茍立平，鄧 星，羅莉婭，湯明海，萬 麗

1成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，成都 611137；2四川大學(xué)華西醫(yī)院腫瘤生物治療研究室，成都 610041

胡椒堿(Piperine,Pip)為本實(shí)驗(yàn)室從胡椒科植物胡椒(PipernigrumL.)的干燥成熟果實(shí)中提取、分離、純化獲得的吡咯烷類酰胺生物堿，純度大于99%。Pip是胡椒發(fā)揮藥效作用的主要成分之一,藥理作用較為廣泛，已知具有抗驚厥[1]、抗炎[2]、抑制膽結(jié)石[3]、抗?jié)僛4]等作用。近年來的研究表明，Pip具有抗癌活性[5-8]。由于其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單(見圖1)，有利于對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾,且具備藥效基團(tuán)的化學(xué)結(jié)構(gòu)特征，如具有氫鍵接受體、疏水中心和芳環(huán)中心等可與受體結(jié)合的特征性單元。因此，其本身不僅可作為一種新藥進(jìn)行研發(fā)，而且化學(xué)研究空間為進(jìn)一步化學(xué)合成研究獲得高活性低毒性先導(dǎo)化合物奠定了基礎(chǔ)[9]。

圖1 胡椒堿化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structure of Piperine

體外代謝研究相比之下可直接觀察候選化合物與受試靶點(diǎn)的選擇性作用,不需要消耗大量的樣品和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,操作簡(jiǎn)便快捷，且能指導(dǎo)后期藥效、藥動(dòng)以及安全性評(píng)價(jià)的模型選擇，縮小體內(nèi)研究的篩選范圍，節(jié)約研發(fā)成本[10]。為全面了解Pip在不同種屬中的代謝特性，為后續(xù)研究提供支撐，本課題研究了Pip在不同種屬肝微粒體中的代謝穩(wěn)定性及在人體肝微粒體中的代謝產(chǎn)物，采用選擇性化學(xué)抑制法考察Pip在人肝微粒體中的代謝表型，為深入了解Pip的代謝特征和臨床合理用藥提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

超快速液相色譜(UFLC)系統(tǒng)包括：SIL-30AC 自動(dòng)進(jìn)樣器，LC-30AD 高壓輸液泵，CBM-20A 連接器，CTO-20AC柱溫箱(日本島津公司)、Acquity UPLC?Hss C18(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)；AB SCIEX QTRAP5500三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀(美國(guó)AB公司)；數(shù)據(jù)處理軟件(MultiQuant 3.0.2)；W201B升降智能水浴鍋(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)；Thermo Heraeus Fresco 17低溫冷凍離心機(jī)(Thermo Scientific公司)；230V-U K渦旋混合器(Labnet International公司)；BT 125D 電子天平(賽多利斯儀器(北京)有限公司)；移液槍(德國(guó) Eppendorf公司)。

胡椒堿(Piperine,Pip)：由四川大學(xué)生物治療國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離純化而得，純度>99%；內(nèi)標(biāo)白屈菜紅堿對(duì)照品，購于成都瑞芬思生物科技有限公司，純度>98%。大鼠、人、犬、猴、小鼠等肝微粒體：20 mg/mL，NADPH發(fā)生系統(tǒng)：A液(含MgCl2)、B液，均購自武漢普萊特生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司，于-80 ℃冷凍保存；α-萘黃酮(α-Naphthoflavone，ANF；純度大于 98.0%，東京化成工業(yè)株式會(huì)社)；毛果蕓香堿(Pilocarpine，中國(guó)食品藥品檢定研究院)、鹽酸噻氯匹定(Ticlopidine，TCP；純度 99.7%，中國(guó)食品藥品檢定研究院)；奎尼丁(Quinidine，QND；純度>98.0%，TCI 上?；晒I(yè)發(fā)展有限公司)；二乙基二硫代氨基甲酸鈉(Clomethiazole，純度> 99%，sigma 公司)、酮康唑(Ketoconazole，KCZ；純度 99.0%，Dr Ehrenstorfer 公司)，磺胺苯吡唑(Sulphaphenazole，SUP；純度>99%，Sigma 公司)；水：Milli-Q 18.2 MΩ,25 ℃，由本實(shí)驗(yàn)室制備；甲醇：批號(hào)：163629，F(xiàn)isher Scientific 公司；甲酸：色譜純，純度98%，批號(hào)：1001003297，F(xiàn)luka Analytical公司。

