秦偉瀚，陽 勇，李 卿，王云紅，花 雷，郭延壘

重慶市中藥研究院，重慶 400065

馬錢子為馬錢科植物馬錢(Strychnosnux-vomicaL.)或云南馬錢(StrychnoswallichianaSteudExDC.)的干燥成熟種子[1-3]。具有散結(jié)消腫，通絡(luò)止痛之功效。中醫(yī)臨床常用于治療跌打損傷，癰疽腫痛，風(fēng)濕頑痹，麻木癱瘓等證[4]。油炸馬錢始源于明代《魯府秘方》，清代《良朋匯集》中“用香油炸待浮起，取出，乘熱去皮為末”是香油制馬錢子的最早記載[5,6]。由于馬錢子的劇烈毒性，極大的限制了其臨床應(yīng)用，馬錢子通常要經(jīng)過高溫或加熱炮制，歷代醫(yī)藥文獻(xiàn)記載的馬錢子多使用炮制品，包括砂燙、油炸、醋制、陽江九制等十多種炮制方法，而今常用的僅砂燙和油炸兩種[7,8]。已往研究表明，馬錢子受熱后，其主要的毒成分士的寧、馬錢子堿含量會(huì)有所降低，同時(shí)生成毒性更低、治療效果更好的氮氧化物，增強(qiáng)了使用的安全性和有效性[9,10]。目前報(bào)道的化學(xué)成分研究多以砂燙馬錢子和生品為主[11-13]，油炸后馬錢子化學(xué)成分研究鮮見報(bào)道，本研究結(jié)合定性、定量分析、OPLS-DA分析，共同探討馬錢子油炸前后的化學(xué)變化，為馬錢子炮制機(jī)理闡釋及深入開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

LC-30A型超高效液相色譜儀(日本，島津公司)：二元高壓泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱；AB4000三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜；Triple TOFTM 4600型四極桿串聯(lián)飛行時(shí)間高分辨質(zhì)譜儀(美國，AB公司)：Analyst 1.6工作站、PeakView 1.2.0.3 數(shù)據(jù)處理軟件；BJ-100型超高速中藥粉碎機(jī)(中國，德清拜杰電器有限公司)；PBM-20型球磨儀(中國，長沙中晶化工機(jī)械有限公司)；JY92-ⅡD型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(中國，寧波新藝超聲設(shè)備有限公司)；CPA225D型十萬分之一分析天平(德國，賽多利斯公司)。

馬錢子堿(批號：10284-201611)，士的寧(批號：10408-201611)：均由南昌貝塔生物科技有限公司提供。乙腈、水(色譜純級，德國Merck公司)；甲酸(色譜純級，美國ACS公司)；甲醇(分析純，重慶川東化工公司)；芝麻油( 重慶市巢寧麻油廠)。馬錢子樣品購于重慶中藥材市場(產(chǎn)地：廣西省)，經(jīng)重慶市中藥研究院生藥研究所劉翔副研究員鑒定為馬錢科植物馬錢(Strychnosnux-vomicaL.)的干燥成熟種子。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 色譜條件

色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)；流動(dòng)相：A為0.1%甲酸水溶液，B為乙腈溶液；梯度程序：0～2.0 min，5%B；2.0～10.0 min，5%～60%B；10.0～16.0 min，60%～80%B；16.0～20.0 min，80%～90%B；20.0～22.0 min，90%～5%B；22.0～25.0 min，5%B；流速：0.2 mL/min，柱溫：30 ℃，進(jìn)樣量：2 μL。

