李 丹 綜述，蘭風華 審校

(廈門大學附屬東方醫(yī)院全軍檢驗醫(yī)學研究所臨床遺傳與實驗醫(yī)學科，福建福州 350025)

產(chǎn)前診斷是降低遺傳缺陷新生兒出生率最重要的方法，其金標準為羊膜腔穿刺獲取羊水中胎兒細胞行產(chǎn)前遺傳分析，但因其操作的有創(chuàng)性、致流產(chǎn)風險和診斷時間位于孕中晚期等原因仍難以為廣大孕婦所接受。通過微創(chuàng)的方式獲得胎兒遺傳物質(zhì)及早期的產(chǎn)前診斷技術是該領域研究者追求的目標。宮頸脫落滋養(yǎng)層細胞取材安全、便利，是產(chǎn)前診斷技術微創(chuàng)化的重要備選來源之一，且其可將診斷時間提早至5孕周[1]，即在現(xiàn)有的技術能檢測出胎兒是否患有先天性疾病之前，在微創(chuàng)性產(chǎn)前診斷領域展示出良好的應用前景。

1 宮頸脫落滋養(yǎng)層細胞的獲取

孕早期宮頸脫落滋養(yǎng)層細胞的獲取方法有沖洗法(宮腔灌洗和宮頸灌洗)和直接獲取法(棉拭子、細胞刷取材法和宮頸黏液抽吸)，由于取材方法、孕期、懷孕狀態(tài)、操作者、檢測方法靈敏度等的不同，各研究宮頸滋養(yǎng)層細胞的獲取成功率在40%～90%[1]。

棉拭子和細胞刷取材法安全性最高，但最易受母體細胞和殘留精子及其遺傳物質(zhì)的影響，導致目標細胞獲取成功率低，波動范圍大，結(jié)果可靠性低。國內(nèi)學者改良的套管拭子以及雙取器宮頸毛刷，更易于探入宮頸，取材污染程度相對較低，可將滋養(yǎng)層細胞的獲取成功率分別從原來的37.5%及40.0%提高至69.6%及77.8%[2-3]。宮頸黏液抽吸法為在超聲的定位下借助導管直接吸取宮頸黏液，滋養(yǎng)層細胞的獲取成功率為60.0%左右[4]。

沖洗法為向?qū)m腔下段或者宮頸管內(nèi)注射生理鹽水后立即回抽獲取宮頸黏液標本的方法，該法獲取滋養(yǎng)層細胞成功率可達80%～90%[5]，是目前效率最高的方法。ERGIN等[6]在25例選擇終止妊娠的孕婦中進行宮腔灌洗和宮頸灌洗的方法學比較發(fā)現(xiàn)，宮腔灌洗標本目標細胞獲取成功率及對胎兒性別的鑒定準確性均高于宮頸灌洗標本，但是兩者間的差異無統(tǒng)計學意義。沖洗法所獲標本中可見血污染，甚至蛻膜碎片及絨毛碎片，表明該法具有一定的創(chuàng)傷性，且曾報道了1例在7～8孕周行宮腔灌洗的孕婦于38周時產(chǎn)下了四肢嚴重發(fā)育不全的胎兒[7]，以上表明雖然沖洗法目標細胞獲取成功率高，診斷準確性好，但是必須正視其侵入性質(zhì)以及對胎兒潛在的傷害，需要更多的研究對其安全性進行評估。

2 脫落滋養(yǎng)層細胞的分離

滋養(yǎng)層細胞的分離是基于宮頸脫落滋養(yǎng)層細胞進行微創(chuàng)性產(chǎn)前診斷的重要環(huán)節(jié)，所分離細胞的純度以及濃度直接影響診斷結(jié)果的準確性。國內(nèi)外所用的方法主要有顯微操作法、激光捕獲顯微切割、免疫磁珠分離、流式細胞術以及差速貼壁培養(yǎng)富集法等。

