孫亞蘭，黃 誠

(贛南醫(yī)學院 1.2018級碩士研究生；2.基礎醫(yī)學院；3.疼痛醫(yī)學研究所，江西 贛州 341000)

疼痛是一種與現(xiàn)在或潛在的組織損傷相關聯(lián)的不愉快的主觀感覺與情感體驗[1]。慢性痛普遍且持續(xù)存在于多種疾病的發(fā)病過程，由于其發(fā)病機制的復雜性和治療的局限性，至今仍然困擾著無數(shù)患者。目前，臨床上最常見的慢性痛主要有炎性痛、神經(jīng)病理性痛和癌性痛。炎性痛是由創(chuàng)傷、感染、化學刺激或外科手術操作等所誘發(fā)的疼痛[2]。TLR4/NF-κB信號通路激活后所產(chǎn)生的炎性介質(zhì)可導致炎癥反應，而與炎癥相關的變化則可誘導神經(jīng)纖維周圍化學環(huán)境的敏化、受損細胞內(nèi)源性因子的釋放，并可激活神經(jīng)纖維和鄰近的非神經(jīng)細胞(如星形膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞、血小板和免疫細胞)[3]。自噬通過與TLR信號通路的相互作用來調(diào)節(jié)炎癥反應，影響巨噬細胞、嗜中性粒細胞等炎癥細胞的發(fā)育、平衡和存活以及諸多細胞因子的轉(zhuǎn)錄和分泌[4-5]。本文主要圍繞TLR4/NF-κB信號通路的組成、活化、生物學效應及其在炎性痛的調(diào)控下與自噬相關分子的關系綜述如下。

1 TLR4/NF-κB信號通路

1.1TLR4分子TLRs是一類跨膜模式識別受體，通過識別外源性配體、病原相關分子模式和危險相關分子模式來介導先天性免疫和適應性免疫[6]。自從1997年TLR4在哺乳動物體內(nèi)被發(fā)現(xiàn)以來，目前已發(fā)現(xiàn)10種人類功能性TLR(TLR1-TLR10)和12種小鼠功能性TLR(TLR1-TLR9和TLR11-TLR13)。其中TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6和TLR10位于質(zhì)膜中以識別細菌膜成分，而TLR3、TLR7、TLR8和TLR9主要位于細胞內(nèi)隔間以識別核酸配體[7]。TLR4是第一個與果蠅Toll蛋白同源而被發(fā)現(xiàn)的TLR，它屬于I型跨膜受體蛋白，由胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)三部分組成，胞外區(qū)富含亮氨酸的重復序列，胞外域結(jié)構(gòu)彎曲成馬蹄狀，其富含亮氨酸的重復序列部分構(gòu)成配體結(jié)合區(qū)，并識別各種病原相關分子，跨膜區(qū)富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域，胞內(nèi)區(qū)與人的白介素1受體高度同源。

1.2NF-κB分子核因子κB(NF-κB)是調(diào)節(jié)核轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄因子，其家族成員包括NF-κB1(P50)、NF-κB2(P52)、RelA(P65)、RelB和c-Rel等[8]。IκBα、IκBβ、IκBε和P50、P52的前體為NF-κB的抑制蛋白。細胞靜止時，NF-κB在胞漿中可抑制蛋白的結(jié)合，但不影響轉(zhuǎn)錄。一旦細胞激活后，IκB的氨基末端高度保守的絲氨酸殘基被IκB激酶(IKK)催化后發(fā)生磷酸化，進而被降解。IKK是NF-κBs上游的調(diào)節(jié)因子，以與抑制性IκBs結(jié)合的同二聚體或異二聚體的形式存在[6]。IκB降解后的NF-κB分子二聚體進入細胞核，與DNA結(jié)合來調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄。

1.3TLR4/NF-κB信號通路的激活NF-κB是TLR4信號通路下游的關鍵轉(zhuǎn)錄因子，在調(diào)節(jié)免疫應答中起重要作用[9]。根據(jù)是否需要MyD88的介導，可將TLRs信號通路分為MyD88依賴性和MyD88非依賴性，而TLR4兼有以上兩條信號通路的功能。MyD88分子的C-端含TIR結(jié)構(gòu)域，與TLR4胞內(nèi)區(qū)的TIR結(jié)合，N-端通過死亡結(jié)構(gòu)域(DD)募集下游含有DD結(jié)構(gòu)域的信號接頭分子，使下傳信號激活NF-κB并誘導促炎細胞因子的分泌。TRIF的N-端可激活NF-κB，從而誘導促炎細胞因子的釋放。NF-κB信號通路的激活和促炎細胞因子的表達與多種類型細胞TLR4的激活有關[10]。TLR4能識別各種外源性病原體相關分子或毒素，并與相應配體發(fā)生相互作用， NF-κB激活后可分泌促炎細胞因子，從而啟動獲得性免疫反應[11]。綜上可見，TLR4在細胞炎癥反應中發(fā)揮重要作用。