1.2.2 質(zhì)譜條件

離子源為電噴霧離子源(ESI)，正/負(fù)離子模式分別采集，噴霧電壓(IS)：+5 500 V、-4 500 V；霧化氣壓力(GS1)：55 Psi；氣簾氣壓力(CUR)：20 Psi；輔助氣壓力(GS2)：50 Psi；離子源溫度(TEMP)：600 oC；簇裂解電壓(DP)：65 V；碰撞能量(CE)：45 V；碰撞能量滾動(dòng)區(qū)間(CES)：15 V；檢測模式為IDA(信息關(guān)聯(lián)采集模式)，多重質(zhì)量虧損(MMDF)和動(dòng)態(tài)背景扣除(DBS)為觸發(fā)二級的條件，滿足該條件優(yōu)先進(jìn)行二級掃描。

1.2.3 樣品溶液制備

取市售麻油400 mL，倒入鐵鍋中，用溫程400 ℃溫度計(jì)測溫，天然氣爐上加熱至230 ℃時(shí)投入馬錢子，炸至老黃色為度，取出瀝盡油，晾冷[5,14]。并將上述炮制前后馬錢子粉碎后過100目篩，取粉末0.2 g，精密稱定，置5 mL試管中，精密加入75%甲醇2 mL，稱定重量，于超聲波細(xì)胞破碎儀中超聲處理(功率：600 W)40 min，取出，放冷，再次稱定重量，用80%甲醇補(bǔ)足減失重量，搖勻，過0.22 μm微孔濾膜，即得。

1.2.4 對照品溶液制備

取適量馬錢子堿、士的寧標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL容量瓶中，加入色譜甲醇溶解定容至刻度，制成濃度為1.0 mg/mL的對照品溶液，備用。

1.2.5 定性分析數(shù)據(jù)處理方法

查閱馬錢子化學(xué)相關(guān)文獻(xiàn)[15,16]，將化合物信息輸入PeakView軟件，建立馬錢子已知成分篩查數(shù)據(jù)庫；采用“樣品溶液制備”方法對油炸及生品馬錢子樣品進(jìn)行提取，并采用已建立的色譜、質(zhì)譜條件對該樣品數(shù)據(jù)進(jìn)行采集。采集完成后，將上述數(shù)據(jù)導(dǎo)入PeakView軟件，利用已建立的篩查數(shù)據(jù)庫將滿足質(zhì)量誤差小于5 ppm、同位素分布正確且含有二級碎片的離子作為分析目標(biāo)化合物，結(jié)合軟件Formula Finder、Mass Calculators等功能、在線數(shù)據(jù)庫(Human Metabolome Database、Pub Chem、Chemical Book等)及二級碎片裂解規(guī)律，對馬錢子炮制前后樣品進(jìn)行快速的定性鑒別分析。

1.2.6 OPLS-DA分析數(shù)據(jù)處理方法

按照上述炮制方法制備油炸馬錢子樣品，并采用已建立的色譜質(zhì)譜條件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集；將高分辨質(zhì)譜采集到的數(shù)據(jù)導(dǎo)入Notepad軟件，該軟件會(huì)自動(dòng)將離子精確質(zhì)荷比、保留時(shí)間、強(qiáng)度等信息提取出來，并對每個(gè)離子進(jìn)行編號；再將Notepad軟件提取的數(shù)據(jù)代入SIMCA-P 14.1軟件進(jìn)行OPLS-DA擬合，得到Scatter得分圖及S-plot圖，最終將分析結(jié)果代入PeakView軟件對炮制前后差異性生物標(biāo)志物進(jìn)行定性分析鑒定。

1.2.7 Q-TOF定量處理方法

馬錢子堿母離子提取范圍395.18～395.20，定量離子提取范圍324.12～324.13，定性離子提取范圍244.09～244.10；士的寧母離子提取范圍335.16～335.18，定量離子提取范圍184.07～184.08，定性離子提取范圍264.10～264.11。

