滕云 徐美冬 朱進(jìn)偉 鄭玲輝, 應(yīng)雪肖 白驊,

(1 浙江省抗真菌藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江海正藥業(yè)股份有限公司，臺(tái)州 318000；2 浙江海正藥業(yè)(杭州)股份有限公司，杭州 311404)

米爾貝霉素(milbemycin)于1967年由日本Sankyo公司的青木(Aoki)等[1]從吸水鏈霉菌S. hygroscopicussubsp.aureolacrimosus的發(fā)酵液中發(fā)現(xiàn)，其結(jié)構(gòu)屬十六元大環(huán)內(nèi)酯類化合物。米爾貝霉素是微生物天然產(chǎn)物農(nóng)藥，已有數(shù)據(jù)表明它是當(dāng)今世界上最優(yōu)良的殺螨劑之一。美國環(huán)保署認(rèn)定其為低危險(xiǎn)性殺蟲劑，荷蘭批準(zhǔn)其為“GNO”(作物生產(chǎn)中的天然產(chǎn)物)。它屬生態(tài)友好型農(nóng)藥，適用于有機(jī)農(nóng)業(yè)病蟲害的綜合防治，在發(fā)達(dá)國家已成為一種受歡迎的殺蟲殺螨劑[2-3]。1983年，米爾貝霉素(milbemycin)A3和A4組分的混合物(A3:A4=3:7，如圖1所示)被批準(zhǔn)上市。現(xiàn)在，1%的米爾貝霉素乳油已經(jīng)在多個(gè)國家用于果蔬、家庭觀賞植物蟲害的防治[4]。

圖1 米爾貝霉素化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig. 1 Structure of milbemycin

由于最終產(chǎn)品對(duì)A3/A4的比例(3:7)有著嚴(yán)格的要求。米爾貝霉素的生產(chǎn)技術(shù)一直被日本三共和美國默克等企業(yè)所控制，而一般的菌種很難滿足這一比例，需要通過提取工藝優(yōu)化來解決比例問題，從而導(dǎo)致提取收率偏低，生產(chǎn)成本過高。米爾貝霉素A3/A4在結(jié)構(gòu)上非常相似，在藥效和穩(wěn)定性上A3優(yōu)于A4還是A4優(yōu)于A3目前并沒有文獻(xiàn)報(bào)道，但從已有文獻(xiàn)上看，米爾貝霉素A3/A4在代謝過程中的確存在一定的差異[5-6]。如果能夠?qū)崿F(xiàn)A3，A4單一組分的生產(chǎn)，且進(jìn)一步提高發(fā)酵單位，降低成本，則可以避開多組分產(chǎn)品的市場限制，推動(dòng)該類產(chǎn)品在國內(nèi)的使用。

本研究根據(jù)米爾貝霉素生物合成途徑的特點(diǎn)[7-8]，設(shè)計(jì)了不同的篩選策略，結(jié)合各種物理化學(xué)誘變方法，分別篩選得到A3比例大于70%，A4比例大于80%的生產(chǎn)菌種。通過培養(yǎng)條件的進(jìn)一步優(yōu)化，A3單一組分菌種發(fā)酵單位超過2000mg/L，A4單一組分菌種發(fā)酵單位超過3000mg/L，遠(yuǎn)高于文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)的1200-1400mg/L的單位[9-10]，可為米爾貝霉素的產(chǎn)業(yè)化提供優(yōu)良的菌株。

1 儀器與材料

LC-20A型高效液相色譜儀(日本Shimadzu公司)；ARTP-II型常壓室溫等離子體(ARTP)微生物誘變系統(tǒng)(北京思清源生物科技有限公司)；50L發(fā)酵罐(上海國強(qiáng)生化工程裝備有限公司)。1和2對(duì)照品(按文獻(xiàn)方法制備并標(biāo)定[11]，純度98%)：甲醇、乙腈為分析純，水為去離子水。

S. milbemycinicusCGMCC7677由本公司實(shí)驗(yàn)室保藏。菌種經(jīng)過本實(shí)驗(yàn)室自然分離篩選，初始1的搖瓶發(fā)酵效價(jià)為789mg/L，2的效價(jià)為267mg/L。

斜面/平板孢子培養(yǎng)基(g/L)：酵母抽提物2，麥芽抽提物2，蔗糖10，脫脂奶粉1.2，瓊脂20，消前pH7.0～7.2。

種子培養(yǎng)基(g/L)：酵母抽提物5，蛋白胨5，蔗糖20，脫脂奶粉3，磷酸氫二鉀0.8，消前pH6.8～7.2，搖瓶裝液量為250mL，三角瓶裝30mL。

