馬娟 周猛 俞小軍 孫雷軍 孫洪偉

(蘭州交通大學(xué)環(huán)境與市政工程學(xué)院，蘭州 730070)

氮磷是造成水體富營養(yǎng)化和環(huán)境污染的重要污染物質(zhì)，國際上將水體中總磷濃度高于0.02mg/L或者總氮濃度高于0.2mg/L時即視為富營養(yǎng)化水體。隨著我國水體營養(yǎng)化過程不斷加劇，人們對氮、磷污染愈加重視，制定排放標(biāo)準(zhǔn)也更加嚴(yán)格[1-2]。氮磷的去除過程比較復(fù)雜，需要涉及硝化、反硝化、吸磷和釋磷等多個生化過程，每一個過程都對微生物組成、基質(zhì)類型及周圍環(huán)境有不同的要求，任何一個要求得不到滿足，都會對去除效果產(chǎn)生嚴(yán)重影響[3]。

抗生素(antibiotics)是生物(微生物、植物和動物)在其生命活動過程中產(chǎn)生的，或由其他方法獲得的，能在低微濃度下有選擇地抑制或影響其他生物功能的有機(jī)物質(zhì)，主要應(yīng)用于人、植物和動物疾病的預(yù)防和治理。截至目前，世界上存在的抗生素有成千上萬種，根據(jù)其結(jié)構(gòu)分為四環(huán)素類、磺胺類、大環(huán)內(nèi)酯類、β-內(nèi)酰胺類、喹諾酮類、氨基糖苷類、碳青霉烯類、酰胺醇類等。近年來，抗生素在養(yǎng)殖業(yè)和醫(yī)療業(yè)的大量使用，使得自然界中抗生素含量中逐漸增加，加上大部分情況下基本不被生物體吸收，通過尿液和糞便以未改變和轉(zhuǎn)化的形式排出進(jìn)入水體中，給水環(huán)境的穩(wěn)定造成極大影響[4-5]。

高濃度抗生素對城鎮(zhèn)污水處理系統(tǒng)中氮磷處理微生物產(chǎn)生了嚴(yán)重抑制作用，導(dǎo)致微生物活性下降，給氮、磷達(dá)標(biāo)處理帶來極大挑戰(zhàn)[6]。本文綜述國內(nèi)外多年來抗生素對脫氮除磷系統(tǒng)影響的研究成果，將抗生素對脫氮除磷系統(tǒng)的影響因素進(jìn)行闡述，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步分析對脫氮除磷的抑制機(jī)理。

1 抗生素的作用機(jī)制

城鎮(zhèn)中的生活污水均經(jīng)過污水處理廠處理后排放至自然界中，生活中產(chǎn)生的氮磷及抗生素也隨污水匯集于污水處理廠內(nèi)進(jìn)行處理。經(jīng)調(diào)查，水廠中常見抗生素的種類、物化特性及作用機(jī)理如表1所示。不同種類抗生素濃度不盡相同，一般為ng/L～μg/L，在醫(yī)院和制藥公司廢水中可以達(dá)到mg/L級別，且一級處理中對抗生素去除效果十分有限，大部分進(jìn)入微生物系統(tǒng)中，給二級生物處理產(chǎn)生極大影響[7-10]。

抗生素的抑制機(jī)制可從作用菌種、作用性質(zhì)及抑制機(jī)理3個方面進(jìn)行分析。就作用菌種而言，根據(jù)革蘭染色法，將細(xì)菌分為革蘭陽性菌(G+)與革蘭陰性菌(G-)，不同抗生素作用菌種有所不同；按作用性質(zhì)，可將抗生素分為殺菌劑與抑菌劑，根據(jù)各自作用時間，又可分為速效殺菌劑(繁殖期殺菌劑)、緩效殺菌劑(靜止期殺菌劑)、速效抑菌劑與緩效抑菌劑，具體分類見表1。就抑制機(jī)理而言，主要表現(xiàn)在4個方面：①抑制細(xì)胞壁的合成；②破壞微生物的細(xì)胞膜；③抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成；④干擾核酸的形成；具體如表1所示。

