黃楨雅 陳俊男 賴琳英 周桂文 周云超 梁黎明 陳敏亮

[摘要]目的：探討在-80℃低溫條件下凍存不同時間的脂肪組織顆粒的結(jié)構(gòu)及生物學(xué)活性變化。方法：將吸脂后的脂肪經(jīng)過洗滌、離心后低溫保存，1周、4周、8周、12周、16周、20周、24周后，對復(fù)溫后的脂肪組織顆粒進行大體觀察、組織學(xué)觀察、活性檢測、SVF細胞培養(yǎng)等。結(jié)果：隨凍存時間的延長，脂肪組織的結(jié)構(gòu)及生物學(xué)活性逐步下降，凍存1周的脂肪組織活細胞面積（35.35±4.05）%較新鮮脂肪（79.25±7.44）%顯著減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），凍存1周的脂肪細胞較新鮮脂肪細胞線粒體活性顯著下降（P<0.01），SVF細胞培養(yǎng)，凍存脂肪來源的貼壁細胞數(shù)量較新鮮脂肪顯著減少（P<0.01），且細胞生長緩慢、狀態(tài)較差。結(jié)論：大多數(shù)脂肪細胞在一次冷凍保存過程中便失活，而凍存時間的延長與脂肪細胞活性降低的相關(guān)性并不明顯，不推薦臨床使用不添加保護劑直接凍存的脂肪進行移植。

[關(guān)鍵詞]脂肪組織;低溫保存;冷凍;脂肪移植;細胞形態(tài);細胞活力

[中圖分類號]R622? ? [文獻標(biāo)志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2019）02-0014-04

Abstract： Objective? The aim of this study was to observe the changes of histological structure and biological activity of adipose granules frozen at -80℃ for different time. Methods? The adipose tissue obtained by liposuction was stored at low temperature after washing and centrifugation. After 1 week， 4 weeks， 8 weeks， 12 weeks， 16 weeks， 20 weeks and 24 weeks， the granules of adipose tissue after rewarming were observed by gross observation， histological observation， activity detection， SVF cell culture and so on. Results? With the prolongation of freezing time， the histological structure and biological activity of fat gradually decreased. The area of living cells in adipose tissue frozen for 1 week （35.35±4.05）% was significantly lower than that of fresh adipose tissue （79.25±7.44）%， the difference was statistically significant（P<0.01）. The mitochondrial activity of adipocytes frozen for 1 week was significantly lower than that of fresh adipocytes （P<0.01）. In SVF cell culture， the number of adherent cells derived from cryopreserved fat was significantly lower than that of fresh fat （P<0.01）， and the cells grew slowly and in poor condition. Conclusion? Most adipocytes are inactivated during a single cryopreservation. There was no significant correlation between the prolongation of freezing time and the decrease of adipocyte activity. It is not recommended to transplant directly frozen fat without protective agent in clinic.

Key words： adipose tissue; cryopreservation; freezing; fat transplantation; cell morphology; cell viability

人自體脂肪組織顆粒是外科領(lǐng)域常用的軟組織填充材料，將其移植以治療軟組織凹陷的效果已得到醫(yī)生及患者的肯定。而目前無法一次治療就達到滿意效果的主要原因是脂肪的高吸收率，甚至可高達70%[1]。臨床上仍需要通過少量、多次的移植以達到最終治療效果。除此之外，脂肪組織中含有豐富的脂肪干細胞（Adipose derived stem or stromal cells，ADSCs），使其在再生醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用也日漸得到重視。故如何將脂肪組織體外有效地長期保存以備日后所需，是值得學(xué)者們研究的問題。根據(jù)以往的凍存脂肪相關(guān)研究[2-6]，確有不少有差異甚至矛盾的結(jié)果。本研究主要從凍存時長的角度切入，將人脂肪組織顆粒保存在-80℃環(huán)境中，凍存不同時間后觀察復(fù)溫后脂肪組織的生物學(xué)性狀改變，以期為凍存脂肪的進一步優(yōu)化及標(biāo)準(zhǔn)化提供相關(guān)理論參考和基礎(chǔ)性的實驗依據(jù)。

