn)

圖1 ATP13A2基因多態(tài)性Figure 1 ATP13A2 gene polymorphism

2.4 維吾爾族、漢族病例組與對照組的ATP13A2基因五個(gè)位點(diǎn)的基因型及等位基因的分布

維吾爾族病例組與對照組rs56367069(Arg294Gln)位點(diǎn)、rs56379718(Gly49Ser)位點(diǎn)、rs151117874(Thr12Met)位點(diǎn)、rs147277743(Ala746Thr)位點(diǎn)和rs2076603位點(diǎn)基因型及等位基因分布間差異無統(tǒng)計(jì)意義(P>0.05);漢族病例組與對照組rs56367069(Arg294Gln)位點(diǎn)、rs56379718(Gly49Ser)位點(diǎn)、rs151117874(Thr12Met)位點(diǎn)、rs147277743(Ala746Thr)位點(diǎn)基因型及等位基因分布間差異無統(tǒng)計(jì)意義(P>0.05)。ATP13A2基因rs2076603位點(diǎn)的基因型GG、AG和AA在漢族PD病例組與對照組中的分布比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);rs2076603位點(diǎn)的等位基因G和A在兩組中的分布比較,差異具有統(tǒng)計(jì)意義(P<0.05,見表4)。

2.5 ATP13A2基因rs2076603位點(diǎn)的單因素分析及分層分析

2.5.1 ATP13A2基因rs2076603位點(diǎn)不同基因型遺傳模型的單因素Logistic回歸及分層分析 在隱性模型中,GG基因型攜帶者患PD的風(fēng)險(xiǎn)是AG或AA型攜帶者的0.657倍(P<0.05,見表5)。

2.5.2 ATP13A2基因rs2076603位點(diǎn)的分層分析 根據(jù)性別、民族、年齡對Logistic回歸進(jìn)行分層校正:在男性的顯性模型中,GG或AG攜帶者患PD的風(fēng)險(xiǎn)是AA攜帶者的0.505倍(P<0.05),在男性等位基因模型中,A等位基因是PD的保護(hù)因素,攜帶A等位基因患PD的風(fēng)險(xiǎn)是攜帶G等位基因者的0.612倍(P<0.05,見表6)。

在漢族隱性模型中,GG攜帶者患PD是AG和AA攜帶者的0.522倍(P<0.05),在漢族等位基因模型中,A等位基因是PD的保護(hù)因素,攜帶A等位基因患PD的風(fēng)險(xiǎn)是攜帶G等位基因者的0.616倍(P<0.05,見表7)。

在大于50歲等位基因模型中,A等位基因是PD的保護(hù)因素,攜帶A等位基因患PD的風(fēng)險(xiǎn)是攜帶G等位基因者的0.751倍(P<0.05,見表8)。

表4帕金森病例組與對照組基因型及等位基因分布

Table4GenotypicandallelicdistributioninPDgroupandcontrolgroup

位點(diǎn) 組別基因型等位基因GGAGAAχ2PGAχ2Prs56367069 漢族病例組14300-2860-對照組144002880 維吾爾族病例組7500-1500-對照組90001800rs151117874 漢族病例組14300-2860-對照組144002880 維吾爾族病例組7500-1500-對照組90001800rs147277743 漢族病例組142100.49828510.498對照組144002880 維吾爾族病例組7500-1500-對照組90001800rs2076603 漢族病例組5762247.7870.021761108.2110.004對照組376938143145 維吾爾族病例組3131130.1640.92193570.0270.869對照組35401511070rs56379718CCCTTTCT 漢族病例組14300-2860-對照組144002880 維吾爾族病例組7500-1500-對照組90001800

-:未能進(jìn)行檢驗(yàn)

表5兩組間ATP13A2基因rs2076603位點(diǎn)基因型不同遺傳模型的比較

Table5ComparisonofgeneticmodelsofATP13A2atrs2076603betweenthetwogroups

組別顯性模型[(GG+AG)/AA]隱性模型[GG/(AG+AA)]等位基因(A/G)病例組181/3788/130167/269對照組181/5372/162215/253OR0.6980.6570.731P0.1320.0330.02

表6不同性別中rs2076603位點(diǎn)基因型不同遺傳模型的比較(例)

Table6Comparisonofgeneticmodelsofrs2076603betweenPDandcontrolsinmalesandfemales(cases)

組別女性男性顯性模型[(GG+AG)/AA]隱性模型[GG/(AG+AA)]等位基因(A/G)顯性模型[(GG+AG)/AA]隱性模型[GG/(AG+AA)]等位基因(A/G)病例組89/1741/6582/13092/2047/6585/139對照組102/1938/83102/14079/3434/79113/113OR1.0250.7260.8660.5050.5950.612P0.9450.2520.4530.0330.0640.01