2 方法

2.1 溶液的制備

Pip溶液的制備：稱取Pip適量，用甲醇溶解為1 mg/mL對(duì)照品儲(chǔ)備液。

內(nèi)標(biāo)溶液的制備：稱取白屈菜紅堿適量，用甲醇稀釋成10 ng/mL的內(nèi)標(biāo)工作液。

2.2 UFLC-MS/MS條件

液相條件：流速 0.3 mL/min；樣品室溫度：10 ℃；柱溫：30 ℃；流動(dòng)相為0.1%甲酸水(A相)-甲醇(B相)，梯度洗脫，0～2 min，55%～90% B、2～5 min，90%B；進(jìn)樣體積2 μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子化(ESI)方式，檢測(cè)離子為正離子；毛細(xì)管電壓5.5 kV，離子源溫度500 ℃，去簇電壓(DP)為120 V。采用多級(jí)反應(yīng)檢測(cè)模式(MRM)模式，測(cè)定Pip和內(nèi)標(biāo)化合物，其對(duì)應(yīng)的監(jiān)測(cè)離子對(duì)和碰撞能量分別為Pip(m/z286.2→201.1,33 eV)，內(nèi)標(biāo)白屈菜紅堿(m/z348.3→332.2,43 eV)。

2.3 Pip在不同種屬肝微粒體體外代謝孵育模型中的穩(wěn)定性

2.3.1 代謝穩(wěn)定性孵育模型

參照文獻(xiàn)[11]，每個(gè)孵育體系總體積為206 μL，包含188 μL K2HPO4緩沖液(即PBS，100 mM,pH 7.4)和12 μL NADPH發(fā)生系統(tǒng)(10 μL A液和2 μL B液于冰浴上臨時(shí)混合制得)，冰浴上加入1 μL 200 μmol/L Pip后，于37 ℃預(yù)孵5 min，分別加入5 μL各種屬肝微粒體溶液?jiǎn)?dòng)反應(yīng)。孵育時(shí)間為0、5、15、30、45、60 min。待反應(yīng)完畢后，取孵育后的樣品(200 μL)加400 μL含內(nèi)標(biāo)10 ng/ mL的冰甲醇終止反應(yīng)，渦旋混勻3 min，13 000 rpm離心15 min，取上清液于進(jìn)樣瓶中。平行實(shí)驗(yàn)3次，考察Pip在不同種屬肝微粒體中的代謝穩(wěn)定性。

2.3.2 體外半衰期

將孵育0 min時(shí)間點(diǎn)Pip的濃度作為100%，其他孵育時(shí)間點(diǎn)的濃度與之相比得剩余百分量，將各時(shí)間點(diǎn)的剩余百分量的自然對(duì)數(shù)與孵育時(shí)間作線性回歸，求算得斜率k，根據(jù)公式半衰期T1/2=-0.693/k；肝微粒體中的固有清除率CLint=0.693×孵育液(mL)/[T1/2(min)×肝微粒體(mg)]。

2.4 Pip在CYP450酶中的代謝表型研究

2.4.1 代謝表型研究體系

根據(jù)文獻(xiàn)[12]，代謝表型研究體系采用選擇性化學(xué)抑制劑法。所選的CYP3A4抑制劑為酮康唑(1 μmol/ L)，CYP2D6抑制劑為奎尼丁(10 μmol/ L)，CYP2C9抑制劑為磺胺苯吡唑(20 μmol/ L)，CYP2A6抑制劑為毛果蕓香堿(25 μmol/ L)，CYP2C19抑制劑為鹽酸噻氯匹定(50 μmol/ L)，CYP2E1抑制劑為二乙基二硫代氨基甲酸鈉(100 μmol/L)，CYP1A1為α-萘黃酮(1 μmol/L)。代謝表型反應(yīng)時(shí)間、酶蛋白濃度及底物濃度根據(jù)“2.3.1”項(xiàng)下確定。