發(fā)酵培養(yǎng)基[10](g/L)：蔗糖120，黃豆餅粉20，酵母抽提粉5，肉胨5，K2HPO40.5，MgSO4·7H2O 0.5，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.05，CaCO33； pH7.0～7.2。

2 方法

2.1 培養(yǎng)條件

將CGMCC7677菌株接種到斜面/平板孢子培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)12d。在已生長完好的試管斜面中加入含有0.01%吐溫80的無菌水洗下，然后轉(zhuǎn)移至加有玻璃珠的三角搖瓶中，振蕩器上振蕩20min。移取所得菌懸液1.5mL，轉(zhuǎn)接到裝液量為20mL的250mL種子瓶中，28℃條件下培養(yǎng)3d；然后以10%的接種量接種于裝液量為25mL的250mL搖瓶中，28℃，250r/min培養(yǎng)10d。

2.2 HPLC分析方法

取發(fā)酵液0.5mL，加入4.5mL 75%乙醇，混合均勻，3000r/min、離心15min，取上層液用HPLC法測(cè)定。

色譜條件：色譜柱Zorbex RX-C8柱(150mm×4.6mm,5μm)；流動(dòng)相條件見參考文文獻(xiàn)[10]。

檢測(cè)波長，240nm，柱溫30℃，進(jìn)樣量10μL。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度計(jì)算發(fā)酵液中1和2的含量。

2.3 誘變與處理方法

NTG(亞硝基胍)誘變處理：稱取NTG晶體10mg，溶解在10mL無菌Tris緩沖液(pH8.0)中，再加入1mL菌懸液，置于28℃培養(yǎng)基中旋轉(zhuǎn)式或往復(fù)式搖床上振蕩處理30min。將處理過的菌懸液經(jīng)適當(dāng)稀釋涂布于斜面/平板孢子培養(yǎng)基平板上。未作誘變處理的菌懸液亦經(jīng)適當(dāng)稀釋涂布于斜面/平板孢子培養(yǎng)基平板作為對(duì)照。28℃培養(yǎng)10d后，檢查菌落數(shù)，并計(jì)算致死率。

UV(紫外)誘變處理：取10-1或10-2梯度的單細(xì)胞菌懸液5～10mL到帶一根回形針的平板內(nèi)(直徑9cm)，置于UV誘箱內(nèi)，置磁力攪拌器上，開蓋于UV15W，30cm處照射數(shù)分鐘(一般2～5min)，邊照邊攪拌，照后用黑布包好，然后用生理鹽水(0.9%氯化鈉溶液)稀釋10-2～10-7，分別涂斜面/平板孢子培養(yǎng)基平板得誘變組。EMS(甲基磺酸乙酯)誘變處理：吸取1mL EMS溶于2mL無水乙醇中，再加入22mL，pH7.2的0.1mol/L磷酸緩沖液，配制成4.0%EMS溶液。取10-1或10-2梯度的單細(xì)胞菌懸液5mL到帶一根回形針的平板內(nèi)，加入4.0%EMS溶液5mL，最后EMS溶液濃度為2.0%。置磁力攪拌器上，攪拌處理20～60min。誘變平皿內(nèi)加入10mL 5%的硫代硫酸鈉即可中止反應(yīng)，用生理鹽水依次稀釋10-2～10-7，涂斜面/平板孢子培養(yǎng)基平板得誘變組。

ARTP(常壓室溫等離子體)誘變：發(fā)生氣(氦氣)流量12.5L/min；發(fā)射口與盛樣品鐵片間距離2mm；照射功率100W，照射時(shí)間0、5、10、20、30、60和90s。照射完畢后將菌懸液連同鐵片置于液體培養(yǎng)基中，振蕩數(shù)秒后吸取適量液體培養(yǎng)基，涂斜面/平板孢子培養(yǎng)基平板。培養(yǎng)溫度28℃，培養(yǎng)周期12d。

3 結(jié)果與討論

3.1 米爾貝霉素主組分菌株的理性選育

傳統(tǒng)的的菌種選育是采用各種“2.3”項(xiàng)中的誘變手段進(jìn)行單個(gè)或者復(fù)合誘變，通過自然分離后獲得突變株，這種方法有非常大的隨機(jī)性。為了提高選育效率，研究者往往會(huì)在篩選過程中增加一個(gè)篩子，以篩選期望獲得的菌株。單一組分的菌種篩選也是如此，比如夏煥章等[12]在篩選妥布霉素單組份生產(chǎn)菌種的過程中利用妥布霉素和安普霉素的不同微生物抗性設(shè)計(jì)了雙層平板，最終篩選出了妥布霉素單組分菌種。