表7不同民族中rs2076603位點(diǎn)基因型的不同遺傳模型的比較(例)

Table7Comparisonofgeneticmodelsofrs2076603betweenPDandcontrolsinHanandUgyurpopulation(cases)

組別漢族維吾爾族顯性模型[(GG+AG)/AA]隱性模型[GG/(AG+AA)]等位基因(A/G)顯性模型[(GG+AG)/AA]隱性模型[GG/(AG+AA)]等位基因(A/G)病例組119/2457/86110/17662/1331/4457/93對照組106/3837/107145/14375/1535/5570/110OR0.5630.5220.6161.0481.1070.963P0.050.0110.0040.910.750.869

表8不同年齡rs2076603位點(diǎn)的遺傳模型(例)

Table8Comparisonofgeneticmodelsofrs2076603betweenPDandcontrolsindifferentages(cases)

組別≤50歲>50歲顯性[(GG+AG)/AA]隱性[GG/(AG+AA)]等位(A/G)顯性[(GG+AG)/AA]隱性[GG/(AG+AA)]等位(A/G)病例組24/313/1417/37157/3475/116150/232對照組28/59/2429/37153/4863/138186/216OR0.70.4040.5860.690.7060.751P0.6480.0980.1640.140.1010.048

3 討論

近年來多項(xiàng)研究均表明ATPl3A2基因是PD的易感致病基因[8-10]。我們通過采用SangerDNA測序方法對新疆地區(qū)漢族、維吾爾族帕金森患者進(jìn)行ATP13A2基因多態(tài)性研究。在本研究中我們發(fā)現(xiàn),ATP13A2基因rs2076603位點(diǎn)的基因型GG、AG和AA在漢族PD病例組與對照組中的分布比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);rs2076603位點(diǎn)的等位基因G和A在兩組中的分布比較,差異具有統(tǒng)計(jì)意義(P<0.05),提示ATP13A2基因的rs2076603位點(diǎn)與PD的發(fā)生有相關(guān)性。分層分析中發(fā)現(xiàn),在男性等位基因模型中,A攜帶者患PD是G攜帶者的0.612倍(P<0.05);在漢族等位基因模型中,A攜帶者患PD是G攜帶者的0.616倍(P<0.05);在大于50歲等位基因模型中,A攜帶者患PD是G攜帶者的0.751倍(P<0.05),rs2076603的A等位基因在不同性別、族別、年齡中有顯著差異,提示A等位基因可能是PD的保護(hù)因素。在218例PD患者中我們發(fā)現(xiàn)1例患者rs147277743(Ala746Thr)位點(diǎn)突變,為雜合子基因突變AG,突變頻率為0.46%,該患者為46歲女性,為EOPD患者,該患者臨床表現(xiàn)以震顫及平衡障礙為主,由于突變樣本量少,與野生AA基因型無法做比較,今后的工作仍需擴(kuò)大樣本量繼續(xù)進(jìn)一步研究。在我國大陸及臺灣有研究結(jié)果顯示PD存在ATP13A2基因Ala746Thr和Thr12Met位點(diǎn)的突變,但其基因突變總體頻率較低[13-19]。我們的研究發(fā)現(xiàn)在218名PD病例組及234例對照組均未發(fā)現(xiàn)rs56367069(Arg294Gln)位點(diǎn)、rs56379718(Gly49Ser)位點(diǎn)、rs151117874(Thr12Met)位點(diǎn)多態(tài)性,與目前研究所報(bào)道的ATP13A2基因總體突變頻率較低的研究結(jié)果一致。

新疆的維吾爾族有著與漢族人種不同的遺傳背景[17-18,20],生活方式及飲食習(xí)慣也有不同,但是在本文中通過比較ATP13A2基因rs56367069(Arg294Gln)位點(diǎn)、rs56379718(Gly49Ser)位點(diǎn)、rs151117874(Thr12Met)位點(diǎn)、rs147277743(Ala746Thr)位點(diǎn)和rs2076603位點(diǎn)的基因型和等位基因分布發(fā)現(xiàn),在新疆的維吾爾族與漢族兩民族PD患者中差異不明顯,維吾爾族病例組及漢族病例組分別與其相應(yīng)民族的對照組多態(tài)位點(diǎn)基因型和等位基因頻率分布比較差異亦不明顯,提示該基因的多態(tài)位點(diǎn)在這兩個(gè)民族PD患者間可能存在較小的差異性。

大多數(shù)PD患者為散發(fā)性,但約10%-20%的PD患者具有家族遺傳史,遺傳因素在PD的發(fā)病中起了重要作用,在近些年的報(bào)道中,不斷發(fā)現(xiàn)新的PD致病基因位點(diǎn),目前關(guān)于不同民族的PD易感基因的研究尚不足,我們將在今后的工作中進(jìn)一步開展大樣本、多中心的臨床研究進(jìn)行深入探討。