2 結(jié)果與討論

2.1 油炸及生品馬錢子定性分析

查閱文獻(xiàn)，建立馬錢子已知化學(xué)成分篩查數(shù)據(jù)庫,對油炸及生品馬錢子樣品進(jìn)行提取，Q-TOF質(zhì)譜進(jìn)行數(shù)據(jù)采集(TIC重疊圖見圖1)。采用PeakView軟件結(jié)合在線數(shù)據(jù)庫、二級碎片裂解規(guī)律進(jìn)行定性分析。據(jù)文獻(xiàn)統(tǒng)計(jì)，馬錢子已報(bào)道成分超過60個(gè)，本實(shí)驗(yàn)從油炸及生品馬錢子的醇提樣品中共找到30個(gè)化合物(表1)，檢出率為50%，并發(fā)現(xiàn)一個(gè)新成分，主要包括生物堿類、糖苷類、脂肪酸酯類、醇類等；檢出個(gè)數(shù)最多的化合物種類為生物堿類，共12個(gè)；以往研究認(rèn)為生物堿是馬錢子的主要功效成分，亦是毒性成分，油炸法是通過高溫降低馬錢子堿和士的寧的含量，從而降低了毒性；同時(shí)馬錢子堿和士的寧會(huì)轉(zhuǎn)化為氮氧化物，而氮氧化物的毒性遠(yuǎn)低于兩種原型，治療效果卻比原型要高，本實(shí)驗(yàn)僅檢測出了馬錢子堿氮氧化物。番木鱉次堿和馬錢素僅在生品中檢測到，而僅在油炸品中找到的成分為阿魏酸和羽扇豆醇，可能與高溫炮制過程等因素相關(guān)。

圖1 油炸品與生品總離子流重疊圖Fig.1 Overlapping chart of total ions chromatogram of fried product and raw product注：(a)正離子模式下油炸品和生品的總離子流重疊圖、(b)負(fù)離子模式下油炸品和生品的總離子流重疊圖。Note:(a)Tic overlap map in positive ion mode,(b)tic overlap map in negative ion mode.

保留時(shí)間tR(min)離子峰歸屬Ion mode質(zhì)荷比Mass charge ratio(m/z)實(shí)測值Measured mass理論值Calculated mass二級碎片離子MS/MS fragment ion偏差Deviation(ppm)分子式Formula鑒定結(jié)果Identification results3.41[M-H]-125.024 0125.024 4107.013 9-3.7C6H6O3麥芽酚Matol4.01[M-H]-169.013 9169.014 3125.023 1-2.3C7H6O5沒食子酸Gallic acid

續(xù)表1(Continued Tab.1)