設(shè)定Pip孵育濃度為1 μmol/mL，人肝微粒體濃度為20 mg/mL。以2.3.1項(xiàng)下孵育體系，冰浴上加入200 μmol/L的Pip溶液1 μL，各選擇性化學(xué)抑制劑1 μL，在37 ℃預(yù)孵5 min后，加入人肝微粒體溶液5 μL，渦旋混勻，37 ℃孵育10 min，反應(yīng)結(jié)束后，加入400 μL含內(nèi)標(biāo)10 ng/mL的冰甲醇終止反應(yīng)，每個(gè)樣品平行3份。

另設(shè)置未發(fā)生反應(yīng)樣品為陰性對(duì)照組(不加NADPH發(fā)生液，只加等量甲醇)；設(shè)定完全發(fā)生反應(yīng)為陽性對(duì)照組(加入NADPH發(fā)生系統(tǒng)，但不加抑制劑，只加等量甲醇)。利用UFLC-MS/MS測(cè)定Pip的剩余濃度，考察不同選擇性化學(xué)抑制劑對(duì)Pip代謝的影響。

2.4.2 數(shù)據(jù)處理

抑制率=[1-(陰性對(duì)照組濃度-實(shí)驗(yàn)組濃度)/(陰性對(duì)照組濃度-陽性對(duì)照組濃度)]×100%。利用OriginLab 9.0、EXCEL軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和制圖。

2.5 體外代謝產(chǎn)物研究

設(shè)定Pip孵育終濃度為50 μmol/ L，在2.3.1項(xiàng)下孵育體系，冰浴上加入5 000 μmol/L的Pip溶液2 μL，在37 ℃預(yù)孵5 min后，加入人肝微粒體溶液5 μL，渦旋混勻，分別于37 ℃孵育0 min和90 min，反應(yīng)結(jié)束后，加入200 μL冰甲醇終止反應(yīng)。照2.3.1項(xiàng)下處理后，利用UFLC-MS/MS進(jìn)行進(jìn)樣測(cè)定。

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1 專屬性考察

取PBS 188 μL，加入5 μL高溫滅活的肝微粒體，記為“孵育體系Ⅰ”。取“孵育體系Ⅰ”，加入400 μL含內(nèi)標(biāo)10 ng/mL的甲醇溶液，照“2.3.1”項(xiàng)下的樣品處理方法進(jìn)行處理，即得空白對(duì)照樣品A。另取“孵育體系Ⅰ”，加入含內(nèi)標(biāo)10 ng·mL-1的甲醇溶液400 μL和200 μmol/L Pip溶液1 μL，同法處理，得對(duì)照樣品B。

2.6.2 線性關(guān)系

精密吸取Pip對(duì)照品貯備液，用甲醇逐級(jí)稀釋為質(zhì)量濃度分別為390.5、781、1 563、3 125、6 250、12 500、25 000、50 000 ng/mL的系列對(duì)照品溶液。于“孵育體系Ⅰ”中分別加入1 μL上述系列對(duì)照品溶液，渦旋混勻，照“2.3.1”項(xiàng)下樣品處理方法進(jìn)行處理，照“2.2”項(xiàng)下液質(zhì)條件進(jìn)行測(cè)定。利用“MultiQuant 3.0.2”數(shù)據(jù)處理軟件，求得直線回歸。

2.6.3 準(zhǔn)確度

照“2.6.2”項(xiàng)下，制得質(zhì)量濃度分別為781、31.25、400 ng/mL的低、中、高三組質(zhì)控濃度樣品進(jìn)行準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)，同法處理后進(jìn)行分析，計(jì)算各質(zhì)控樣品的回收率。每組樣品平行5份。

2.6.4 精密度

照“2.6.3”項(xiàng)下，配制低、中、高濃度質(zhì)控樣品，用質(zhì)控樣品的日內(nèi)和日間RSD表示。日內(nèi)每隔2 h 處理一組低、中、高濃度樣品，共處理5組，計(jì)算日內(nèi)精密度。日間精密度連續(xù)3天測(cè)定3個(gè)分析批次，每個(gè)濃度測(cè)定5個(gè)樣品來計(jì)算日間精密度。

2.6.5 基質(zhì)效應(yīng)

照“2.6.3”項(xiàng)下，配制低、中、高濃度質(zhì)控樣品，分別測(cè)定峰面積A；另取Pip對(duì)照品溶液，加含內(nèi)標(biāo)10 ng/mL流動(dòng)相制成相同濃度的溶液，分別測(cè)定峰面積B，每組平行5份。基質(zhì)效應(yīng)公式為A / B × 100%，此值應(yīng)在85%～115% 之間。