1? 材料和方法

1.1 臨床組織標(biāo)本

1.1.1 人自體脂肪組織顆粒臨床樣本來源：本實驗所用標(biāo)本均取自于中國人民解放軍總醫(yī)院第四醫(yī)學(xué)中心燒傷整形科，供者為進行吸脂術(shù)的健康成年女性，年齡24～38歲，取脂部位為腹部及大腿。實驗樣本的采集均經(jīng)過患者本人知情同意，并經(jīng)醫(yī)院機構(gòu)審查委員會批準(zhǔn)。

1.1.2 脂肪組織顆粒獲取與純化：供區(qū)腫脹麻醉后，使用側(cè)孔直徑1mm、針管直徑3mm的多側(cè)孔吸脂針，連接20ml注射器進行吸脂。使用林格氏液漂洗獲取脂肪組織顆粒，并剔除粗大纖維結(jié)締組織，垂直靜置分層后去除下層的腫脹液及血液混合物（此過程可重復(fù)操作多次）。之后于溫控離心機中以1 000r/min離心3min。棄掉上層的油脂及底層液體，保留中層脂肪組織。

1.2 試劑和儀器

1.2.1 試劑：HE染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司），Anti-Perilipin-1抗體（英國Abcam），山羊Anti-Rabbit IgG H&L（Alexa Fluor? 647）（英國Abcam），DAPI（北京索萊寶科技有限公司），Ⅰ型膠原酶（美國Gibico），胰蛋白酶（美國Invitrogen），PBS緩沖液，胎牛血清（美國Gibico），青鏈霉素（北京索萊寶科技有限公司），低糖DMEM培養(yǎng)液（美國Gibico），Cell Counting Kit-8（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）。

1.2.2 主要儀器：離心機，CO2培養(yǎng)箱（37℃，5%CO2），恒溫水浴箱，倒置顯微鏡，共聚焦顯微照相系統(tǒng)，普通家用冰箱，超低溫冰箱，切片機，超凈工作臺，酶聯(lián)免疫檢測儀。

1.3 方法

1.3.1 實驗分組：將純化后的脂肪組織顆粒，隨機分為8組。1組新鮮脂肪組織顆粒作為對照組，其余脂肪組織顆粒按凍存時長的不同分為1周組、4周組、8周組、12周組、16周組、20周組、24周組。

1.3.2 脂肪組織顆粒凍存與復(fù)蘇：①凍存：純化后的脂肪組織顆粒分裝于無菌離心管中，4℃平衡30min后，移入-20℃冰箱，4h后移入-80℃深低溫冰箱保存;②復(fù)蘇：取出凍存的脂肪，置于37℃水浴箱中快速震蕩復(fù)溫，靜置后去除上層油脂，獲得純脂肪組織顆粒。

1.3.3 組織學(xué)檢測：每組各取5份0.5ml復(fù)溫后的脂肪組織顆粒，用濾紙包裹后，經(jīng)過固定、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片等步驟，制作成石蠟切片。①HE染色：常規(guī)蘇木素伊紅染色，觀察脂肪細胞的細胞形態(tài);②免疫熒光染色：脂滴包被蛋白（Perilipin）是一種包被于脂滴表面的脂肪代謝相關(guān)蛋白，通過染色活脂肪細胞標(biāo)志蛋白Perilipin以評估脂肪細胞活力[7];使用一抗兔抗Perilipin和二抗Alexa Fluor 647標(biāo)記的山羊抗兔IgG染色Perilipin，抗熒光衰減封片劑（含DAPI）封片。

1.3.4 CCK-8法檢測細胞活力：取復(fù)溫后的脂肪組織顆粒置于離心管中，加入等體積含有0.1%Ⅰ型膠原酶的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS），放入37℃水浴箱中振蕩消化40min，終止消化后，將消化好的組織靜置5min，待其分層后吸取上層的脂肪細胞于新的離心管中，使用PBS洗滌細胞，再次靜置5min后，收集上層相對純凈的脂肪細胞，最后將脂肪細胞加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基中，調(diào)整細胞濃度，制備脂肪細胞懸液。以5 000個/孔的數(shù)量將脂肪細胞接種于96孔培養(yǎng)板，每孔體積200μl，培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)1h，之后向每孔加入20μl CCK-8溶液，繼續(xù)放置培養(yǎng)箱內(nèi)孵育，4h后取出，用酶聯(lián)免疫檢測儀測定在450nm處的吸光度（OD值）。