表1 水體中常見抗生素的種類及作用機(jī)制[7,11-12]Tab. 1 Types and mechanism of common antibiotics in water

2 抗生素抑制效應(yīng)的影響因素

聚磷菌(PAOs)、氨化菌(AOB)、硝化菌(NOB)和反硝化菌是城鎮(zhèn)污水廠中去除氮磷的主要微生物，其活性、數(shù)量在氮磷處理中起著決定性作用，隨著研究深入，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)厭氧氨氧化菌(ANAMMOX菌)也是氮循環(huán)過程的重要參與者，并發(fā)展出短程反硝化新工藝?？股啬軌蛞种莆⑸锘钚?，在水中污染物分類中屬于有毒有害物質(zhì)，其對微生物活性的抑制程度可通過半數(shù)效應(yīng)濃度/半數(shù)抑制濃度(the half maximal effect/inhibitory concentration, EC50/IC50)體現(xiàn)出來。

EC50/IC50均是概念值，指在外在條件影響下，系統(tǒng)中污泥活性被抑制一半時的濃度，由于微生物數(shù)量繁多，不便統(tǒng)計，故通常通過其他指標(biāo)間接表達(dá)，如比呼吸速率sOUR(specific oxygen uptake rater)、比吸磷率sPUR(specific phosphorus uptake rate)、比釋磷率sPRR(the specific phosphorus release rate)、比亞硝化速率sAUR(the specific ammonium uptake rate)和比亞硝反硝化速率sNUR(the specific nitrite uptake rate)等比去除率或各種氮磷化合物的處理效率[13-14]。此外，還可通過觀察微生物胞外聚合物EPS(extracellular polymeric substances)中蛋白質(zhì)、多糖及DNA變化情形反映抗生素對微生物的影響效果。

計算具體抑制效果時，可通過Weibull方程將實驗中得到的濃度效應(yīng)數(shù)據(jù)代入進(jìn)行計算，然后用Orange軟件進(jìn)行模擬，Weibull方程如下：

式中：θ1是位置參數(shù)；θ2是斜率參數(shù)；x是抗生素的濃度(mol/L)；y是抑制百分率(%)。

通過對以上指標(biāo)的檢測，可發(fā)現(xiàn)抗生素對微生物抑制效應(yīng)的主要影響因素有抗生素濃度、種類、暴露時間及抗生素之間的混合作用4個方面。

2.1 抗生素濃度

對任何有毒有害物質(zhì)而言，濃度都是十分重要的影響因素。李娟英等[15]通過研究四環(huán)素類抗生素和磺胺類抗生素對硝化反應(yīng)的影響發(fā)現(xiàn)，隨著兩類抗生素濃度的增加，硝化速率迅速降低；Alighardashi等[16]的研究也表明，當(dāng)系統(tǒng)中的紅霉素濃度為5mg/L時，硝化過程就會受到抑制，濃度達(dá)到20mg/L時，會使污泥絮狀體分解，絲狀細(xì)菌破碎；趙美玲[17]研究磺胺甲惡唑?qū)?qiáng)化生物除磷系統(tǒng)的影響也得出相同結(jié)論，當(dāng)磺胺甲惡唑濃度為5μg/L時，磷去除率降至81%，當(dāng)濃度升為5mg/L時，磷去除率降至50%左右。因此，處理含有抗生素的污水時一定要注意進(jìn)水中抗生素的濃度。

除抑制作用外，經(jīng)過長期低濃度抗生素環(huán)境馴化的微生物還可使其對抗生素產(chǎn)生抗性，并同時具備分解水體中抗生素的能力。需要注意的是，馴化過程對抗生素也有一定濃度要求，只有抗生素濃度達(dá)到一定要求時才能起到馴化效果。如Fan等[18]在研究紅霉素對脫氮除磷系統(tǒng)影響時發(fā)現(xiàn)，活性污泥經(jīng)過含100μg/L紅霉素的污水馴化后可將濃度為10mg/L的紅霉素降解，但50μg/L濃度馴化時卻沒有這種效果。