3 結(jié)果

3.1 方法學(xué)考察

在“2.2”實(shí)驗(yàn)條件下，Pip與內(nèi)標(biāo)白屈菜紅堿的保留時(shí)間分別為4.27、2.93 min，達(dá)到基線分離，且無空白基質(zhì)干擾，說明該方法專屬性良好，結(jié)果見圖2。利用“MultiQuant 3.0.2”數(shù)據(jù)處理軟件，求得直線回歸為：y=0.131 78x+ 0.378 41(r= 0.995 9)，各濃度的準(zhǔn)確度偏差均小于15%，表明在3.91～500 ng/mL范圍內(nèi)，Pip的濃度與響應(yīng)值呈良好的線性關(guān)系，符合要求。低、中、高質(zhì)控樣品的回收率分別為(110.82 ± 3.91)%、(107.81 ± 4.96)%、(107.96 ± 3.17)%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該濃度范圍內(nèi)，回收率較高，準(zhǔn)確度符合要求，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確、可信。日內(nèi)和日間精密度RSD小于5%，符合要求?；|(zhì)效應(yīng)在85%～115% 范圍內(nèi)，對(duì)測(cè)定結(jié)果影響較小。方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果表明，該方法特異性好，準(zhǔn)確度、精密度和基質(zhì)效應(yīng)等均符合要求，結(jié)果見表1。

圖2 Pip及內(nèi)標(biāo)白屈菜紅堿的色譜圖Fig.2 Chromatograms of Pip and internal standard compound chelerythrine注：A為空白對(duì)照樣品；B為加入Pip及內(nèi)標(biāo)白屈菜紅堿的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照樣品。Note:A is a blank control sample;B is a standard control sample added Pip and internal standard chelerythrine.

質(zhì)量濃度Concentration(ng/ mL)準(zhǔn)確度Accuracy精密度RSDPrecision RSD(%)日內(nèi)Day日間Daytime基質(zhì)效應(yīng)Matrix effect(%)低Low110.82±3.913.344.57100.64中Middle107.81±4.964.404.9097.45高High107.96±3.172.083.2898.70

3.2 Pip在不同種屬肝微粒體中的代謝穩(wěn)定性

分別考察了Pip在人、大鼠、小鼠、猴和犬的5個(gè)種屬肝微粒體中的代謝穩(wěn)定性，Pip均發(fā)生了代謝，孵育時(shí)間與底物剩余百分比的自然對(duì)數(shù)孵育曲線見圖3。其中在猴和犬肝微粒體中代謝較為相似，在小鼠、猴和大鼠肝微粒體中代謝較緩慢，在人和大鼠肝微粒體中代謝較明顯。

3.3 體外半衰期與固有清除率

在人、大鼠、小鼠、恒河猴和比格犬肝微粒體中，以孵育時(shí)間為橫坐標(biāo)，以底物剩余百分比的自然對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)作線性回歸，在肝微粒體中的線性方程人為y=-0.022 1x+4.392(r2=0.935 7)，大鼠為y=-0.014 3x+4.375(r2=0.856 8)，昆明種小鼠為y=-0.007 4x+4.559 8(r2=0.967 7)，恒河猴為y=-0.004 7x+4.601 3(r2=0.991 5)，比格犬為y=-0.004 2x+4.592 7(r2=0.991 8)。由各線性的斜率k求得Pip在各種屬中的半衰期和固有清除率(見表2)。

圖3 Pip在人、大鼠、小鼠、猴和犬5個(gè)種屬肝微粒體中各時(shí)間點(diǎn)與底物剩余百分比的自然對(duì)數(shù)孵育曲線Fig.3 The natural logarithmic incubation curves of Piperine with the percentage of substrate remaining at each time point in human,rat,mouse,monkey and dog liver microsomes

表2 Pip在人、SD大鼠、小鼠、恒河猴和比格犬5個(gè)種屬肝微粒體中的體外代謝半衰期和固有清除率

Table 2 Half-life in vitro and intrinsic clearance of Piperine in human ,rat,mouse,monkey and dog liver microsomes

種屬 SpeciesT1/2(min)CLintmL/(min·mg)人 Human31.360.0442大鼠 Rat48.460.0286小鼠 Mouse138.60.0100猴 Monkey147.450.0094犬 Dog165.000.0084