1.3.5 SVF細胞培養(yǎng)：取復(fù)溫后的脂肪組織顆粒，經(jīng)過膠原酶消化、過濾、離心等步驟后獲得基質(zhì)血管成分（stromal vascular fraction，SVF）[8]，之后將分離的SVF進行細胞培養(yǎng)，培養(yǎng)基每3d更換1次，原代培養(yǎng)14d后，觀察培養(yǎng)瓶貼壁細胞的形態(tài)，并計數(shù)[9]。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析：以SPSS 17.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x?±s）表示，采用單因素方差分析，SNK法進行兩兩比較的顯著性檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2? 結(jié)果

2.1 自體脂肪組織顆粒大體形態(tài)觀察：新鮮脂肪顆粒飽滿有光澤，無液化油脂;隨凍存時間的延長，復(fù)溫后的脂肪組織顆粒形態(tài)逐漸下降、液化油脂雜質(zhì)增多;凍存24周復(fù)溫的脂肪組織中可見大量液化油脂，且破損顆粒多，脂肪細胞破壞嚴(yán)重。

2.2 組織學(xué)檢測結(jié)果

2.2.1 不同凍存時間的脂肪組織顆粒的HE染色結(jié)果：新鮮脂肪組織顆粒的細胞形態(tài)良好，細胞膜及細胞間質(zhì)清晰完整，細胞核大小一致，胞內(nèi)脂滴溶解使細胞呈空泡樣，細胞之間排列規(guī)律、緊密;凍存1周的脂肪組織顆粒，脂肪細胞結(jié)構(gòu)較為清晰完整，光鏡下與新鮮脂肪形態(tài)上無明顯差異;凍存4、8、12、16、20、24周的脂肪組織顆粒，組織結(jié)構(gòu)隨凍存時間的延長越發(fā)紊亂，壞死結(jié)構(gòu)增多，細胞膜變形、破裂，細胞核模糊不清。

2.2.2 不同凍存時間脂肪組織顆粒的免疫熒光染色結(jié)果：通過對新鮮及復(fù)溫后的脂肪進行免疫熒光染色（脂肪：Perilipin、細胞核：DAPI），以評估脂肪細胞的活力。新鮮對照組中可觀察到Perilipin強烈表達的脂肪細胞，而凍存脂肪的Perilipin陽性細胞數(shù)目明顯減少，隨凍存凍存時間的延長，脂肪細胞活性逐漸降低。計算Perilipin陽性區(qū)域面積，顯示出：凍存1周的脂肪組織活細胞面積為（35.35±4.05）%較新鮮對照組（79.25±7.44）%顯著減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）;凍存4周的脂肪組織活細胞面積為（27.08±4.10）%較凍存1周的脂肪明顯減少（P<0.05），其余各組脂肪每相鄰兩組間活細胞面積無顯著性差異。

2.3 脂肪細胞線粒體活性檢測結(jié)果：CCK-8結(jié)果顯示，凍存1周的脂肪細胞較新鮮脂肪細胞活性顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）;凍存4周的脂肪細胞較凍存1周的脂肪細胞活性明顯下降（P<0.05），而其余各組脂肪每相鄰兩組間脂肪細胞線粒體活性無顯著性差異。

2.4 SVF細胞培養(yǎng)：取新鮮、凍存1周、凍存24周的脂肪組織經(jīng)過膠原酶消化、過濾、離心后獲得SVF，通過SVF細胞培養(yǎng)獲得貼壁細胞。新鮮脂肪來源的貼壁細胞數(shù)量多，細胞呈長梭形，形態(tài)完整均一，生長狀態(tài)良好，凍存脂肪來源的貼壁細胞數(shù)量顯著減少（P<0.01），凍存1周、凍存24周的脂肪組織獲得的貼壁細胞數(shù)量無顯著性差異;凍存培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)，細胞生長緩慢，形態(tài)非規(guī)則長梭形、多角，部分細胞呈羽狀樣并停止生長（紅色箭頭所示），這些細胞可能無活性或活性降低。

