杜軍霞，宮彬彬，宋 菲，蓋璐楠

邢臺(tái)學(xué)院生物科學(xué)與工程學(xué)院，邢臺(tái) 054001

枸杞多糖(Lyciumbarbarumpolysaccharides，LBP)是枸杞中主要生物活性成分之一，具有抗輻射、抗腫瘤、降血糖等多種藥理作用[1,2]。研究顯示LBP能夠提高機(jī)體特異性免疫及機(jī)體自然殺傷細(xì)胞的殺傷力，提升白細(xì)胞水平，對(duì)脾臟和胸腺T細(xì)胞有刺激作用，還能增強(qiáng)機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫功能，同時(shí)也表現(xiàn)出顯著的抗炎作用[3,4]，體外研究證明LBP能夠降低致炎因子一氧化氮(NO)、前列腺素E2(PGE2)、腫瘤壞死因子(TNF-)、白細(xì)胞介素6(interleukin 6，IL-6)等分子的含量，并且顯著抑制了炎癥相關(guān)蛋白ERK、p38、MAPK等的基因表達(dá)，表現(xiàn)出良好的抗炎作用[3]。炎癥往往伴隨著慢性疼痛出現(xiàn)，即炎癥痛，其發(fā)生發(fā)展過(guò)程與外周致炎因子的含量有關(guān)，更重要的是發(fā)生在神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)部的敏化機(jī)制。有研究顯示LBP能夠明顯緩解了坐骨神經(jīng)損傷模型大鼠的自噬和疼痛現(xiàn)象，同時(shí)抑制了神經(jīng)瘤的形成[5]，但關(guān)于LBP在體的抗炎和鎮(zhèn)痛作用的報(bào)道少見(jiàn)。本文通過(guò)小鼠福爾馬林炎癥疼痛模型，觀察LBP的抗炎鎮(zhèn)痛作用并對(duì)其抗炎癥痛作用的分子機(jī)制進(jìn)行了初步探討。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)昆明小鼠20～22 g，雄性30只，雌性20只，購(gòu)于河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(許可證號(hào)：SCXK(冀)2018-004)；出生后7～8天大鼠，購(gòu)于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0010)。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)材料和試劑

枸杞多糖(LBP)(北京源葉生物公司)，小鼠IL-6ELISA試劑盒(江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司，1706H)，38%甲醛溶液，Neurobasal 試劑(Invitrogen),Fura-2 AM(Biotium)，辣椒素(Enzo Life Sciences)，2.5 M KCl(Sigma)，PBS(NaCl 8 g，Na2HPO4·POg2O 2.08 g，KCl 0.2 g，KH2PO40.2 g溶于800 mL ddH2O中，調(diào)pH值至7.2～7.4，定容至1 L)，ES液(NaCl 7.6 g，KCl 0.37 g，KH2PO40.272 g，CaCl20.277 5，MgCl20.095 g，HEPES 2.383 1 g，glucose 1.8 g，溶于900 mL dd H2O 中，溶解完全后調(diào)pH值至7.2，定容至1 L，用蔗糖調(diào)節(jié)滲透壓至295～300 mOsm)。

1.3 動(dòng)物行為學(xué)實(shí)驗(yàn)

1.3.1 小鼠熱板實(shí)驗(yàn)

雌性昆明小鼠20只，隨機(jī)分為對(duì)照組(Ctr)和實(shí)驗(yàn)組(LBP)，灌胃給藥前分別將小鼠放入52 ℃恒溫水浴板上，以小鼠舔足為指標(biāo)，觀察記錄小鼠熱板潛伏期作為基值，之后兩組分別灌胃給予生理鹽水(2 mL/kg體重)或LBP(20 mg/kg體重)溶液，連續(xù)7天，1次/天，于最后一次灌胃30 min后進(jìn)行熱板實(shí)驗(yàn)，記錄小鼠熱板潛伏期，并與基值作比值來(lái)反映LBP對(duì)熱板反應(yīng)潛伏期的影響。

1.3.2 小鼠福爾馬林炎癥模型實(shí)驗(yàn)

雄性昆明小鼠30只隨機(jī)分為對(duì)照組(Ctr)、模型組(FM)、實(shí)驗(yàn)組(LBP)三組。模型組和實(shí)驗(yàn)組分別灌胃生理鹽水(2 mL/kg體重)和LBP(20 mg/kg體重)連續(xù)7天，1次/天，于最后一次灌胃后在右后足底皮下注射1%福爾馬林20 μL，觀察并記錄小鼠的I相和II相自發(fā)痛行為。

1.4 IL-6的檢測(cè)

福爾馬林痛模型4 h后迅速摘眼球取血，將血液室溫靜置40 min，取上層血清備用。取血后小鼠經(jīng)斷頭處死，迅速用手術(shù)剪縱向剪開(kāi)背部皮膚，取下頸椎至尾椎部位的脊柱，用灌有4 ℃預(yù)冷生理鹽水的20 mL注射器將脊髓從椎管中推出，取其腰膨大處約1.5 cm長(zhǎng)度的組織，用預(yù)冷PBS溶液進(jìn)行冰上研磨20 min，4 ℃ 10 000 rpm離心5 min，并取上清備用。采用小鼠IL-6分子ELISA試劑盒對(duì)血清和脊髓裂解液中的IL-6進(jìn)行檢測(cè)。

