鄭杰，單云峰

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，浙江 溫州 325000，1.介入科，2.肝膽外科）

胰腺癌是全球最致命的癌癥之一，其中胰腺導(dǎo)管腺癌（PDAC）占胰腺癌的80%[1]。盡管在過去的30年間胰腺癌的診斷檢測與治療取得了進展，但五年生存率僅為8%[2]。這種低生存率主要歸因于胰腺癌診斷時常為晚期，有高轉(zhuǎn)移潛力，治療選擇有限，目前的常規(guī)療法效果不佳[3-4]。手術(shù)切除腫瘤仍然是這些患者實現(xiàn)長期生存的唯一希望，但由于PDAC患者在診斷時常為晚期，僅20%的胰腺癌患者可進行根治性切除[4]。此外，手術(shù)切除的患者仍有高比例的復(fù)發(fā)風(fēng)險，通常在2年內(nèi)死亡[5]。

外泌體是內(nèi)吞起源的細(xì)胞外囊泡（EV），其大小約30～150 nm[6]。外泌體可由細(xì)胞分泌到細(xì)胞外間隙并進入血液循環(huán)，并可攜帶反映其源細(xì)胞特征的蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)組等，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞間的通訊與行為[7-8]。其中，癌細(xì)胞來源的外泌體參與腫瘤微環(huán)境的形成，是癌癥發(fā)生發(fā)展的重要因素[8-11]，近年來已成為研究人類癌癥的診斷生物標(biāo)志物和治療靶標(biāo)的熱點之一[12]。胰腺癌細(xì)胞來源的外泌體（PEX）是胰腺癌的腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素之一[13]。本文就外泌體對胰腺癌的診斷、治療及預(yù)后檢測的臨床價值進行討論。

1 PEX與胰腺癌的診斷

由于胰腺癌潛在發(fā)病且缺乏特異的臨床表現(xiàn)，大多數(shù)患者診斷時往往是晚期[14]。傳統(tǒng)的影像學(xué)檢查，如CT/MRI掃描和內(nèi)鏡逆行胰膽管造影（ERCP）價格昂貴，并且可能存在潛在的誘發(fā)風(fēng)險[15]。CA19-9是目前唯一被批準(zhǔn)用于胰腺癌診斷的血清生物標(biāo)志物，但CA19-9缺乏敏感性和特異性，約25%的患者不升高，且慢性胰腺炎（CP）和高膽紅素血癥患者的CA19-9水平也會增加[16]。而外泌體由于其生物學(xué)特性，在臨床診斷方面具有獨特優(yōu)勢。首先，胰腺癌細(xì)胞產(chǎn)生的囊泡主要是PEX而不是其他細(xì)胞外囊泡，PEX內(nèi)富含大量具有檢測價值的標(biāo)志物[7]；第二，PEX可以從多種體液中非侵入性地收集，并且可以實時監(jiān)測[12]；第三，PEX具有穩(wěn)定性，其內(nèi)容物不受外部核酸酶和蛋白酶的降解[12]；第四，與常規(guī)活組織檢查相比，PEX分子可以通過RT-PCR和新一代測序檢測，相對便捷[15]。

PEX中異常表達(dá)的生物分子具有一定的診斷價值。研究報道，胰腺癌來源的外泌體膜中富含一種名為磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1（GPC1）的蛋白質(zhì)，它是多種癌癥類型中過表達(dá)的膜錨定蛋白[17]，通過啟動子的低甲基化在胰腺癌患者中高表達(dá)[18]。Melo等[13]研究發(fā)現(xiàn)，來自190例PDAC患者的外泌體檢測出比健康個體中更高水平的GPC1，對于早期診斷的胰腺癌同時具有100%的敏感性和100%的特異性，并且GPC1陽性PEX的水平可區(qū)分I～IV期胰腺癌患者。Yang等[19]建立了包含5種基于EV的蛋白質(zhì)標(biāo)志物（EGRF、EPCAM、MUC1、GPC1和WNT2）的聯(lián)合模型，結(jié)果顯示其比現(xiàn)有血清標(biāo)志物CA19-9或任何單一EV標(biāo)志物具有更高的靈敏度（86%）和特異性（81%），其中包括最佳標(biāo)志物GPC1的靈敏度（82%）和特異性（52%）。這兩項研究中GPC1的抗體及囊泡分離方法可能導(dǎo)致其結(jié)果差異，但進一步表明GPC1可能是胰腺癌中有效的早期篩選生物標(biāo)志物。此外，PC-1.0細(xì)胞（一種高度惡性的胰腺癌細(xì)胞系）來源的外泌體內(nèi)含有鋅轉(zhuǎn)運蛋白（ZIP4），能夠有效區(qū)分胰腺癌和良性胰腺疾病、膽道疾病和正常對照，并且ZIP4能夠在體外和體內(nèi)促進PC-1.0癌細(xì)胞進展，提示ZIP4可能是胰腺癌的新型診斷生物標(biāo)志物[20]。