2.2 抗生素種類

不同種類抗生素的構(gòu)造不同，作用機(jī)理及作用性質(zhì)不同，對微生物的抑制程度大小也不相同。

李娟英等[15]研究結(jié)果表明，在四環(huán)素類抗生素的影響下，硝化菌的EC50均在10mg/L以下，而在磺胺類抗生素影響時，硝化菌的EC50則在150mg/L以上；王靜等[19]通過研究磺胺類和四環(huán)素類抗生素對活性污泥酶性能的影響，也發(fā)現(xiàn)四環(huán)素類抗生素的EC50比磺胺類抗生素的EC50低一個數(shù)量級，說明四環(huán)素類抗生素對硝化速率的影響遠(yuǎn)大于磺胺類抗生素。胡哲太等[20]通過分析不同濃度的紅霉素與土霉素對EPBR系統(tǒng)的影響也發(fā)現(xiàn)，10mg/L的紅霉素能夠?qū)BPR系統(tǒng)形成明顯沖擊，而土霉素的濃度達(dá)到5mg/L時就能對系統(tǒng)形成同樣效果，說明四環(huán)素類抗生素毒性強(qiáng)于喹諾酮類抗生素。綜合國內(nèi)外部分研究，總結(jié)不同種類抗生素的EC50值如表2所示。

2.3 暴露時間

在污水處理過程中，抗生素的暴露時間等同于系統(tǒng)的水力停留時間，是系統(tǒng)穩(wěn)定運行的重要控制參數(shù)之一。徐菁等[22]研究金霉素對全程自養(yǎng)脫氮微生物影響時發(fā)現(xiàn)，進(jìn)水總氮濃度為180mg/L時，在暴露時間為2、4、8和12h的條件下，對全程自養(yǎng)脫氮功能微生物的半數(shù)抑制濃度IC50分別為870.79、498.24、324.47和278.91mg/L，這表明在同一條件下，金霉素對脫氮效果的抑制率隨著暴露時間的延長而上升。王靜[19]研究亦表明，同樣條件下，3種四環(huán)素類抗生素污染物和3種磺胺類抗生素污染物對微生物酶活性的2h培養(yǎng)時間的EC50高于24h培養(yǎng)時間的EC50，表明抗生素的生物抑制毒性具有累積效應(yīng)，隨培養(yǎng)時間的延長而加大。此外，Louvet等[23]采用熒光原位雜交技術(shù)在共聚焦掃描顯微鏡下細(xì)致觀察了紅霉素對硝化菌形態(tài)的影響，結(jié)果顯示在低濃度(4μg/L)時紅霉素具有一定的潛伏期，在最開始15h內(nèi)對硝化作用沒有任何影響，直到15h后才發(fā)現(xiàn)有絮體破裂，且隨著時間延長，絮體破裂越來越多；而隨著系統(tǒng)中紅霉素濃度提高，潛伏期越來越短。

表2 不同種類抗生素EC50值對比Tab. 2 Comparison of different types of antibiotics EC50

2.4 抗生素之間的聯(lián)合作用

根據(jù)不同種類有毒物質(zhì)聯(lián)合作用后對微生物的抑制效果，可分為協(xié)同作用與拮抗作用兩種情形。協(xié)同作用指兩種或兩種以上化學(xué)污染物聯(lián)用時效果大于它們單獨使用時的效果之和；拮抗作用指兩種或兩種以上化學(xué)污染物聯(lián)用時的效果不大于它們分別使用時的效果之和。