顯微操作法操作簡單，在顯微鏡下直接將標本中形態(tài)上具有滋養(yǎng)層組織和絨毛絲特征的細胞團塊通過玻璃管吸取出來。有研究利用顯微操作后的標本成功鑒定了152名胎兒性別、2例唐氏綜合征及2例性染色體缺失胎兒[8]，但該方法依賴手工操作，自動化程度較低。

免疫磁珠分離法及流式細胞術基于滋養(yǎng)層細胞表達抗原與其抗體的特異性結(jié)合而分離目標細胞。G233為絨毛外細胞滋養(yǎng)層細胞和中間滋養(yǎng)層細胞表達的人類白細胞抗原G(HLA-G)的特異性抗體，偶聯(lián)有該抗體的磁珠與目標細胞結(jié)合，在外加磁場的作用下兩者復合物滯留在磁場中從而分離細胞，分離細胞純度達90%～100%，每個宮頸黏液標本可獲得500～1 500個滋養(yǎng)層細胞，分離細胞具有絨毛外滋養(yǎng)層細胞表型和完整核DNA(>95%)[9]。流式細胞術利用HLA-G的熒光抗體與滋養(yǎng)層細胞結(jié)合，分選出高純度滋養(yǎng)層細胞，該技術也適用于胞質(zhì)內(nèi)抗原。這兩種方法分離的目標細胞純度高，但由于抗體高度特異性以及標本前期處理所造成的抗原破壞等因素會導致一定量的目標細胞丟失。

激光捕獲顯微切割是基于細胞形態(tài)和細胞病理特點實現(xiàn)的細胞純化技術，有研究者切割形態(tài)學上具有細胞滋養(yǎng)層細胞或者合體滋養(yǎng)層細胞特點的細胞，經(jīng)基因型分析確定平均每兩個微切割細胞中有一個為滋養(yǎng)層細胞，與免疫組化及原位雜交等技術相結(jié)合大大提高了該技術細胞純化的效率[10-11]，但也應注意因切割精度所帶來細胞核及細胞質(zhì)的損害。

差速貼壁培養(yǎng)法利用滋養(yǎng)層細胞與母體污染細胞在培養(yǎng)時的貼壁速度不同從而去除母體懸浮細胞。袁靜等[12]的研究中，滋養(yǎng)層細胞在差速貼壁培養(yǎng)中的培養(yǎng)成功率為95%，且成功鑒定了90%胎兒的性別，直接培養(yǎng)的對照組該細胞的培養(yǎng)成功率為96%，但是僅正確鑒定了38%胎兒的性別。該方法很大程度上依賴樣本中細胞的活性，宮頸標本中的脫落細胞的活性是限制貼壁培養(yǎng)效率的最大障礙。

3 脫落滋養(yǎng)層細胞的鑒定

分離細胞的胎源性鑒定是利用滋養(yǎng)層細胞進行產(chǎn)前診斷必不可少的步驟。所分離的細胞經(jīng)形態(tài)學、免疫表型以及遺傳信息的分析確認其為胎源性細胞，才能進一步利用其進行產(chǎn)前診斷，細胞鑒定方法的準確性是基于滋養(yǎng)層細胞進行產(chǎn)前診斷的關鍵所在。

形態(tài)學方法為在顯微鏡下觀察宮頸標本涂片的蘇木精-伊紅染色(HE)結(jié)果，將滋養(yǎng)層細胞從眾多污染母體細胞中識別出來。宮頸滋養(yǎng)層細胞有細胞滋養(yǎng)層細胞、中間滋養(yǎng)層細胞及合體滋養(yǎng)層細胞，其中合體滋養(yǎng)層細胞形態(tài)獨特，細胞大小形態(tài)多變，胞核小且深染,數(shù)目不一，大小一致，胞質(zhì)弱嗜酸性，易于辨別，但形態(tài)學鑒定方法主觀性強，疑似的細胞需經(jīng)免疫組化或者遺傳分析確定。