本研究根據(jù)米爾貝霉素的生物合成途徑以及1和2的不同合成途徑，設(shè)計(jì)了多個(gè)篩選的模型，分別是甘氨酸抗性、3-溴丙酮酸抗性、乙酸鈉抗性、rifampicin抗性，篩選途徑見圖2。

米爾貝霉素的生物合成是丙酸基、乙基以及其他一些結(jié)構(gòu)基團(tuán)通過聚酮合酶(polyketidesynthase，PKS)途徑合成而來[2]。因此，采用利福平抗性平板篩選得到的菌株發(fā)酵單位提高了30%，乙酸鈉抗性篩選也有較好的結(jié)果。在各種物理化學(xué)誘變方式中，ARTP是一種較新的誘變處理方式，在各種微生物選育上都取得了不錯(cuò)的效果[13-15]。本研究過程中發(fā)現(xiàn)，米爾貝霉素的生產(chǎn)菌所產(chǎn)生的孢子對(duì)ARTP具有一定的耐受性，需要輻照2min以上才能達(dá)到90%以上的致死率。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，在其他物理化學(xué)誘變方法效果不顯著時(shí)，ARTP誘變處理會(huì)獲得意想不到的效果。本研究僅僅經(jīng)過一輪ARTP誘變就獲得了發(fā)酵單位提高15%的菌種。通過各種誘變手段和篩選方法的組合，雖然沒有獲得A3，A4組分差異特別顯著的菌株，但進(jìn)行到54-30號(hào)菌種后，發(fā)酵單位已經(jīng)較出發(fā)菌提高了近3倍，達(dá)到了3000mg/L。當(dāng)對(duì)54-30號(hào)菌株進(jìn)行紫外誘變，并采用3-溴丙酮酸作為抗性篩選后，在平板上發(fā)現(xiàn)了兩種形態(tài)有較大差別的菌落，見圖3。

圖2 米爾貝霉素生產(chǎn)菌CGMCC7677選育譜系圖Fig. 2 Mutation process for the Milbemycin producing strain CGMCC7677

從圖3中可以發(fā)現(xiàn)，誘變的菌種與出發(fā)菌相比在形態(tài)上已經(jīng)發(fā)生了較大的變化，突變株在菌落表面基本上不分泌色素。通過3-溴丙酮酸抗性篩選得到的兩種不同形態(tài)的菌落，從菌落正面觀察，兩株菌在菌落中心的形態(tài)上稍有差異，但在菌落背面上有較大的差異。一種菌落背面有明顯的色素產(chǎn)生(通常情況下)，一種菌落則基本上不產(chǎn)色素。將兩種菌落在搖瓶上進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示產(chǎn)色素的菌落1:2的比例大于4:1，也就是1的含量超過了80%。不產(chǎn)色素的菌落1:2的比例小于3:7，也就是2的含量超過了70%。3-溴丙酮酸是一種可用于治療腫瘤的藥物，其主要作用是影響細(xì)胞的葡萄糖代謝途徑[16-17]。通常情況下采用該物質(zhì)作為抗性篩選底物的目的是為了篩選得到葡萄糖代謝途徑發(fā)生變化的菌株。通過該抗性能夠篩選得到2含量的菌種最大的可能是突變株的糖代謝途徑發(fā)生改變后也影響到了次級(jí)代謝途徑的變化，進(jìn)而獲得了2可以大量積累的突變株。在接下來的篩選中發(fā)現(xiàn)，2高產(chǎn)的突變株性狀非常的不穩(wěn)定，很容易產(chǎn)生回復(fù)突變，回復(fù)突變株基本上沒有發(fā)酵單位。

圖3 選育過程中形成的兩種形態(tài)突變株Fig. 3 Morphology mutant during the strain selection

對(duì)兩種形態(tài)突變的菌株，進(jìn)一步進(jìn)行誘變篩選，經(jīng)多輪分離純化后，最終得到了兩株高產(chǎn)菌75-22和95-23。其中75-22菌株在搖瓶中1的單位達(dá)到了3500mg/L以上，1的含量達(dá)80%以上，見圖4；95-23菌種在搖瓶中2的單位達(dá)到了3000mg/L，2的含量達(dá)70%以上，見圖5。

3.2 高產(chǎn)菌株發(fā)酵工藝研究

使用突變菌株75-22和95-23在原有發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下進(jìn)行50L罐的發(fā)酵培養(yǎng)，考察突變株的生長代謝情況和合成1和2的能力。

圖4 75-22菌株搖瓶發(fā)酵檢測(cè)結(jié)果(12d)Fig. 4 HPLC graph for the strain 75-22 in shake-flask (12d)