抗生素之間的聯(lián)合作用效果，取決于其作用機(jī)理與作用性質(zhì)，起決定性作用的是作用機(jī)理。如邵一如等[8]研究磺胺類與四環(huán)素類抗生素及四環(huán)素類與沙拉沙星聯(lián)合作用，就前者而言，四環(huán)素類作用性質(zhì)上為速效抑菌劑，磺胺類屬于緩效抑菌劑，四環(huán)素類作用機(jī)理為抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成，而磺胺類為干擾細(xì)菌的葉酸代謝，二者互不干擾，從而表現(xiàn)出協(xié)同作用。后者而言，沙拉沙星作用性質(zhì)為緩效殺菌劑，四環(huán)素類為緩效抑菌劑，沙拉沙星作用機(jī)理為抑制細(xì)菌DNA回旋酶，阻礙DNA合成，而四環(huán)素類抗生素在其作用之前已經(jīng)快速與受體結(jié)合抑制細(xì)菌的繁殖，使其不再合成DNA，阻礙沙拉沙星發(fā)揮作用，故二者表現(xiàn)出拮抗作用。由此可見，不同種類四環(huán)素共同作用結(jié)果為拮抗作用還是協(xié)同作用關(guān)鍵取決于作用機(jī)理與作用性質(zhì)，且作用機(jī)理影響比重大于作用性質(zhì)。

2.5 抗生素與重金屬的混合作用

重金屬作為某些酶的組成部分和某些酶的活化劑，參與微生物的氧化還原過程，少量重金屬對微生物成長是有益的；但重金屬濃度過大時，便會對微生物產(chǎn)生毒害作用。主要表現(xiàn)在以下4個方面：1)抑制生物大分子的形成，破壞核酸和蛋白質(zhì)的功能，導(dǎo)致微生物代謝紊亂；2)與蛋白質(zhì)分子里的硫基等官能團(tuán)結(jié)合，抑制酶的活性；3)破壞細(xì)胞體內(nèi)滲透壓平衡，破壞細(xì)胞體內(nèi)外物質(zhì)的運輸；4)改變脫氧核糖核酸的構(gòu)象，使其喪失功能。

研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)重金屬與抗生素混合后，多表現(xiàn)為協(xié)同作用；如戴勇等[24]用銅與土霉素混合研究對養(yǎng)殖廢水污泥影響時，發(fā)現(xiàn)土霉素濃度小于1.6mg/L對微生物呼吸的影響不大，表現(xiàn)先抑制后恢復(fù)，單因素銅對微生物代謝的抑制濃度為16mg/L，但銅與土霉素的聯(lián)合可以把銅對微生物代謝的抑制濃度降低至8mg/L；章洪濤[25]實驗中也發(fā)現(xiàn)抗生素與銅、鋅等金屬離子混合時會加強(qiáng)對微生物的抑制作用。此現(xiàn)象可能是因為重金屬以下兩個特性：①重金屬能夠加強(qiáng)微生物絮體的結(jié)合性，不易破碎；②重金屬離子和抗生素具有很好的配位性，使二者很好結(jié)合在一起。如此，強(qiáng)結(jié)構(gòu)性的微生物絮體在沉淀網(wǎng)捕機(jī)理下能夠吸附水體中更多的金屬離子和抗生素；另一方面，已經(jīng)被吸附的金屬離子和抗生素亦能夠通過配位吸附水體中其他的金屬離子或抗生素，增加去除率的同時也使其具有更強(qiáng)的抑制效應(yīng)[26]。

2.6 其他影響因素

除以上5個主要影響因素外，運行工況及水環(huán)境的變化也對抗生素的抑制效率有一定影響。Henriques等[27]在研究正辛醇、鎘等有毒化學(xué)物質(zhì)對EPS的影響時發(fā)現(xiàn)，機(jī)械攪拌時對EPS的破壞比沒有機(jī)械攪拌時嚴(yán)重得多。Louvet等[28]的研究10mg/L紅霉素對硝化作用的影響，污泥分別取自法國南部的Epinal污水廠和Nancy污水廠，實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，紅霉素對Nancy污水廠污泥硝化的抑制效率為40%，而Epinal污水廠污泥的消化速率相較對照組反而提高了12%；此種現(xiàn)象是因為污泥來源不同，進(jìn)一步講，則是因兩個污水廠的進(jìn)水水質(zhì)及運行工況有所差異。