此外，許多研究表明PEX中富含的多種miRNA具有潛在的診斷價值。Lai等[14]的研究表明，高PEX-miR-10b、-miR-21、-miR-30c和-miR-181a以及低PEX-miR-let7a水平能夠顯著區(qū)分早期PDAC與正常組織；另外某些升高的miRNA在PDAC切除術(shù)后24 h內(nèi)降至正常值，表明PEX-miRNA的診斷價值可能優(yōu)于GPC1。另外，有研究對15例早期胰腺癌及正常組織進行新一代測序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PEX中高度富集的miR-196a和miR-1246可能是早期檢測胰腺癌的潛在生物標(biāo)志物，其中miR-1246更適用于導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀黏液性腫瘤（IPMN）[21]。此外，PEX-miR-191、-miR-21和-miR-451a在胰腺癌和IPMN中也顯著過表達(dá)，其診斷準(zhǔn)確度比相應(yīng)的循環(huán)miRNA高5%～20%[22]，其中miR-21還可能與胰腺癌預(yù)后有關(guān)。另外一項研究證實，PEX中高表達(dá)的miR-17-5p和miR-21能靈敏地區(qū)分胰腺癌與良性胰腺腫瘤，并且PEX-miR-17-5p可能參與胰腺癌進展[23]。值得注意的是，該研究結(jié)果表明PEX中miR-196a較正常U6內(nèi)參低表達(dá)，這與之前一項研究結(jié)果不一致。綜上，PEX-miRNA在早期診斷方面具有一定的優(yōu)勢，可用于胰腺癌的篩查。目前已有研究團隊開發(fā)了DSN輔助的雙SERS生物傳感器，用于外泌體中的microRNA-10b和基于Fe3O4@Ag-DNA-Au@Ag@DTNB綴合物的血液樣品檢測的殘留血漿的檢測，對來自PDAC、CP和正常對照的血液樣品中的靶miRNA和血液樣品的殘留上清液直接定量，并且在它們之間可以發(fā)現(xiàn)顯著的SERS信號區(qū)別，以此來精確反映PEX-miRNA，希望實現(xiàn)癌癥一步法診斷的即時診斷技術(shù)[24]。此外，Nakamura等[25]檢測收集27個PDAC與8個慢性胰腺炎的胰液樣本，發(fā)現(xiàn)PDAC患者中的PEX-miR-21與-miR-155顯著高于CP患者，聯(lián)合胰液細(xì)胞學(xué)的診斷準(zhǔn)確度可達(dá)91%，證實胰液中的PEX-miRNA也可作為PDAC的生物標(biāo)志物。

2 PEX與胰腺癌的治療

外泌體中攜帶含有許多生物學(xué)功能的小分子物質(zhì)，同時具備了多種理想材料的特性，使得PEX能夠成為胰腺癌的重要治療靶點。腫瘤來源外泌體可以傳遞這些“關(guān)鍵分子”到腫瘤細(xì)胞中，對腫瘤細(xì)胞的存活和生長具有促進作用，這意味著抑制外泌體生成、釋放或攝取的藥物可能具有治療癌癥的潛能。同時PEX也非常穩(wěn)定，可以長期儲存，適合工業(yè)生產(chǎn)。此外，PEX還可以作為“微型抗原呈遞細(xì)胞”，參與促進宿主組織侵入和隨后的免疫應(yīng)答的轉(zhuǎn)移和逃避過程，具有作為新型免疫治療劑的應(yīng)用潛能[26]。本文主要闡述外泌體抑制劑的抗腫瘤作用以及PEX在免疫療法方面的研究進展。