利用滋養(yǎng)層細胞表達的特異性抗原表位行免疫組化染色是細胞鑒定的常用方法，常用的鑒定抗體有G233、抗細胞角蛋白7(CK-7)抗體、抗人絨毛膜促性腺激素β(β-hCG)抗體、NDOG5、NDOG1、FT141.1等。G233、NDOG5與細胞滋養(yǎng)層細胞特異結(jié)合[13-14]；NDOG1識別合體滋養(yǎng)層細胞[15]；FT141.1對滋養(yǎng)層細胞均識別[16]。β-hCG為滋養(yǎng)層細胞分泌的特異性蛋白，有研究用其進行分離細胞純度鑒定[17]；抗CK-7抗體特異性低，與高特異抗體聯(lián)合染色可以抵消由特異性抗體所致的假陰性結(jié)果[18]?？贵w自身特異性或者敏感性不足及標本前處理導致的抗原破壞將降低免疫組化法細胞鑒定的效率，需探索特異度強、敏感度高的抗體組合，或者與分子生物學分析相結(jié)合，從而抵消方法學不足。

遺傳信息分析方法涉及熒光原位雜交(FISH)、聚合酶鏈反應(PCR)等，通過識別胎兒細胞區(qū)別于母體的遺傳信息從而鑒定其胎源性。FISH用熒光染料標記特定基因，如Y染色體上的DYZ1衛(wèi)星Ⅲ和X染色體上的DXZ1衛(wèi)星αDNA[19]，對陽性核進行評估區(qū)分胎兒與母體細胞，并可以識別污染精子。與FISH相似，PCR擴增特定基因如性別決定區(qū)域Y(SRY)，確定分離細胞的胎源性[9]，BUSSANI等[8]研究發(fā)現(xiàn)，PCR與FISH鑒定的效率相當[20]，且由于難以區(qū)分父源衍生的X染色體與母體X染色體遺傳信息，兩者均局限于男性胎兒細胞的胎源性鑒定。由傳統(tǒng)PCR衍生而來的熒光定量PCR基于DNA多態(tài)性，引入高度多態(tài)性標志如短串聯(lián)重復序列(STR)，利用個體的雜合性，與母體細胞的STR譜相區(qū)別。由于X和Y染色體長臂假性染色體區(qū)域的五核苷酸和次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸-核糖基轉(zhuǎn)移酶STR等高度多態(tài)性標記的引入使檢測不受標本胎兒性別的影響，此外，利用給定STR位點熒光峰比例還可進行非整倍體分析[15]。

4 診斷應用

滋養(yǎng)層細胞分化來源于胎兒組織，與胎兒細胞具有相同的遺傳物質(zhì)，通過對其遺傳分析進行產(chǎn)前診斷的方法經(jīng)研究，現(xiàn)已實現(xiàn)胎兒性別鑒定、多種染色體和單基因遺傳病的診斷及不良妊娠結(jié)局的預測等。

胎兒性別的診斷對于防止性連鎖遺傳病患兒的出生尤為重要，1971年SHETTLES[21]通過宮頸黏液標本內(nèi)的Y小體熒光染色準確鑒定出6名男性胎兒和4名女性胎兒的性別，盡管后續(xù)研究結(jié)果差異較大，但隨著FISH、PCR等技術的發(fā)展，診斷準確性有了極大的改善。BOLNICK等[9]對5～20孕周孕婦細胞刷獲取的宮頸樣本分別進行FISH、PCR等檢測正確診斷出所有胎兒性別。