綜上，對抗生素抑制效應(yīng)產(chǎn)生影響的因素可分為運行工況及進(jìn)水水質(zhì)兩大類，其中與運行工況相關(guān)的有機(jī)械攪拌、水力停留時間、底物種類及濃度等，與進(jìn)水水質(zhì)相關(guān)的因素有抗生素濃度、種類及其他有毒有害物質(zhì)等。

3 抑制機(jī)理的探討

抗生素對脫氮除磷影響機(jī)理可從抗生素的作用機(jī)制及脫氮除磷過程中功能菌的影響兩個方面進(jìn)行分析。

如表1所示，不同種類抗生素的作用機(jī)制可從作用菌種、作用原理及作用性質(zhì)3個方面進(jìn)行分析。首先，就作用菌種而言，經(jīng)分離鑒定發(fā)現(xiàn)，脫氮除磷系統(tǒng)中氨氧化菌群、硝化菌群、反硝化菌群及聚磷菌群中起脫氮除磷效果的菌種均屬于革蘭陰性菌[29-30]，因而表2中磺胺類、四環(huán)素類抗生素對NOB的抑制程度強(qiáng)于大環(huán)內(nèi)酯類、青霉素類。其次，就作用原理而言，不同抗生素作用部位不同，因而作用機(jī)理有所差異，具體如圖1所示。β-內(nèi)酰胺類抗生素主要作用于有細(xì)胞壁的生物，若作用對象沒有細(xì)胞壁，則不會產(chǎn)生影響，作用對象具有選擇性。故表2中青霉素G對亞硝化單細(xì)胞菌抑制效果最小，對月牙藻的抑制效果最強(qiáng)；此外，同一種抗生素可能具有雙重作用機(jī)理，Stepanek等[31]研究非典型四環(huán)素配位諾卡菌素對枯草芽孢桿菌影響發(fā)現(xiàn)，低濃度(3μg/L)諾卡菌素作用機(jī)理和四環(huán)素一樣主要對蛋白質(zhì)生物合成酶產(chǎn)生抑制，而高濃度(30μg/L)時，會以細(xì)胞膜為主要攻擊目標(biāo)，使細(xì)胞膜去極化。最后，就作用性質(zhì)而言，速效抗生素要強(qiáng)于緩效抗生素，因此表2中四環(huán)素對NOB的抑制效果強(qiáng)于磺胺類，而殺菌劑與抑菌劑因作用原理不同無法得出準(zhǔn)確結(jié)論。

圖1 不同種類抗生素的作用原理Fig. 1 The principle of different types of antibiotics

脫氮除磷功能菌影響方面，抗生素對脫氮除磷的抑制機(jī)理主要取決于每種微生物對抗生素的耐受程度。氮磷去除是一個復(fù)雜過程，需經(jīng)歷多個過程及多種微生物參與，不同抗生素影響下微生物的耐受性不同。徐菁等[23]研究金霉素對全程自養(yǎng)脫氮微生物的抑制時發(fā)現(xiàn)，在系統(tǒng)受到強(qiáng)烈抑制條件下，AOB可以逐漸恢復(fù)活性，但ANAMMOX菌的活性沒有恢復(fù)，表明AOB比ANAMMOX菌有更強(qiáng)的耐受性。Alvarino等[32]研究撲熱息痛和多西環(huán)素對短程反硝化除磷的抑制作用，結(jié)果證明同等條件下，短程反硝化系統(tǒng)中3種脫氮微生物的抗抑制能力依次為：反硝化菌、亞硝化菌以及厭氧氨氧化菌。此外，該實驗通過對比處理不同氮濃度污泥對抗生素的耐受性發(fā)現(xiàn)，處理低濃度氮污泥的耐受性要強(qiáng)于處理高濃度氮的污泥。

