鄭坤坤 胡亞暖 薄其濤 盧俊旭 楊彪炳

[摘要]目的：探究脂肪來源間充質干細胞（ADSCs）對快速擴張皮膚中反應攣縮的α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）表達的影響，以及對成纖維細胞向肌成纖維細胞轉化的影響。方法：選取健康新西蘭大白兔腎周脂肪，分離提純ADSCs并培養(yǎng)3代;建立兔擴張皮膚模型，在實驗組兔擴張皮膚下注射適量ADSCs懸液進行干預，對照組注射了等量的不含血清的DMEM，按照快速擴張要求擴張;手術下獲得兩組兔擴張后皮膚并固定;制作切片HE染色后統(tǒng)計皮膚厚度，進行免疫組化染色后觀察皮膚中s-SMA陽性率;將數據進行統(tǒng)計學分析得出結論。結果：經ADSCs干預的擴張兔皮膚與對照組相比，皮膚攣縮率更低，擴張皮膚的厚度較對照組厚，α-SMA陽性成纖維細胞率更低。結論：脂肪間充質干細胞可使擴張皮膚增厚，攣縮率降低，降低α-SMA表達，抑制肌成纖維細胞形成。ADSCs可協(xié)助提高皮瓣質量。

[關鍵詞]ADSCs;α-SMA;快速擴張術;HE染色;皮膚攣縮率;免疫組化

[中圖分類號]R329.2? ? [文獻標志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2019）02-0088-03

Abstract： Objective? ?To investigate the effects of adipose-derived mesenchymal stem cells （ADSCs） on the expression of α-SMA in the contracted skin and the effect of fibroblasts on myofibroblasts. Methods? The peri-renal fat of healthy New Zealand white rabbits was taken， and ADSCs were isolated and purified for 3 generations. The model of rabbit dilated skin was established. The rats in the experimental group were injected with appropriate amount of ADSCs suspension for intervention. The control group was injected with the same amount of serum-free. DMEM was expanded according to the requirement of simple rapid expansion; the skin of the two groups of rabbits was obtained and fixed under surgery; the skin thickness was counted after HE staining， and the positive rate of s-SMA in the skin was observed after immunohistochemical staining; The analysis concludes. Results? Compared with the control group， the expanded rabbit skin treated with ADSCs had a lower skin contracture rate. The thickness of the expanded skin was thicker than that of the control group， and the rate of α-SMA positive fibroblasts was lower. Conclusion? ?Adipose-derived mesenchymal stem cells can thicken the skin， reduce the contracture rate， decrease the expression of α-smooth muscle actin and inhibit the formation of myofibroblasts. ADSCs can help improve the quality of the flap.

Key words： ADSCs; α-SMA; skin soft tissue expansion; HE staining; skin contraction rate; immunohistochemistry

由于人體皮膚組織是有限的，當人體某一處或多處的皮膚因先天性因素或后天的損傷造成皮膚缺損的程度超過了其自行愈合能力時，即使經過了積極的內外科治療也會留下大片皮膚瘢痕或者缺損，為患者的日常生活帶來嚴重不便，甚至影響患者心理，帶來心理上的自卑等。皮膚軟組織的快速擴張技術是通過在皮膚下埋入擴張器，連續(xù)或簡短的注水增加對擴張器以外皮膚的壓力來獲取額外皮瓣的技術。ADSCs具有多向分化潛力[1-4]，其來源相當充足且增殖速度也很快，獲取脂肪組織時對機體的創(chuàng)傷性較小，ADSCs的多向分化能力也不會伴隨機體年齡的增大而下降。在本課題組的前提研究中發(fā)現ADSCs的局部移植能夠促進新生皮膚組織的再生，提高擴張皮膚質量，減少皮膚組織擴張速率，縮短擴張時間[5-7]。因此，ADSCs的局部注射確實能夠降低擴張皮膚的攣縮率，本實驗將對ADSCs降低擴張皮膚攣縮率做進一步研究。在病理改變中，成纖維細胞會轉換為肌成纖維細胞，特征性表達α-SMA，產生收縮力[8]。并且擴張的速度越快，α-SMA陽性表達率也會越高，皮瓣發(fā)生攣縮越加嚴重[9]。本研究在前提研究的基礎上，通過擴張皮膚局部注射同源ADSCs，探究ADSCs對擴張皮膚中α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）表達的影響，為脂肪間充質干細胞是否有效降低擴張皮膚攣縮率提高擴張皮膚質量提供更加充分的基礎依據。