保留時(shí)間tR(min)離子峰歸屬Ion mode質(zhì)荷比Mass charge ratio(m/z)實(shí)測值Measured mass理論值Calculated mass二級碎片離子MS/MS fragment ion偏差Deviation(ppm)分子式Formula鑒定結(jié)果Identification results4.70[M+H]+268.103 8268.104 0136.060 7,119.034 8-1.0C10H13N5O4腺苷Adenosine4.70[M-H]-193.049 9193.050 6175.038 8-3.6C10H10O4阿魏酸●Ferulic acid4.83[M-H]-375.129 2375.129 7213.076 2-1.3C16H24O10番木鱉苷酸Loganic acid5.05[M-H]-299.112 8299.113 6137.057 0,119.034 1-2.6C14H20O7毛柳苷Salidroside5.32[M-H]-137.024 1137.024 492.027 0-2.4C7H6O3水楊酸Hydroxybenzoic acid5.41[M-H]-109.029 5109.029 591.019 5-0.3C6H6O2兒茶酚Catechol5.53[M+H]+355.102 3355.102 4163.038 4,145.027 5-0.2C16H18O9綠原酸Chlorogenic acid5.53[M-H]-153.018 8153.019 3125.023 7-3.2C7H6O4原兒茶酸Protocatechuic acid5.70[M+H]+353.185 5353.186 0335.173 1-1.4C21H24N2O3異偽番木鱉堿 Isopseudostrychnine5.70[M-H]-151.039 6151.040 1136.016 3-3.3C8H8O3對羥基苯乙酸 Hydroxyphenylacetic acid5.64[M+H]+335.174 7335.175 4307.143 3-2.0C21H22N2O2士的寧Strychnine5.73[M+H]+395.195 6395.196 5379.163 8-2.2C23H26N2O4馬錢子堿Brucine5.74[M+H]+425.205 9425.207 1368.147 3-2.8C24H28N2O5諾法生Novacine5.77[M+H]+391.159 7391.159 8229.108 0-0.3C17H26O10馬錢素▲Loganin5.87[M+H]+411.189 9411.191 5394.186 5,379.163 2-3.8C23H26N2O5馬錢子堿N-氧化物Brucine N-oxide5.94[M+H]+351.168 7351.170 3334.166 4,333.158 4-4.7C21H22N2O34-羥基番木鱉堿 4-Hydroxystrychnine5.96[M+H]+365.185 1365.186 0308.126 5-2.4C22H24N2O3可魯勃林Colubrine6.16[M+H]+381.179 3381.180 9364.175 9-4.2C22H24N2O42-羥基-3-甲氧基番木鱉堿 2-Hydroxy-3-methoxystrychnine6.23[M-H]-167.034 9167.035 0151.002 6-0.6C8H8O4香草酸Vanillic acid6.32[M-H]-207.065 9207.066 3189.053 6,162.030 7-1.9C11H12O4咖啡酸乙酯Ethyl caffeate6.90[M+H]+557.258 2557.256 6395.196 82.8C21H24N2O番木鱉次堿▲Vomicine7.03[M+H]+405.140 1405.139 1387.136 42.4C17H24O11斷氧化馬錢子苷Secoxyloganin7.41[M+H]+365.149 2365.149 6347.137 2-1.0C21H20N2O418-O-偽馬錢子堿 5-Oxopseudostrychnine8.24[M+H]+409.176 0409.175 8381.143 60.5C23H24N2O58-O-馬錢子堿5-Oxobrucine15.96[M+H]+457.367 9457.367 6411.366 90.8C30H48O3熊果酸Ursolic acid19.26[M-H]-425.363 2425.363 6407.354 4,363.360 4-1.1C26H50O422-[(2-Methyl-2-propanyl)oxy]-22-oxodocosanoic acid★20.80[M+H]+425.377 4425.377 8407.361 8-1.0C30H48O5,6-羊齒烯醇Simiarenol20.90[M+H]+427.391 8427.393 4409.378 2-3.7C30H50O羽扇豆醇●Lupeol

注：●僅油炸中含有，▲僅生品中含有，★未報(bào)道成分。

Note:●Only fried product contain,▲only raw product contain,★new chemical constituents.

2.2 OPLS-DA分析

將高分辨質(zhì)譜檢測的數(shù)據(jù)結(jié)果導(dǎo)入SIMCA-P軟件(版本號：14.1)，建立正交偏最小二乘數(shù)學(xué)模型；通過OPLS-DA分析共找到17個(gè)差異性生物標(biāo)志物，包括生物堿類(7個(gè))、糖苷類(4個(gè))、有機(jī)酸類(5個(gè))，其中12個(gè)成分為馬錢子文獻(xiàn)首次報(bào)道；分析結(jié)果(表2)顯示在正離子模式下找到7個(gè)生物堿和1個(gè)二糖，在負(fù)離子模式下找到3個(gè)糖苷和5個(gè)有機(jī)酸；由得分圖(圖2)可知，油炸品和生品數(shù)據(jù)點(diǎn)區(qū)分明顯，表明馬錢子經(jīng)過油炸炮制后，化學(xué)成分有了顯著變化。士的寧、麥芽糖、Dattelic acid和油酸分別位于正、負(fù)離子下S-plot圖的兩端，說明經(jīng)過油炸炮制后這四種化合物變化是最為顯著；有報(bào)道稱士的寧的毒性是馬錢子堿的20倍，而在S-plot圖(圖3)中士的寧數(shù)據(jù)點(diǎn)明顯比馬錢子堿離軸更遠(yuǎn)，可以間接證實(shí)油炸炮制的減毒效果。生物堿是馬錢子藥理、毒理研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)，在正離子模式下，炮制品與生品共找到7個(gè)生物堿類差異性標(biāo)志物，證明油炸炮制能有效降低生物堿含量，從而降低毒性。負(fù)離子模式下，找到5個(gè)有機(jī)酸類化合物，其中油酸廣泛存在于動(dòng)植物體內(nèi)，被OPLS-DA識別出來，可能與該類化合物的高溫分解有關(guān)；應(yīng)該是造成其油炸炮制前后顯著差異的原因。生物標(biāo)志物的二級及裂解規(guī)律圖見圖4。