3? 討論

近年來，隨脂肪抽吸及移植技術(shù)的不斷優(yōu)化，自體脂肪移植在整形外科臨床治療中被廣泛應(yīng)用。人自體脂肪不僅可作為填充材料用于改善軟組織凹陷，其對面部年輕化、瘢痕等的治療效果也逐漸得到了臨床醫(yī)生的肯定[10-11]。無論是從造福患者還是節(jié)約醫(yī)療資源的角度考慮，將一次抽吸的脂肪組織體外保存以供后續(xù)之用，是患者和醫(yī)生共同的愿望和追求。

低溫凍存是目前保存器官、組織或細胞最值得信賴的方法。近二十年來，眾多學(xué)者為脂肪組織的低溫保存已進行了大量的工作，包括優(yōu)化脂肪組織的獲取、添加冷凍保護劑、尋找更適應(yīng)保存組織的溫度、控制降溫速率等，但目前并未形成一個完全標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一的冷凍保存方案[12-15]。由于研究中的不確定因素較多，不同的研究人員在不同實驗研究中得出了很多不甚相同的結(jié)果。在這樣冷凍脂肪臨床應(yīng)用的安全性得不到保證的情況下，有不少個人和私立機構(gòu)違規(guī)將脂肪組織直接保存于普通冰箱冷凍室，之后再度進行脂肪移植。這一不確定的治療行為可能給患者帶來了更大的術(shù)后并發(fā)癥發(fā)生風(fēng)險[16-17]。

本研究從臨床角度出發(fā)，將人脂肪組織顆粒洗滌、離心后，不添加任何冷凍保護劑，保存于深低溫冰箱（-80℃）中，凍存不同時間后觀察復(fù)溫后脂肪組織的細胞結(jié)構(gòu)、活力、代謝改變，為冷凍脂肪的進一步優(yōu)化以及標(biāo)準(zhǔn)化提供相關(guān)的基礎(chǔ)實驗依據(jù)。深低溫冰箱（-80℃）及液氮（-196℃）的較普通家用冰箱（-20℃）更利于組織保存[18]，但由于液氮維護困難、穩(wěn)定性較差不利于臨床應(yīng)用，故本實驗選用了-80℃作為保存脂肪組織的實驗條件。

從各項實驗研究結(jié)果來看，隨凍存時間的延長，脂肪組織的結(jié)構(gòu)及生物學(xué)活性逐步下降。在凍存早期（1、4周），盡管大體外觀和組織結(jié)構(gòu)較新鮮脂肪變化不明顯，但活脂肪細胞面積百分比及線粒體活性卻呈現(xiàn)顯著的下降趨勢。只冷凍保存1周的脂肪，獲得的貼壁細胞數(shù)量也顯著低于新鮮脂肪，且生長狀態(tài)較差。復(fù)合組織的冷凍過程是較單個細胞更為復(fù)雜的。在凍存早期，除細胞失水、胞內(nèi)冰晶形成外，胞外冰的形成、血管損傷破裂、復(fù)溫過程的熱應(yīng)力損傷對多細胞組織的低溫保存也產(chǎn)生了很大的影響[19]。而這些損傷大多發(fā)生在降溫、凍存早期及復(fù)溫過程中。則可以認(rèn)為，大多數(shù)脂肪細胞在一次冷凍保存過程中便失活，而凍存時間的延長與脂肪細胞活性降低的相關(guān)性并不明顯。冷凍復(fù)溫的脂肪組織可能更多是作為一種無活性或低活性的惰性材料植入體內(nèi)。

本實驗有一定的局限性，僅選擇了單一的保存溫度，且缺少相關(guān)的體內(nèi)實驗。將活性減低的凍存脂肪移植入體內(nèi)是否會增加相關(guān)移植并發(fā)癥的發(fā)生風(fēng)險，需更進一步的研究。但就本實驗結(jié)果而言，仍然不推薦臨床使用不添加保護劑直接凍存的脂肪。期待日后有更優(yōu)化的冷凍保存方法和革新技術(shù)，早日使冷凍脂肪廣泛應(yīng)用于臨床。

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