1.5 鈣成像實(shí)驗(yàn)

原代培養(yǎng)出生后7～8天的大鼠DRG組織細(xì)胞，正常培養(yǎng)2～3天后換用LBP(80 μg/mL)(LBP組)或生理鹽水(Ctr組)進(jìn)行預(yù)處理6 h，用ES液輕洗細(xì)胞兩次，加入適量稀釋于ES液的終濃度5 M Fura2-AM，室溫孵育40 min，換為ES液，室溫恢復(fù)1 h后，于鈣成像試驗(yàn)平臺(tái)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)記錄基礎(chǔ)鈣離子信號(hào)狀況，信號(hào)穩(wěn)定后加入1 μM辣椒素刺激，同時(shí)觀察鈣離子信號(hào)變化。以F340/F380比值變化代表細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化。利用2.5 M KCl對(duì)神經(jīng)元進(jìn)行刺激，以排除整體活性低和狀態(tài)較差的細(xì)胞。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

數(shù)據(jù)處理采用t-檢驗(yàn)(t-tests)和多因素方差分析(Two-way ANOVA)，數(shù)據(jù)分析及作圖用Graph Pad Prism 5軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 LBP對(duì)生理性熱痛覺(jué)影響

為檢測(cè)LBP對(duì)生理性痛覺(jué)的影響，進(jìn)行熱板實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，LBP處理前后，小鼠的熱板反應(yīng)潛伏期變化不明顯，熱板反應(yīng)潛伏期與基值的百分比與對(duì)照組(Ctr)小鼠相比并無(wú)顯著性差異(圖1)，說(shuō)明LBP對(duì)于小鼠的正常生理性熱痛覺(jué)感受功能沒(méi)有明顯影響。

圖1 LBP對(duì)小鼠熱板實(shí)驗(yàn)潛伏期的影響Fig.1 The effect of LBP on latent period of hot plate test注：NS代表LBP組和對(duì)照組比較，無(wú)顯著性差異。Note:NS showed no significant difference between LBP group and saline control group.

2.2 LBP對(duì)福爾馬林炎癥痛模型具有鎮(zhèn)痛作用

給小鼠右后足底注射1%福爾馬林20 μL，模型組(FM)小鼠出現(xiàn)明顯的兩相疼痛，與空白對(duì)照組小鼠相比出現(xiàn)典型的自發(fā)痛行為表現(xiàn)。LBP組的小鼠I相痛和模型組相比沒(méi)有出現(xiàn)差異，但在II相痛15～25 min期間，每5 min舔足和抬足時(shí)間顯著降低，與模型組相比，具有顯著性差異(P<0.05)(圖2)，證明枸杞多糖對(duì)于福爾馬林炎癥痛引起的II相痛的確具有良好的緩解作用。對(duì)照組(Ctr)小鼠未進(jìn)行任何處理，用于證明福爾馬林模型的穩(wěn)定性。

圖2 LBP對(duì)福爾馬林炎癥痛模型小鼠的鎮(zhèn)痛作用Fig.2 Analgesic effect of LBP on formalin induced inflammatory pain in mice 注：***P<0.001，**P<0.01，*P<0.05 LBP組與模型組比較。Note:***P<0.001,**P<0.01 and *P<0.05 LBP group was compared with model control group.

2.3 LBP緩解福爾馬林誘發(fā)的炎癥表現(xiàn)

注射福爾馬林4 h后將小鼠脫臼處死，稱(chēng)取其兩側(cè)后足重量并進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，三組小鼠左后足質(zhì)量均無(wú)差異，而模型組小鼠的兩后足重量差與正常對(duì)照組相比增加，具有顯著性差異(P<0.001)，LBP組小鼠的兩后足重量差與模型組相比有所減少，具有顯著性差異(P<0.001)(圖3)。

圖3 LBP對(duì)福爾馬林注射足重量的影響Fig.3 Effect of LBP on foot weight of formalin injected mice 注：NS代表三組相比無(wú)顯著性差異；***P<0.001模型組和空白對(duì)照組相比；###P<0.001LBP組與模型組比較。Note:NS showed no significant difference between the three groups;***P<0.001 model control group and blank control group were compared;###P<0.001 LBP group and model control group were compared.

2.4 LBP降低福爾馬林引起的炎癥因子釋放

注射福爾馬林4 h后，取外周血液及脊髓組織并檢測(cè)其中的IL-6含量。結(jié)果顯示模型組小鼠的血清中和脊髓組織中的IL-6的含量均顯著增加，與空白對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001)，而LBP組小鼠的血清及脊髓組織IL-6含量升高程度明顯受到抑制，與模型組相比，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001、P<0.05)(圖4)，提示LBP能夠同時(shí)降低外周和神經(jīng)中樞內(nèi)的炎癥因子釋放。

圖4 LBP對(duì)小鼠組織中IL-6含量的影響Fig.4 Effect of LBP on the content of IL-6 in mouse tissues注：***P<0.001，**P<0.01模型組與空白對(duì)照組相比；###P<0.001，#P<0.05LBP組與模型組相比。Note:***P<0.001,**P<0.01 model control group was compared with blank control group;###P<0.001 and #P<0.05 LBP group was compared with model control group.