1? 材料和方法

1.1 實驗動物與分組：實驗對象為新西蘭白兔20只（體健、月齡約3個月，重2.5kg左右;批號：scxk（魯）20160002，采購于濰坊醫(yī)學院動物中心）。亂數表法隨機分為兩組，每組10只，其中實驗組給予ADSCs處理，對照組給予無血清DMEM處理。

1.2 兔ADSCs的提取、培養(yǎng)及鑒定：成功麻醉后，將兔子以仰臥位固定于動物手術操作臺上，備皮消毒后，手術刀切開兔腹股溝區(qū)表層皮膚組織，逐層分開腹股溝取深部組織，取腎周脂肪組織。將取得的脂肪組織分離、提純、培養(yǎng)和傳代，用第3代ADSC通過鏡下觀察表面標志物鑒定和多向分化能力鑒定證實為ADSCs，備用。

1.3 兔皮膚快速擴張模型的建立：將完成分組的20只大白兔分別進行手術，用美藍標記出大白兔脊柱左側的大小為2cm×2cm的正方形區(qū)域作為埋入擴張器的部位，備皮消毒后，于標記區(qū)域的上邊界做一垂直于脊柱約2cm的切口，鈍性分離皮下組織到淺筋膜的深層至能容納擴張器。將完整的50ml圓形硅橡膠軟組織皮膚擴張器埋入皮下腔隙中，排盡皮膚與擴張囊間的空氣后嚴密地縫合切口。肌注抗生素以防感染，1周后拆除縫線。擴張器埋入1周后進行第1次注水擴張，實驗組采用已經制備好的ADSCs懸液1ml擴張皮下局部注射，而對照組局部擴張皮膚下則注入等量的無血清DMEM溶液以作對照，1h后進行注水擴張（注水時維持囊內壓力在40mmHg）。重復以上注水擴張過程，每48h注水1次，8次完成擴張。

1.4 兔擴張皮膚標本采集及石蠟切片制作：測量兔擴張后皮膚面積并記錄數值。對兔皮膚擴張?zhí)幊Ｒ?guī)消毒鋪巾，切去擴張皮膚，靜置5min后記錄擴張皮膚攣縮后面積。算出每個皮瓣的攣縮率[10]，固定保存后制成石蠟切片備用。

1.5 檢測皮膚厚度及α-平滑肌肌動蛋白表達：對來自兩組的每個實驗對象皮瓣標本所制成的切片隨機選取2張，分為兩組（每組每個實驗對象皮瓣切片1張，共20張），一組進行HE染色，鏡下測量表皮層的厚度;另一組進行α-SMA免疫組化染色，將每一張切片在放大了400倍的顯微鏡下隨機選取3個真皮層的觀察視野，總共60個視野，記錄每一個視野中的成纖維細胞數，根據胞漿中有無DAB染色的棕色顆粒區(qū)分陽性和陰性的細胞，計數呈陽性的細胞個數和總數目，兩者比值為陽性細胞率。

1.6 統(tǒng)計學分析：使用SPSS 20.0統(tǒng)計學軟件進行數據分析，本實驗主要采用獨立樣本t檢驗的方法進行分析，計量資料以（x?±s）表示，設置置信值在95%，當P<0.05結果具有統(tǒng)計意義。