染色體疾病是由于染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)目異常所致的疾病，唐氏綜合征以及其他染色體疾病約占全世界新生兒的0.2%[19]，隨著孕婦年齡的增加，胎兒的患病風險增大?；趯m頸脫落滋養(yǎng)層細胞的產(chǎn)前診斷已可實現(xiàn)21、18、13、X、Y等染色體異常的診斷[8,22-23]。SIFAKIS等[22]利用細胞刷獲取孕11～13周孕婦的宮頸黏液，通過FISH分析準確診斷出5名唐氏綜合征的胎兒，單樣本中三倍體細胞數(shù)最多者可達27個。BIRON-SHENTAL等[24]加強了對孕早期宮頸滋養(yǎng)層細胞的認識，通過孕早期宮頸樣本與胎盤組織的FISH雜交結(jié)果比較發(fā)現(xiàn)，在正常妊娠中，存在由于滋養(yǎng)層細胞的核內(nèi)復制導致的多倍體細胞的存在，但大多為四倍體，不會導致三倍體的假陽性結(jié)果。

單基因疾病超過7 000多種，總體發(fā)病率達3.5%，導致約20%的嬰兒死亡，以及10%的兒童住院率[25]。該類疾病種類繁多并逐年增加，且不易識別和診斷，是臨床診斷最為困難的病種。PFEIFER等[11]通過單細胞基因分析成功從21名8～12孕周的孕婦宮頸樣本中篩選出3名囊性纖維化及3名脊髓性肌萎縮癥胎兒。另外研究者們還利用宮頸滋養(yǎng)層細胞數(shù)目或者該細胞所表達蛋白的差異進行不良妊娠結(jié)局預測[18,26]。

5 問題與展望

經(jīng)宮頸獲取滋養(yǎng)層細胞進行胎兒遺傳信息分析作為微創(chuàng)性產(chǎn)前診斷方法之一，與基于母血中胎兒細胞的產(chǎn)前分析相比，具備目標細胞含量多、母體細胞污染相對少、不易受孕齡影響、與前胎妊娠不重疊等優(yōu)勢。相比于基于母體血漿中游離胎兒DNA的產(chǎn)前分析，該方法可以獲得完整的胎兒基因組，診斷結(jié)果可靠性高，并且不受特殊母體環(huán)境下游離腫瘤DNA的干擾，是應用前景較廣的產(chǎn)前診斷方法，但也存在如下的問題。

首先，雖然樣本中母體細胞的污染程度顯著少于外周血，但是仍有大量母體細胞的存在，而且由于宮頸標本性質(zhì)的特殊性，目標細胞的分離仍是棘手的問題。其次，由于分離效率的不足，直接影響后期的鑒定及分析準確性，且目前大多數(shù)研究間的分離和鑒定方法沒有統(tǒng)一標準，各方法間可比性差，操作主觀性強，故可靠性有待證實。再次，當前研究在理論上或一些臨床試驗證實宮頸取材對繼續(xù)妊娠沒有影響，但研究主要的受試對象為待終止妊娠的孕婦，而無大規(guī)模隨機對照及產(chǎn)前診斷隨訪繼續(xù)妊娠的病例進行比較的數(shù)據(jù)，故其安全性有待評估。最后，由于大多數(shù)研究是在單胎妊娠的情況下進行的，對多胎妊娠進行診斷時，可能存在分析結(jié)果與實際不符的現(xiàn)象。異卵雙生胎兒的其中之一自發(fā)性流失可以干擾正?；蚍钦扼w存活胚胎的DNA分析，從而導致假陽性或陰性檢測結(jié)果[15]，多胎妊娠診斷結(jié)果異常時，則必須通過羊膜腔穿刺等有創(chuàng)的方法進行異常的胚胎判別。隨著單細胞數(shù)字PCR(dPCR)和液滴-測序(Drop-Seq)技術的發(fā)展和引入，上述問題將被逐步解決[27-28]。

綜上所述，基于宮頸滋養(yǎng)層細胞行無創(chuàng)產(chǎn)前診斷應用前景甚廣，但目前仍缺乏簡單、標準、穩(wěn)定、安全、可靠的適用于臨床常規(guī)分析的方法，技術水平上難以大范圍應用于臨床實驗室診斷，因此，需要更多的研究。但其發(fā)展為應用于臨床的微創(chuàng)性產(chǎn)前診斷方法是未來發(fā)展的必然趨勢。