圖5 95-23菌株搖瓶發(fā)酵檢測(cè)結(jié)果(12d)Fig. 5 HPLC graph for the strain 95-23 in shake-flask (12d)

突變株75-22在50L發(fā)酵罐的生長代謝曲線見圖6。與原始菌相同，突變株仍然選擇蔗糖作為碳源，12%的蔗糖會(huì)在發(fā)酵的96h內(nèi)被完全水解為葡糖糖和果糖，然后再被細(xì)胞所利用。糖的消耗速度顯示，果糖的消耗速度要快于葡萄糖。1和2的生物合成與糖代謝有著密切的聯(lián)系，本研究曾經(jīng)嘗試用葡萄糖和果糖的組合來代替蔗糖，結(jié)果發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物的合成受到嚴(yán)重的影響。結(jié)合蔗糖水解曲線和1、2的合成曲線，可以發(fā)現(xiàn)當(dāng)蔗糖被完全水解后，產(chǎn)物開始快速合成。這一現(xiàn)象表明，蔗糖及其相關(guān)酶系在米爾貝霉素的生物合成過程中起到了很重要的作用，值得進(jìn)一步研究。

整個(gè)發(fā)酵過程維持通氣量1000L/h，通過改變攪拌速度控制溶氧大于30%。本發(fā)酵過程對(duì)氧氣的需求并不是特別高，在蔗糖水解速度最快的初始階段攪拌維持在相對(duì)較高的水平，溶氧也快速下降。此后攪拌一直維持在較穩(wěn)定的水平，細(xì)胞進(jìn)入次級(jí)代謝，對(duì)氧的需求量降低。米爾貝霉素的合成在整個(gè)發(fā)酵過程中都比較平穩(wěn)，只是在300h后，隨著葡萄糖和蔗糖的耗盡，合成速率有所下降。360h后由于碳源耗盡，pH回升，1的發(fā)酵效價(jià)達(dá)到3900mg/L，比例達(dá)到80%以上。

圖6 突變株75-22在50L發(fā)酵罐中的代謝曲線Fig. 6 Fermentation curve for the mutant strain 75-22 in 50L fermentor

圖7 突變株95-23在50L發(fā)酵罐中的代謝曲線Fig. 7 Fermentation curve for the mutant strain 95-23 in 50L fermentor

突變株95-23在50L發(fā)酵罐的生長代謝曲線見圖7。與75-22相比，95-23菌株在50L發(fā)酵罐上的生長速度較慢，這與選育過程中的現(xiàn)象一致。由于生長速度偏慢，對(duì)蔗糖的水解速度也稍偏慢，但葡萄糖代謝和果糖代謝速度要快于75-22。該菌種對(duì)溶氧的要求也不高，在1000L/h的空氣流量下，攪拌轉(zhuǎn)速?zèng)]有超過250r/min。48h后攪拌轉(zhuǎn)速即開始下降，細(xì)胞進(jìn)入次級(jí)代謝，米爾貝霉素開始合成，290h后碳源耗盡，pH回升，最終2的發(fā)酵效價(jià)達(dá)到2900mg/L，比例達(dá)到70%以上。

3.3 結(jié)論與展望

通過對(duì)出發(fā)菌種CGMCC7677進(jìn)行多輪和多種誘變方式的處理，結(jié)合各種抗性篩選：甘氨酸抗性，利福平抗性，乙酸鈉抗性等，1和2的發(fā)酵單位得到了顯著提高。在添加3-溴丙酮酸作為抗性的篩選平板上，得到了兩種形態(tài)完全不同的突變株，經(jīng)過進(jìn)一步分離純化，分別得到突變株75-22和95-23。搖瓶和發(fā)酵罐的代謝數(shù)據(jù)表明，75-22發(fā)酵產(chǎn)1的能力提高4倍，1和2之間的比例也由3:7提高至小于2:8；95-23發(fā)酵產(chǎn)2的能力則提高了近10倍，1和2之間的比例有3:7變化為大于7:3。這兩株突變株的獲得，為米爾貝霉素單一組分的生產(chǎn)和開發(fā)提供了可能，發(fā)酵單位的提高，超出了轉(zhuǎn)向產(chǎn)業(yè)化的要求。但由于1和2的結(jié)構(gòu)非常相似，若要獲得單一的1和2的產(chǎn)品，還需要下游提取工藝犧牲一定的收率。今后可進(jìn)一步對(duì)現(xiàn)有菌種進(jìn)行選育，或者通過培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的優(yōu)化，繼續(xù)提高1和2在發(fā)酵液中的含量比例，形成更有利于工業(yè)化生產(chǎn)成本控制的目的。