2? 結果

2.1 ADSCs降低攣縮率：實驗組和對照組的擴張皮膚自兔背部取下后均產生了不同程度的攣縮，據統(tǒng)計結果實驗組的收縮率明顯小于對照組。見表1。

2.2 ADSCs干預可增加擴張皮膚表皮層厚度：經HE染色的擴張皮膚切片鏡下可見實驗組的表皮層厚度明顯高于對照組，總厚度也增加。見表2～3。

2.3 ADSCs干預使快速擴張皮膚的α-SMA表達減少：各組擴張皮膚組織切片經免疫組化染色后鏡檢可見目標蛋白被染為棕色顆粒，棕色顆粒的濃度實驗組少于對照組。實驗組α-SMA陽性成纖維細胞率與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義。見表4。

3? 討論

ADSCs是一種體積小、分化低的多功能干細胞。由于可以分離出ADSCs的脂肪組織十分豐富，獲取脂肪組織比較容易且對機體的損害小，獲取時也不會涉及到倫理方面的問題，還可以將自體的脂肪組織直接進行移植等優(yōu)點，吸引了科研工作者們的目光。

皮膚軟組織擴張技術指通過間斷性性或非間斷性增大皮下擴張器的體積，使擴張器對其表面被覆的皮膚產生的張力逐漸增大，從而擴大擴張器表面被覆的皮瓣面積產生額外皮膚的技術。廣泛應用于替代修復鄰近的瘢痕或其它的皮膚缺損和畸形等。為創(chuàng)傷性瘢痕、燒傷先天性及后天性缺損等的修復重建帶來了新的方法，彌補了傳統(tǒng)皮瓣移植“拆東墻補西墻”的不足，不僅在整形外科得到了廣泛的應用，也將會成為整個外科學里程碑式的進展。皮膚軟組織快速擴張術的提出縮短了擴張周期，但有研究發(fā)現快速擴張所得到的皮瓣攣縮率大于常規(guī)擴張所得到的皮瓣[11]。本實驗采用了快速擴張術制備動物模型，皮膚的快速擴張雖然縮短了擴張周期，但是對所得的皮瓣損傷較大，攣縮率較常規(guī)擴張術有所增加。

α-SMA即α-平滑肌肌動蛋白，原存在于肌細胞當中，是肌細胞收縮的主要動力來源，成纖維細胞因許多的病理性刺激產生具有收縮力的細胞結構，或者轉化為能收縮的肌成纖維細胞，可特異性的表達α-SMA[8，12]本實驗應用了α-SMA特異性，通過免疫組化染色擴張皮膚中的α-SMA，間接反應肌成纖維細胞的數量。因這種收縮力可導致皮瓣攣縮，所以α-SMA也對攣縮率具有一定的體現作用，并成正相關。本實驗通過測定α-SMA間接反映擴張皮瓣的攣縮情況。擴張刺激也屬于病理性刺激，而通過快速擴張法所得的皮瓣中α-SMA的表達情況明顯高于用常規(guī)方法取得的皮瓣，這可能是擴張速度越快皮瓣攣縮越嚴重[13]。因此本實驗應用快速擴張的方法制備兔皮膚擴張的模型，以研究ADSCs是否通過影響快速擴張皮膚模型中肌成纖維細胞的產生，從而為ADSCs能夠降低擴張皮膚攣縮率提供進一步的理論依據。實驗組（ADSCs組）中α-SMA的陽性表達率低于對照組。張琪等[13]的研究中，在瘢痕內注射ADSCs可以降低α-SMA而改善瘢痕中膠原纖維堆積并改善瘢痕增生。王喜燕等[9]的研究表明快速擴張法所得的皮瓣中α-SMA陽性表達明顯高于通過常規(guī)擴張方法所得到的皮瓣，因此他們認為α-SMA的增多可能是快速擴張加重攣縮所致。在本實驗研究結果中ADSCs的干預使快速擴張法得到的皮瓣中α-SMA的表達降低，因此可推斷ADSCs的介入可以抑制成纖維母細胞病理性地轉變成肌纖維母細胞。有研究表明ADSCs分泌的HGF能夠抑制肌成纖維細胞的生成[14-16]，為ADSCs降低擴張皮膚攣縮率提供了基礎依據。