2 TLR4/NF-κB信號通路與炎性痛

越來越多的研究表明，TLR4是促炎反應中的關鍵受體之一，它與持續(xù)性疼痛的病理機制有關[12-13]。TLR4的活化最終表現(xiàn)在mRNA和蛋白水平上激活NF-κB，而NF-κB信號通路的激活主要可誘導促炎細胞因子的釋放。在暴露于微囊藻毒素的亮氨酸精氨酸(Microcystin-leucine arginine, MC-LR)后的48 h內(nèi)，激活的TLR4和NF-κB可上調(diào)促炎細胞因子TNF-α、IL-1β和IFN-γ的表達[14]，而這些促炎細胞因子和活性氧反過來又可使痛覺感受器敏化，從而導致炎性痛的發(fā)生[15]。TLR4不僅在免疫系統(tǒng)有表達，而且在神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元和非神經(jīng)元(如小膠質(zhì)細胞、星形膠質(zhì)細胞)中也有表達。有研究[16]顯示，miR-451可能通過TLR4靶向抑制激活的小膠質(zhì)細胞所誘發(fā)的炎癥反應，減輕完全弗氏佐劑(Complete Freund's Adjuvant, CFA)誘導的炎性痛[17]。蒿本內(nèi)酯經(jīng)靜脈注射后可抑制脊髓星形膠質(zhì)細胞的TLR4表達，進而減輕CFA或脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)誘導的慢性炎性痛的發(fā)生發(fā)展。在脊髓缺血再灌注(Ischemia reperfusion, IR)所誘導的炎性痛中，CXCL12/CXCR4通過激活星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞的TLR4正反饋環(huán)，在炎性痛的發(fā)生和維持中發(fā)揮重要作用。若下調(diào)CXCL12/CXCR4的表達，可抑制脊髓星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞的TLR4激活，并有效改善痛敏行為和減少促炎細胞因子的釋放[18]。以上實驗證據(jù)表明，TLR4在炎性痛的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著重要角色。

3 自 噬

自噬是細胞利用溶酶體來降解自身受損的細胞器和大分子的過程，是細胞存活、分化和發(fā)育的重要機制[19]。根據(jù)細胞內(nèi)底物運送到溶酶體內(nèi)方式的不同，可分為大自噬、小自噬和分子伴侶介導的自噬。在自噬形成的初始階段，多種ATG蛋白在諸多信號通路的調(diào)節(jié)下被募集到PAS上，它們相互協(xié)調(diào)并參與自噬小體的形成。其中核心復合物主要是在自噬初始階段起作用的ULK復合物。此外，在自噬小體中發(fā)揮作用的磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)復合體Ⅰ以及兩類泛素化結(jié)合的復合物，它們對自噬小體雙層膜的形成也至關重要[20]。

3.1TLR4/NF-κB信號通路對自噬的調(diào)控自噬是炎癥產(chǎn)生的一個重要途徑[21]。TRAF6為腫瘤壞死因子受體相關因子(Tumor necrosis factor receptor-associated factors, TRAFs)蛋白家族中的一員，其泛素連接酶活性在細胞自噬的啟動和功能中起著關鍵作用，并參與調(diào)節(jié)TLR所介導的信號傳導[22]。在TLR刺激下，MyD88募集白細胞介素-1受體相關激酶1(IRAK-1)和白細胞介素-1受體相關激酶4(IRAK-4)[23]，而磷酸化的IRAK-1可募集TRAF6、E3泛素連接酶和支架蛋白。然后TRAF6通過Lys63(K63)連接的泛素鏈進行自動泛素化[24]，泛素化的TRAF6可激活一個包含絲裂原活化蛋白激酶激酶激酶7(MAP3K7/TAK1)、TGFβ活化激酶1(MAP3K7)結(jié)合蛋白1(TAB1)和TGFβ活化激酶1(MAP3K7)結(jié)合蛋白2(TAB2)的復合體[25]，隨后該復合體誘導IKK復合物的磷酸化，導致NF-κB和促炎細胞因子的表達升高[23]。有研究表明TLR4可誘導自噬，它的參與可募集MyD88和Beclin1[26]。Beclin1是哺乳動物酵母ATG6的同源物，是Ⅲ型磷脂酰肌醇-3激酶復合物(PI3KC3)的關鍵成分，其與多個協(xié)同因子參與自噬調(diào)節(jié)。MyD88和TRIF過表達均可導致Beclin1的募集，TLR4將Beclin1募集至受體復合物中，TRAF6可直接導致Beclin1泛素化，而Beclin1泛素化增強了PI3KC3的活性，使TLR信號誘導的NF-κB和A20激活，致使Beclin1泛素化減少，從而降低巨噬細胞的自噬。在炎癥反應中，Beclin1-K63的泛素化對自噬調(diào)節(jié)起著重要作用[27]。有研究發(fā)現(xiàn)在VB2細胞培養(yǎng)中，LPS可抑制小膠質(zhì)細胞的自噬[28]。LPS刺激原發(fā)性單核細胞可導致Beclin1和K63的連鎖泛素化[27]。進一步的實驗顯示，通過TLR4下游信號分子MyD88/TRIF-NF-κB的信號級聯(lián)反應，TAK-242(TLR4的抑制劑)可抑制神經(jīng)元自噬和神經(jīng)炎癥反應[29]。以上結(jié)果提示TLR4/NF-κB信號通路在自噬調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用。