3.4 Pip在人肝微粒體中的代謝表型

CYP3A4和CYP2C9是參與Pip代謝的主要同工酶，代謝抑制率分別為81.13% 和69.21%。各抑制劑對(duì)人肝微粒體中Pip代謝的影響結(jié)果見表3。

3.5 體外代謝產(chǎn)物研究

圖4 A為孵育0 min與孵育90 min的樣品色譜對(duì)比圖。將孵育0 min的提取色譜圖上保留時(shí)間為9.92 min的色譜峰命名為M0。通過圖4 A可知，孵育90 min的提取色譜在M0的基礎(chǔ)上，新增了3個(gè)色譜峰，保留時(shí)間分別為6.94、7.55、10.21 min，依次命名為M1(6.94 min)、M2(7.55 min))、M3(10.21 min)。[M+H]+峰m/z依次為274.15、318.24和284.19，分別見圖4 D、E、F。各譜圖詳見圖4。

表3 各抑制劑對(duì)人肝微粒體中Pip代謝的影響

4 結(jié)論

本文建立了Pip的UFLC-MS/MS定量測(cè)定方法，該方法專屬性強(qiáng)，靈敏度高，線性、準(zhǔn)確度、精密度和基質(zhì)效應(yīng)等均符合生物樣品的測(cè)定要求。Pip在人、大鼠、小鼠、恒河猴和比格犬肝微粒體中體外代謝半衰期T1/2分別為31.36、48.46、138.60、147.45、165.00 min；體外固有清除率分別為0.044 2、0.028 6、0.010 0、0.009 4、0.008 4 mL·min-1·mg-1，推測(cè)Pip在人和大鼠肝微粒體中代謝較接近，代謝相對(duì)較快；在小鼠、猴和犬肝微粒體中代謝速率接近，均較慢；表明Pip在人、SD大鼠、小鼠、恒河猴和比格犬肝微粒體中代謝速率存在明顯的種屬差異。在后續(xù)進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇時(shí)，可以考慮采用與人代謝較為接近的大鼠作為參考。目前，CYP代謝酶表型的確定主要有特定的化學(xué)物質(zhì)或抗體作為特定酶的抑制劑(特異性化學(xué)抑制劑法)和重組人源CYP同工酶法。由于重組人源CYP同工酶法相對(duì)來說成本更高，因此本實(shí)驗(yàn)采用選擇性化學(xué)抑制劑法?？疾焓茉囁幬锏拇x被作用藥物抑制時(shí)，選擇了該酶已知的強(qiáng)抑制劑。代謝表型實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明人肝微粒體中參與Pip代謝的酶主要有CYP3A4和CYP2C9。代謝表型的研究可以預(yù)測(cè)其潛在的藥物-藥物相互作用。Pip在與其他藥物聯(lián)用時(shí)，需考慮經(jīng)CYP3A4和CYP2C9代謝的藥物之間的相互作用，如與經(jīng)CYP3A4代謝的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素(如紅霉素、克拉霉素等)、CYP450酶抑制劑咪唑類抗真菌藥(如主要的CYP3A4抑制劑酮康唑、伊曲康唑等)、經(jīng)CYP2C9代謝的藥物(如苯妥英、甲苯磺丁脲)、鈣拮抗劑(如尼卡地平、維拉帕米、美貝拉地爾等)[13，14]，實(shí)施個(gè)體化治療，提高藥物療效、降低不良反應(yīng)的發(fā)生率。

圖4 孵育0 min與孵育90 min的樣品色譜對(duì)比圖及各色譜峰質(zhì)譜圖Fig.4 The chromatograms of samples incubated for 0 min and 90 min and mass spectrum of each chromatogram peaks注：A為孵育0 min與孵育90 min的樣品色譜對(duì)比圖；B為孵育0 min M0質(zhì)譜圖；C為孵育90 min M0質(zhì)譜圖；D為孵育90 min M1質(zhì)譜圖；E為孵育90 min M2質(zhì)譜圖；F孵育90 min M3質(zhì)譜圖。Note:A is Chromatograms of samples incubated for 0 min and 90 min.;B is incubation of M0 spectra for 0 min;C is incubation of M0 spectra for 90 min;D is incubation of M1 spectra for 90 min;E is incubation of M2 spectra for 90 min;F is incubation of M3 spectra for 90 min.