綜上所述，ADSCs在快速擴張術中的應用不僅縮短了擴張周期，降低了長期攜帶擴張器對患者帶來的心理影響，而且對臨床上如何提高擴張皮膚的質量開辟了一條新的途徑。

[參考文獻]

[1]Sch?ffler A，Büchler C.Concise review：adipose tissue-derived stromal cells-basic and clinical implications for novel cell-based therapies[J].Stem cells，2007，25（4）：818-827.

[2]Hattori H，Sato M，Masuoka K，et al.Osteogenic potential of human adipose tissue-derived stromal cells as an alternative stem cell source[J].Cells Tissues Organs，2004，178（1）：2-12.

[3]Puissant N，Barreau C，Bourin P，et al.Immunomodulatory effect of human adipose tissue-derived adult stem cells：comparison with bone marrow mesenchymal stem cells[J].Br J Haematol，2005，129（1）：118-129.

[4]Strem BM，Hicok KC，Zhu M，et al.Multipotential differentiation of adipose tissue-derived stem cells[J].Keio J Med，2005，54（3）：132-141.

[5]張澤敏，姚永明，閻賀，等.脂肪間充質干細胞對兔擴張皮膚血管增殖影響的實驗研究[J].醫(yī)學研究生學報，2015，28（10）：1034-1037.

[6]張澤敏.脂肪間充質干細胞對兔皮膚軟組織擴張效率影響的實驗研究[D].濰坊：濰坊醫(yī)學院，2016.

[7]張澤敏，閻賀，姚永明，等.脂肪來源干細胞對擴張皮膚組織增殖的影響[J].中華實驗外科雜志，2016，33（5）：1424-1425.

[8]Tanaka J，Watanabe T，Nakamura N，et al.Morphological and biochemical analyses of contractile proteins（actin，myosin，caldesmon and tropomyosin）in normal and transformed cells[J].J Cell Sci，1993，104（2）：595-606.

[9]王喜梅，范志宏，劉凱，等.擴張兔皮膚肌動蛋白、肌球蛋白和α-平滑肌肌動蛋白的變化[J].鄭州大學學報（醫(yī)學版），2003，38（5）：706-709.

[10]Fabiocchi L，Semprini G，Cattin F，et al.‘Reverse expansion：A new technique of breast reconstruction with autologous tissue[J].J Plast，Reconstr Aesthet Surg，2017，70（11）：1537-1542.

[11]Machida BK，Liu-Shindo M，Sasaki GH，et al.Immediate versus chronic tissue expansion[J].Ann Plast Surg，1991，26（3）：227-231.

[12]Foo IT，Naylor IL，Timmons MJ.Intracellular actin as a marker for myofibroblasts in vitro[J].Lab Invest，1992，67（6）：727-733.

[13]張琪.脂肪干細胞對兔耳增生性瘢痕的抑制作用研究[D].上海：上海交通大學，2015.

[14]Moore KW，Malefyt RDW，Coffman RL，et al.Interleukin-10 and the interleukin-10 receptor[J].Ann Rev Immunol，2001，19（1）：683-765.

[15]Reitamo S，Remitz A，Tamai K.Interleukin-10 modulates type I collagen and matrix metalloprotease gene expression in cultured human skin fibroblasts[J].J Clin Invest，1994，94（6）：2489-2492.

[16]Kanemura H，Iimuro Y，Takeuchi M，et al.Hepatocyte growth factor gene transfer with naked plasmid DNA ameliorates dimethylnitrosamine-induced liver fibrosis in rats[J].Hepatol Res，2008，38（9）：930-939.