目前，關(guān)于在PDAC免疫療法中使用PEX的研究仍然很少。最近的一項體內(nèi)研究表明，常用于PDAC治療的化療藥物（即全反式維甲-ATRA、舒尼替尼和吉西他濱）與負(fù)載PEX的樹突狀細(xì)胞（DC）疫苗相結(jié)合，可有效抑制轉(zhuǎn)移瘤的生長，延長胰腺癌小鼠的存活時間[27]。Su等[28]用轉(zhuǎn)染miR-155和miR-125b2的Panc-1細(xì)胞外泌體處理，可將M2巨噬細(xì)胞重新編程為具有抗腫瘤表型的M1型。因此，應(yīng)進一步探索生物工程腫瘤外泌體，以表達(dá)可導(dǎo)致巨噬細(xì)胞表型變化并抑制其免疫抑制和促腫瘤活性的特異性miRNA用于臨床研究。另一項研究表明，巨噬細(xì)胞來源的外泌體能夠在體外和體內(nèi)顯著降低PDAC細(xì)胞對吉西他濱的敏感性，用吉西他濱治療后，Rab27a和Rab27b敲除的小鼠PDAC腫瘤比野生型小鼠更小[29]。盡管該研究的重點不是基于PEX的免疫治療，但從另一方面表明PEX介導(dǎo)的胰腺癌細(xì)胞和免疫細(xì)胞之間的細(xì)胞間交流可能是導(dǎo)致胰腺癌的預(yù)后不良和治療抵抗的關(guān)鍵因素。同時該研究還表明，化療藥物與Rab27a/b抑制劑或其他外泌體分泌抑制劑的組合可以顯著改善患者對胰腺癌的療效反應(yīng)。Zech等[30]報道，來自大鼠胰腺癌細(xì)胞系BSp73ASML（ASML）的外泌體可通過減少CD44v6、ZAP70和ERK1/2磷酸化來影響白細(xì)胞增殖。此外，胰腺癌衍生的PEX通過miR-203下調(diào)樹突狀細(xì)胞中的TLR4和下游細(xì)胞因子[31]。另外一些研究報道了腫瘤衍生的納米顆粒對腫瘤細(xì)胞可能具有凋亡作用。人胰腺腫瘤衍生的納米顆粒能夠抵消組成型活化的PI3K/AKT存活途徑，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[32]。而腫瘤外泌體納米顆粒能夠通過與靶細(xì)胞的相互作用抑制Notch-1的細(xì)胞存活途徑，并激活決定腫瘤細(xì)胞命運的細(xì)胞凋亡途徑[33]。