除磷方面，胡哲太等[33]分析了紅霉素與土霉素對EPBR系統(tǒng)的影響，通過對比實驗中厭氧釋磷和好氧吸磷階段活性污泥胞外聚合物中PN合成量及比耗氧速率發(fā)現(xiàn)，在整個除磷過程中好氧吸磷比厭氧釋磷更易受到抑制，其他科學(xué)家研究游離氨(FA)、Ag+及Cr(Ⅳ)等有毒有害物質(zhì)對除磷過程的影響時也得出相同結(jié)論[34-36]，這可能是因為好氧階段發(fā)揮吸磷作用的酶更容易受到抑制。但Katsou等[13]研究四環(huán)素、多西環(huán)素及阿莫西林對聚磷菌除磷過程的影響時卻出現(xiàn)了不同結(jié)果，相同濃度、相同條件下多西環(huán)素對好氧吸磷的抑制強(qiáng)于對厭氧釋磷的抑制，但四環(huán)素及阿莫西林卻與之相反。不同種類抗生素作用機(jī)制及外在環(huán)境不同，因而其對微生物的影響程度并不絕對一致，這或許是出現(xiàn)不同實驗結(jié)果的原因。因此，抗生素對聚磷菌微生物的抑制方式仍需進(jìn)一步分析。

研究抗生素對脫氮除磷功能菌抑制作用的同時，也應(yīng)考慮其抑制作用的有利部分，如金霉素對NOB的抑制作用大于AOB，造成亞硝態(tài)氮累積[37]，或可利用此特性達(dá)到短程脫氮或短程反硝化除磷目的。此外，抗生素長時間存在于水環(huán)境中，除了對微生物活性的抑制外，還會誘導(dǎo)產(chǎn)生耐藥菌群和抗性基因(antibiotic resistance genes, ARGs)。ARGs在菌群間轉(zhuǎn)移、傳播，使得受影響菌群耐受性更強(qiáng)，比抗生素殘留對環(huán)境的影響及危害更大[38]，應(yīng)予以關(guān)注。

4 展望

目前，抗生素對活性污泥微生物活性抑制作用的研究通常有兩種思路：一種基于污水廠進(jìn)水中長期存在一定濃度的抗生素，探究長期低濃度抗生素的抑制作用及對微生物種類及種群數(shù)量變化的影響；另一種是基于污水處理廠中可能出現(xiàn)的由于管理不善或外界進(jìn)水中抗生素濃度突然提高所導(dǎo)致的短期內(nèi)突發(fā)性的高濃度抗生素，探究短期高濃度抗生素對各個處理系統(tǒng)的沖擊作用。這些年盡管與抗生素有關(guān)的研究進(jìn)展很快，也取得諸多成果，但仍有些許缺失。

①關(guān)于抗生素對微生物活性抑制機(jī)理的研究較少且不夠深入，對硝化菌、聚磷菌等功能性微生物的抑制機(jī)理研究更是匱乏，使得對抗生素抑制機(jī)理的認(rèn)識不足，有必要加強(qiáng)這些方面的研究；②關(guān)于一種抗生素對微生物活性的抑制效應(yīng)做了大量研究，但鮮有關(guān)于抗生素互相之間、抗生素與水體中其他有毒有害物質(zhì)(如游離氨、游離亞硝酸、重金屬離子、抗生素外的有機(jī)毒物等)的復(fù)合抑制效應(yīng)的報道，應(yīng)對其進(jìn)行深入研究；③研究抗生素長時間存在水體環(huán)境誘導(dǎo)產(chǎn)生的耐藥菌群或ARGs在水體中繁殖、傳播對脫氮除磷過程的影響；④利用抗生素對不同類型微生物的抑制作用程度不同，加以引導(dǎo)以優(yōu)化污水處理工藝。