圖2 油炸品與生品OPLS-DA得分圖Fig.2 Score scatter plot of fried product and raw product注：(a)正離子模式下得分圖、(b)負(fù)離子模式下得分圖。Note:(a)Score scatter plot in positive ion mode、(b)Score scatter plot in negative ion mode.

圖3 油炸品與生品的S-plot圖Fig.3 S-plot chart of fried product and raw product注：(a)正離子模式下S-plot圖、(b)負(fù)離子模式下S-plot圖。Note：(a)S-plot in positive ion mode、(b)S-plot in negative ion mode.

ID號No.保留時(shí)間tR(min)離子歸屬Ion mode質(zhì)荷比Mass charge ratio(m/z)實(shí)測值Measured mass理論值Calculated mass誤差Deviation(ppm)分子式Formula鑒定結(jié)果Identification results油炸品平均強(qiáng)度Intensity of fried product(psi)生品平均強(qiáng)度Intensity of raw product(psi)M11.19[M-H]-191.055 0191.054 90.3C7H12O6奎尼酸★Quinic acid94 66631 904M21.19[M-H]-387.111 2387.111 3-0.3C13H24O137-(α-D-Glucopyranosyloxy)-2,3,4,5,6-pentahydroxyheptanoic acid★13 997147 369M31.22[M+Na]+365.104 8365.105 1-0.8C12H22O11麥芽糖★Maltose64 574248 589M44.70[M-H]-315.069 5315.069 7-0.5C13H16O9b-D-Glucopyranose,1-(2,5-dihydroxybenzoate)★48 441289 948M54.93[M-H]-375.127 0375.126 51.3C16H24O10番木鱉苷酸Loganic acid391 668739 924M65.30[2M-H]-707.179 9707.179 9-0.1C16H18O9Isobiflorin★63 026183 285M75.55[M+H]+349.190 3349.190 20.2C22H24N2O2甲基士的寧★Methyl strychnine1 076 893411 424M85.61[M+H]+335.174 8335.174 70.3C21H22N2O2士的寧Strychnine4 127 4283 096 904M95.70[M+H]+395.195 6395.195 7-0.4C23H26N2O4馬錢子堿Brucine2 820 6592 286 980M105.86[M+H]+411.190 6411.191 6-2.5C23H26N2O5馬錢子堿N-氧化物Brucine N-oxide124 531227 983M116.13[M+H]+381.180 5381.180 7-0.6C22H24N2O42-羥基-3-甲氧基番木鱉堿 2-Hydroxy-3-methoxystrychnine389 5791 446 089M126.26[M-H]-335.074 4335.074 5-0.4C16H16O8Dattelic acid★67 5462 754M136.28[M+H]+503.216 9503.217 0-0.1C29H30N2O6Methyl-4-({(2E)-3-(3,4-diethoxyphenyl)-2-[(2-methylbenzoyl)amino]-2-propenoyl}amino)benzoate★31 956313 045M146.37[M+H]+443.196 0443.196 2-0.4C27H26N2O41-(4-Biphenylylcarbonyl)-N-(2,3-dihydro-1,4-benzodioxin-6-yl)-4-piperidinecarboxamide★145 304521 859M1516.27[M-H]-279.230 6279.230 8-0.6C18H32O2Dihomolinoleic acid★12 815282 776M1617.35[M-H]-281.246 4281.246 7-1.0C18H34O2油酸★Oleic acid147 2501 769 543M1718.91[M-H]-383.350 6383.350 40.5C24H48O32-羥基二十四烷酸★Cerebronic acid1 94789 797

注：★未報(bào)道成分。

Note:★New chemical constituents.