此外，還可以通過抑制癌癥來源的外泌體的分泌來觸發(fā)抗癌免疫應(yīng)答，從而阻礙癌細(xì)胞重編程其微環(huán)境能力。吉西他濱與外泌體抑制劑GW4869的聯(lián)用可以用于預(yù)防化療耐藥[34]。但GW4869會同時抑制癌細(xì)胞和正常細(xì)胞分泌的外泌體，直接抑制外泌體分泌可能會導(dǎo)致正常的細(xì)胞功能喪失，因此應(yīng)慎重選擇其適應(yīng)證。目前相對安全的方法是抑制已知能夠?qū)崿F(xiàn)外泌體的促腫瘤發(fā)生和促轉(zhuǎn)移功能的特定蛋白質(zhì)。例如，有研究發(fā)現(xiàn)GAIP-相互作用蛋白C末端（GIPC）是阻斷腫瘤細(xì)胞自噬的主要調(diào)節(jié)因子，它通過影響PEXs的生物發(fā)生、分泌和分子組成來調(diào)節(jié)細(xì)胞運輸途徑[35]。另外，GIPC能夠耗竭PEX中的抗藥性基因ABCG2（一種抗藥性蛋白）的過表達(dá)，使得腫瘤細(xì)胞吉西他濱仍然敏感。因此，GIPC可能是克服胰腺癌化療耐藥的潛在治療靶點。Hoshino等[9]發(fā)現(xiàn)，在PEX中對過表達(dá)的ITG4或ITG5的抑制能夠顯著降低胰腺癌細(xì)胞遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的能力。此外，其他細(xì)胞囊泡運輸?shù)鞍滓部赡茉谂R床治療中作為靶點，如RAB27A與TP53與胰腺癌的侵襲行為有關(guān)[36-37]。另一方面，如果癌癥來源的外泌體的特異性靶向成為現(xiàn)實，那么可能會出現(xiàn)一系列新的治療可能性，從而有可能徹底改變癌癥治療的方式。最近，Datta等[38]通過定量高通量篩選（qHTS）對LOPAC文庫和NPC文庫兩種藥物庫進行篩選，從中篩選鑒定出能夠調(diào)節(jié)前列腺癌細(xì)胞外泌體生物發(fā)生和分泌能力的化合物，該研究表明藥物再利用可通過影響外泌體而作為晚期癌癥的新型輔助治療策略。

3 PEX與胰腺癌的預(yù)后、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)

關(guān)于PEX在胰腺癌預(yù)后中的作用尚未進行確定的臨床研究，但已經(jīng)有一些研究報道了PEX在胰腺癌中的預(yù)后價值。例如PEX-GPC1與術(shù)前和術(shù)后患者的腫瘤負(fù)荷及生存相關(guān)，提示其作為胰腺癌預(yù)后生物標(biāo)志物的作用[13]。而胰腺癌中高表達(dá)的RAB27A與TP53與預(yù)后差有關(guān)[37]。PEX-miR-17-5p預(yù)測胰腺癌患者預(yù)后不良，因為它與炎癥反應(yīng)或腫瘤免疫逃逸有關(guān)[23]。MiR-21是另一種PEX miRNA，已被確定為胰腺癌總體存活的候選預(yù)后因子[22]。MiR-301a-3p在缺氧條件下選擇性包裝入PEXs，與浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和晚期TNM分期呈正相關(guān)，因此是胰腺癌的預(yù)后分子[39]。此外，具有腫瘤前胰腺病變的小鼠和患有I期PDAC的患者高度表達(dá)PEXMIF，表明PEX-MIF在肝轉(zhuǎn)移之前是可檢測的，因此可能具有預(yù)后價值。PEX中的DNA也可能具有預(yù)后意義，PEX突變體KRAS的縱向監(jiān)測可以預(yù)測局部胰腺癌患者的新輔助治療結(jié)果和轉(zhuǎn)移瘤患者的進展[40]。因此，PEX內(nèi)容物在預(yù)后價值中的判斷值得進一步臨床研究。

外泌體可以作為介導(dǎo)鄰近或長距離細(xì)胞間的通訊交流信號，具有符合癌癥轉(zhuǎn)移的潛在條件因素[9]。Gesierich等[41]在大鼠胰腺癌研究中發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞可以大量傳遞外泌體，這些外泌體起到長距離細(xì)胞間通訊的作用，并且是形成轉(zhuǎn)移前生態(tài)位的主要成分。另一項研究也表明外泌體在突變CD44介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移前生態(tài)位形成中起重要作用[42]。最近的一項研究也表明PDAC衍生的外泌體在幼稚小鼠中誘導(dǎo)肝臟轉(zhuǎn)移前的生態(tài)位，并增加肝臟轉(zhuǎn)移負(fù)荷[10]，該研究還報道巨噬細(xì)胞移動抑制因子（MIF）在PDAC衍生的外泌體中高度表達(dá)。與胰腺腫瘤無進展的患者相比，I期PDAC發(fā)生肝轉(zhuǎn)移的患者外泌體水平顯著升高。這些研究結(jié)果表明，MIF外泌體水平可作為肝臟轉(zhuǎn)移前生態(tài)位形成的早期生物標(biāo)志物，也可作為腫瘤前病變患者轉(zhuǎn)移風(fēng)險的預(yù)后因素，如胰腺炎、IPMNs和轉(zhuǎn)移前PDAC[10]?？傊?，研究表明腫瘤來源的外泌體可能參與原發(fā)性腫瘤細(xì)胞器官特異性轉(zhuǎn)移，但仍需要進一步的研究來確定抑制外泌體功能對轉(zhuǎn)移前的生態(tài)位形成及其在胰腺癌中的治療潛力的影響。