3.2炎性痛與自噬炎性痛通常發(fā)生在組織損傷和免疫細胞浸潤的部位[30]。炎癥小體是一種由NLRP3、ASC和pro-Caspase-1組成的胞質(zhì)多蛋白復合物，在病原體入侵后可誘導促炎細胞因子的生成。雖然NLRP3炎癥小體的正常激活有助于宿主防御，但過度激活可導致炎癥性相關的疾病。在SD大鼠足底注射CFA后，皮膚組織中的ASC、NLRP3炎癥小體、Caspase-1、IL-1β、Caspase-1 p20和IL-1β p17的表達顯著增加[31]；此外，IL-1β、TNF-α和IL-6等促炎細胞因子的表達也明顯上升[32]，這些炎性介質(zhì)可誘導痛覺過敏。炎癥小體的異常激活促使大量炎性因子的釋放，進一步導致嚴重的組織損傷和炎癥性疾病的發(fā)展。因此，NLRP3炎癥小體的激活需受到嚴格的調(diào)控。自噬是一種細胞內(nèi)降解系統(tǒng)，當機體暴露于微生物感染、微粒物質(zhì)和ATP時，可清除受損細胞器，自噬限制了NLRP3炎癥小體的激活[33]。比如，NLRP3炎癥小體的激活物可引起線粒體損傷，進而導致ROS的產(chǎn)生，引發(fā)NLRP3炎癥小體的激活。自噬還可誘導受損吞噬體的清除，泛素化的ASC和IL-1β可抑制由其他炎癥小體介導的IL-1β產(chǎn)生[34]。IL-1β、IL-1α和IFN-γ可誘導Beclin1的泛素化，這表明也可以通過類似于LPS的機制來激活自噬[35]。在小鼠外周血單核細胞中，應用3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine, 3-MA)抑制自噬，可導致IL-1β釋放的增加和TNF/TNFα的降低[36]。在腰椎間盤神經(jīng)根疼痛時，可致使microRNA-21異常升高和IL-6的表達增加，但是細胞的自噬減少[37]。這些實驗結(jié)果表明炎性痛與自噬之間存在著交互作用。

4 小結(jié)與展望

綜上所述，在炎性痛的發(fā)生發(fā)展過程中，TLR4/NF-κB信號通路起著至關重要的作用。自噬為炎癥小體的主要調(diào)節(jié)器，而且TLR4/NF-κB信號通路在自噬中也發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。因此，在炎性痛中，TLR4/NF-κB信號通路、炎癥小體與自噬相關分子之間存在相互聯(lián)系，目前，有關TLR4/NF-κB信號通路與炎癥小體、自噬相關分子的研究還不多，對于TLR4/NF-κB信號通路與炎癥小體、自噬相關分子之間的關系有賴于進一步實驗來加以揭示。自噬可清除與損傷相關的分子模式、炎性成分或細胞因子，進而減少炎癥小體的激活。同樣，炎癥小體可以調(diào)節(jié)自噬過程，因此，闡明它們的相互作用可能是臨床治療炎性痛的關鍵所在。

TLR4/NF-κB是經(jīng)典的炎癥信號通路，對炎性痛的發(fā)生發(fā)展具有調(diào)節(jié)作用，愈來愈多的研究表明，通過抑制TLR4/NF-κB信號通路可降低炎性介質(zhì)的釋放，從而緩解疼痛，這為治療炎性痛提供研究思路。近年來，隨著中醫(yī)藥理論和實踐的快速發(fā)展，對中藥有效成分和功效的研究備受關注。三氟淫羊藿素(Rifluoro-icaritin, ICTF)是小檗科淫羊藿屬植物干燥莖葉提取物淫羊藿素(Icaritin, ICT)的衍生物。有研究顯示ICT在人先天免疫細胞中具有抗炎作用，它能抑制CD14/TLR4對脂多糖的識別，以及抑制NF-κB信號通路[38]。此外，ICT能激活轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關因子2(Nuclear factor erythroid 2 related factor 2, Nrf2)改善氧化應激并降低血管內(nèi)皮生長因子和炎癥細胞因子[39]。ICTF可通過抑制氧化應激對腦缺血再灌注損傷具有保護作用[40]。為此，基于炎性痛的發(fā)病機制和ICT的抗炎作用，通過進一步探索ICTF是否通過抑制TLR4/NF-κB信號通路的抗炎作用機制，為臨床治療炎性痛提供新靶點和途徑。