2.3 主要化學(xué)成分含量分析

采用UPLC-Q-TOF-MS對油炸品、生品馬錢子中馬錢子堿、士的寧含量進(jìn)行檢測，馬錢子堿進(jìn)樣濃度在0.099～990 ng/mL范圍與峰面積線性關(guān)系良好，線性回歸方程為Y=393.143 47X+5 044.336 72，r=0.999 4；士的寧進(jìn)樣濃度在0.11～1 100 ng/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好，線性回歸方程為Y=360.336 74X+6 145.348 92，r=0.999 5；馬錢子堿在油炸、生品中平均含量分別為1.14%、1.22%，士的寧在油炸、生品中平均含量分別為1.29%、1.55%。生物堿是馬錢子研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)，士的寧和馬錢子堿占總堿的80%以上，一般認(rèn)為馬錢子堿和士的寧既是主要毒性成分又是主要的藥效成分，由于兩種物質(zhì)的治療窗口和毒性窗口十分接近，所以在用藥之前大多會(huì)采取炮制以降低其毒性。通過相關(guān)專家及實(shí)驗(yàn)結(jié)果鑒定本研究采用的馬錢子為《中國藥典》規(guī)定品種，通過比較相關(guān)檢測文獻(xiàn)，其士的寧、馬錢子堿的含量與實(shí)驗(yàn)結(jié)果接近，證明藥材鑒定結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。本研究采用的炮制方法為油炸法，是馬錢子的主要炮制方法。由定量檢測結(jié)果可以看出經(jīng)過油炸炮制后士的寧和馬錢子堿含量都有不同程度降低，但仍符合標(biāo)準(zhǔn)(士的寧應(yīng)為1.20%～2.20%，馬錢子堿不得少于0.80%)的要求，上述結(jié)論與OPLS-DA分析探討結(jié)果一致。經(jīng)文獻(xiàn)證實(shí)，士的寧毒性是馬錢子堿的20倍，定量結(jié)果顯示，經(jīng)油炸炮制之后，士的寧含量下降程度要高于馬錢子堿，證明油炸炮制減毒效果尚佳。

圖4 差異性化合物的裂解規(guī)律圖Fig.4 The possible fragmentation pathway of differential compounds

3 結(jié)論

馬錢子化學(xué)成分復(fù)雜，據(jù)報(bào)道該藥材生物堿占總成分的2%～5%，是研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)，其中士的寧和馬錢子堿占總堿的80%以上，是主要的毒性成分和功效成分[17,18]；油炸法早在明代就被《魯府秘方》所收載，是至今為止馬錢子沿用最為廣泛的炮制方法。以上研究結(jié)果表明炮制前后差異最顯著的成分是生物堿類(7個(gè))和有機(jī)酸類(5個(gè))，可能與這兩類化合物在高溫下容易被氧化分解相關(guān)；結(jié)合定性、定量分析結(jié)果可知，馬錢子堿和士的寧是差異顯著成分之一，在炮制前后含量有不同程度降低，但仍能達(dá)到藥典規(guī)定。說明在油炸炮制過程中不僅降低了毒性，同時(shí)還保留了一定藥效。本研究結(jié)果對馬錢子炮制機(jī)理闡釋具有重要意義，同時(shí)也為該藥材的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)闡明提供科學(xué)依據(jù)。