4 外泌體作為給藥載體

外泌體可作為腫瘤特異性抗原和免疫調(diào)節(jié)藥物的納米載體，是有希望治療癌癥的方法之一。外泌體與其他納米粒子相比具有多種優(yōu)勢，如其本身的內(nèi)源性特性，并能攜帶不同類型分子（包括蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸）的能力[43-44]，同時具備無毒性和非免疫原性。目前應(yīng)用的納米載體如脂質(zhì)體，實際上是基于脂質(zhì)的納米載體，脂質(zhì)體的合成性質(zhì)和聚合物核心決定了其固有的相關(guān)毒性[45-46]。因此，脂質(zhì)體被普遍認(rèn)為是外來的，且可引發(fā)過敏反應(yīng)，其特征在于強烈的先天免疫反應(yīng)[47]。與脂質(zhì)體不同，外泌體由生物體內(nèi)的大多數(shù)細(xì)胞自然分泌[6]，探索患者自身的健康細(xì)胞來生產(chǎn)用于癌癥治療的外泌體，可以減少對受體的不良免疫反應(yīng)[48]。已有研究報道，CD47能夠保護小鼠的循環(huán)中的外泌體免受單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的吞噬作用，依賴這種保護作用，外泌體能夠?qū)Ⅲw內(nèi)靶向KRASG12D的RNAi分子遞送至胰腺癌細(xì)胞，并顯著提高胰腺癌小鼠存活率，其療效遠(yuǎn)高于脂質(zhì)體[49]。外泌體還可以增強其內(nèi)容物（特別是RNA分子）的穩(wěn)定性和生物利用度，避免這些載物在通過循環(huán)時被迅速降解[50-51]。另一方面，外泌體的小尺寸使它們能夠穿透天然屏障，包括血腦屏障[52-53]，并深入到組織內(nèi)[54]。外泌體能夠被特定的靶細(xì)胞吸收，這一過程可能受外泌體表面特異性黏附分子、整合素和四跨膜蛋白的調(diào)節(jié)[55-57]。例如，表達(dá)Tspan8的細(xì)胞的外泌體優(yōu)先被CD54+的胰腺細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞攝取[57]。因此，未來基于外泌體的療法可以利用這些特征來靶向特定細(xì)胞。但這一特性也表明，不應(yīng)輕率使用外泌體作為免疫調(diào)節(jié)藥物的載體。外泌體表面蛋白的微小變化可以改變外泌體的特異性，對外泌體生物產(chǎn)生過程及對靶細(xì)胞廣泛了解是研究基于外泌體的治療工程所具備的基本要求[57]。外泌體表面特定蛋白的表達(dá)可以通過上調(diào)源細(xì)胞中相關(guān)蛋白表達(dá)來控制[57-58]。將超順磁性納米顆粒錨定到外泌體上可以改善腫瘤細(xì)胞的靶向性，外泌體可通過中等磁場“引導(dǎo)”到腫瘤細(xì)胞中[59]。進入受體細(xì)胞后，外泌體將內(nèi)容物釋放到細(xì)胞質(zhì)中，誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)[60-61]、信號通路的激活狀態(tài)[62]和細(xì)胞的表型[63-65]等變化。此外，外泌體也可以通過內(nèi)吞作用進入受體細(xì)胞，或通過外泌體膜中存在的蛋白質(zhì)與受體細(xì)胞的質(zhì)膜融合[43]。因此，外泌體是將免疫調(diào)節(jié)劑遞送到特定靶細(xì)胞中以阻斷免疫抑制和（或）刺激抗癌免疫應(yīng)答的潛在工具。這兩種方法可以與標(biāo)準(zhǔn)化療藥物聯(lián)合使用，以最大限度地消除胰腺癌細(xì)胞，減小副作用，從而達(dá)到手術(shù)能夠切除腫瘤的目的，提高患者的存活率。