2.5 LBP降低TRPV1的功能活性

LBP 80 μg/mL預(yù)處理原代培養(yǎng)的DRG神經(jīng)元6 h，進(jìn)行鈣成像實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，LBP顯著降低了1 μM辣椒素刺激所引起的鈣信號(hào)增加現(xiàn)象，加入辣椒素后0～1 min內(nèi)鈣信號(hào)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說(shuō)明LBP減弱了離子通道TRPV1的功能活性(圖5)。

圖5 LBP降低DRG神經(jīng)元上TRPV1功能活性Fig.5 LBP reduces TRPV1 functional activity on DRG neurons 注：*P<0.05LBP組與生理鹽水對(duì)照組比較。Note:*P<0.05 LBP group was compared with saline control group.

3 討論

疼痛不僅是一個(gè)世界范疇的醫(yī)學(xué)問(wèn)題，也是目前在人群中普遍存在的健康問(wèn)題之一。疼痛的研究機(jī)制不明，現(xiàn)有藥物有各自的副作用或欠佳的療效，迄今為止臨床上并無(wú)有效特異的治療方法。多種生物的活性物質(zhì)都有減輕炎癥甚至緩解炎癥痛的效果，但相關(guān)分子機(jī)制研究卻少之又少，很大程度限制了天然消炎鎮(zhèn)痛藥物的臨床應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一方面通過(guò)在體實(shí)驗(yàn)中大鼠足部腫脹程度和血清中IL-6含量?jī)煞N指標(biāo)進(jìn)一步驗(yàn)證了LBP的外周抗炎作用。另一方面值得注意的是，LBP顯著降低了福爾馬林誘導(dǎo)的II相痛，但對(duì)于I相痛沒(méi)有明顯影響，用在體實(shí)驗(yàn)證明了LBP在此模型中的直接鎮(zhèn)痛作用。由于II相痛與痛覺(jué)傳導(dǎo)途徑中的外周敏化和中樞敏化機(jī)制關(guān)系密切，即痛覺(jué)傳入神經(jīng)元的外周端和脊髓水平的神經(jīng)元可塑性有關(guān)，多種痛覺(jué)相關(guān)信號(hào)分子都參與其中，據(jù)此，LBP對(duì)II相痛的抑制很可能通過(guò)影響神經(jīng)系統(tǒng)痛覺(jué)敏化信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)。

組織損傷后多種炎癥因子、致炎物質(zhì)等參與到痛覺(jué)敏化過(guò)程中，其中IL-6是一類(lèi)前炎癥因子，被報(bào)道通過(guò)增強(qiáng)感覺(jué)神經(jīng)元反應(yīng)而與痛覺(jué)可塑性有密切聯(lián)系[6]，并且參與到痛覺(jué)敏化和中樞敏化的過(guò)程中[7]。瞬時(shí)電壓感受器陽(yáng)離子通道，子類(lèi)V，成員1(Transient receptor potential cation channel，subfamily V， member 1，TRPV1)是痛覺(jué)敏化過(guò)程中重要的離子通道，在骨癌痛模型中，外周或中樞的IL-6均能夠通過(guò) JAK/PI3K 信號(hào)途徑增強(qiáng)外周神經(jīng)元DRG細(xì)胞膜上TRPV1的功能活性[8]。因此，本實(shí)驗(yàn)中LBP的抗炎癥痛機(jī)制可能與降低IL-6，進(jìn)一步降低了IL-6引起的TRPV1功能上調(diào)有關(guān)。我們的鈣成像實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在原代培養(yǎng)的混有膠質(zhì)細(xì)胞的DRG細(xì)胞中，LBP預(yù)處理的確降低了TRPV1介導(dǎo)的鈣離子信號(hào)(圖5)，與上述結(jié)論相符。目前，枸杞多糖的抗炎作用已被公認(rèn)，但多數(shù)停留在體外實(shí)驗(yàn)，并且關(guān)于LBP是否具有直接的鎮(zhèn)痛作用尚無(wú)明確實(shí)驗(yàn)證實(shí)，本論文通過(guò)福爾馬林炎癥實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ妥C明LBP的確具有一定的抗炎和鎮(zhèn)痛作用，并初步發(fā)現(xiàn)該鎮(zhèn)痛作用機(jī)制除了與外周抗炎途徑有關(guān)之外，也可能通過(guò)直接影響疼痛的神經(jīng)傳導(dǎo)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)。由于炎癥痛分子機(jī)制十分復(fù)雜，有關(guān)LBP進(jìn)一步的抗炎癥痛效應(yīng)和機(jī)制仍需要更進(jìn)一步的研究。

致謝:感謝北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部王韻教授課題組及北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部神經(jīng)科學(xué)研究所為本研究提供原代神經(jīng)元培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)及鈣成像實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。