5 目前的局限性和未來的展望

據(jù)我們所知，目前在胰腺癌的研究領(lǐng)域，尚未有研究或課題使用外泌體來作為提供免疫治療藥物、抗原、細(xì)胞因子或其他免疫刺激分子。基于PEX的多種功能和臨床意義，PEX是有潛力的生物標(biāo)志物和胰腺癌治療的潛在靶標(biāo)。許多標(biāo)志物分子的不同表達(dá)賦予PEXs診斷和預(yù)后價值。通過細(xì)胞間通訊，PEX參與腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡，免疫耐受和轉(zhuǎn)移，以及代謝重編程，為胰腺癌提供了各種潛在的治療靶點。許多研究也證明外泌體分泌的抑制對治療癌癥有效[11，34]。此外，外泌體可能是一種新型的藥物遞送工具，因為與常規(guī)納米顆粒相比，它具有多種獨特的性質(zhì)。然而，在考慮PEX的臨床應(yīng)用之前，需要解決幾個問題。首先，由于缺乏標(biāo)準(zhǔn)化方案，很難比較PEX相關(guān)研究中的結(jié)果。因此需要建立一套無爭議的程序，包括開始樣品量、外泌體富集、內(nèi)容物提取和純化，以及選擇合適的內(nèi)參對照[11]。其次，PEX的影響取決于其內(nèi)容物：PEX中既有促癌相關(guān)分子，也有抑癌相關(guān)分子[66]。評價衡量這種腫瘤負(fù)荷平衡也是亟需解決的關(guān)鍵問題。第三，大多數(shù)PEX相關(guān)研究是在體外進行的，今后的研究應(yīng)當(dāng)在這些體外培養(yǎng)體系中使用外泌體制劑來探討外泌體對細(xì)胞的影響，但在這種條件下分泌的外泌體內(nèi)容物的數(shù)量是否會受到影響我們不得而知。第四，當(dāng)研究體內(nèi)PEX的功能時，重要的是實現(xiàn)PEX釋放的特異性誘導(dǎo)或干擾而不影響EV或其他信號分子的其他亞型的釋放。第五，盡管許多PEX內(nèi)容物是胰腺癌的生物標(biāo)志物候選者，但目前尚未應(yīng)用到臨床。因此對這些候選基因進行基礎(chǔ)研究向臨床實踐的轉(zhuǎn)化驗證也是必不可少的。第六，對血漿和血清以外的生物流體的關(guān)注有限。一項研究表明，唾液外泌體是比血清外泌體更好的診斷候選者[67]，這表明在未來的研究中需要更多地關(guān)注非常規(guī)生物流體。最后，對于外泌體作為胰腺癌的藥物遞送系統(tǒng)，必須開發(fā)適當(dāng)?shù)姆椒▉砀纳扑幬锇?、器官向性和外泌體的耐久性。顯然，對PEX的研究還處于起步階段。鑒于PEX的臨床意義和該研究領(lǐng)域的挑戰(zhàn)，需要更多的努力來深入了解PEX，以促進胰腺癌的治療和預(yù)后。此外，獲得用于治療目的的外泌體的最佳細(xì)胞來源仍有爭議。我們提倡使用從患者自身分離的健康細(xì)胞來獲得外泌體，然后可以將其設(shè)計為將免疫調(diào)節(jié)分子攜帶至特定細(xì)胞。結(jié)果表明，這些囊泡能夠逃避免疫系統(tǒng)并安全地穿過血流以激活針對癌細(xì)胞的特異性免疫應(yīng)答。目前牛乳外泌體由于易分離、易大規(guī)模生產(chǎn)和缺乏免疫原性，可作為解決難題的方案之一[68-69]。我們希望今后的研究能夠更好地了解使用外泌體的治療方法的益處和風(fēng)險，并找到克服目前面臨的挑戰(zhàn)的新方法。