熊云昭，王 萱，常 奕，王 箏，郝 娟，柴亞男，王香婷，許慶友*

1河北中醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院，石家莊 050091；2河北中醫(yī)學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，石家莊 050017；3河北省中西醫(yī)結(jié)合肝腎病證重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石家莊 050091

炎性損傷是慢性疾病持續(xù)進(jìn)展的關(guān)鍵，多種腎臟疾病都存在不同程度的炎性反應(yīng)，諸多細(xì)胞因子和血管活性物質(zhì)發(fā)揮著作用，其中醛固酮最為重要。當(dāng)腎臟損傷時(shí)，腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)的激活可誘導(dǎo)鹽皮質(zhì)激素受體的活化，繼而上調(diào)其效應(yīng)介質(zhì)血清和糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)蛋白激酶1(Serum and glucocorticoid induced protein kinase 1，SGK-1)的表達(dá)，導(dǎo)致腎臟炎性損傷參與腎間質(zhì)纖維化的形成。在這一過程中，巨噬細(xì)胞(Macrophage)及炎性介質(zhì)如單核細(xì)胞趨化蛋白-1(Monocyte chemoattractant protein 1，MCP-1)、腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor α，TNF-α)、白細(xì)胞介素-1(Interleukin 1，IL-1)等起著重要作用。因此，阻斷醛固酮活化所造成的炎性損傷對(duì)于減緩腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)展具有重要意義。

本研究參照文獻(xiàn)復(fù)制單側(cè)輸尿管結(jié)扎(Unilateral Ureteral Obstruction，UUO)建立梗阻性腎間質(zhì)纖維化的大鼠模型。通過激活RAAS，誘導(dǎo)鹽皮質(zhì)激素受體活化，進(jìn)而導(dǎo)致腎臟炎性損傷及間質(zhì)纖維化。給予化瘀解毒中藥及醛固酮受體拮抗劑依普利酮治療，觀察其對(duì)巨噬細(xì)胞標(biāo)志物F4/80及炎性因子MCP-1、IL-1、TNF-α的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選用清潔級(jí)雄性Wistar大鼠48只，8周齡，體質(zhì)量200±20 g，購自河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(冀)1205069。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

SGK-1、MCP-1抗體(Affbiotech公司，中國)；IL-1、TNF-α、F4/80抗體(Abcam公司，美國)；GAPDH抗體(Bioworld Technology公司，美國)；免疫組化試劑盒(中杉金橋生物技術(shù)有限公司，中國)。

1.3 儀器與設(shè)備

電泳儀及電泳槽(BIO-RAD)；OLYMPUS VANOX PM-10AD型顯微照相儀(OLYMPUS公司，日本)；ODY-3059掃描儀(Li-cor公司，美國)；超低溫保存箱MDF-382E(SANYO公司，日本)；DHG-9055A型電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司，中國)；水浴箱201-0(天津泰斯特儀器有限公司，中國)；恒溫水浴震蕩器CU600(姜堰市醫(yī)療器械有限公司，中國)；BD120冰箱(青島海爾股份有限公司，中國)；高速冷凍離心機(jī)1-15K(Sigma公司，美國)。

1.4 梗阻性腎病大鼠模型制備

雄性Wistar大鼠48只，按照體重編號(hào)，根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分為假手術(shù)組、UUO組、依普利酮組、中藥組(n=12)。于河北省中西醫(yī)結(jié)合肝腎病證重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)7天后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，復(fù)制梗阻性腎病模型，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，于腹部左側(cè)切開，游離左側(cè)輸尿管，于輸尿管上1/3處和中1/3處分別用手術(shù)線結(jié)扎，離斷輸尿管并縫合皮膚。假手術(shù)組僅將輸尿管游離。假手術(shù)組和模型組給予等量蒸餾水灌胃，治療組分別給以化瘀解毒中藥煎劑(14 g/kg/d)和依普利酮(100 mg/kg/d)，每日1次。治療10天后摘取左側(cè)腎臟，部分腎組織置于4%多聚甲醛中固定、石蠟包埋，切片行常規(guī)HE及免疫組化染色；其余腎組織置于-70 ℃保存用于Western blot檢測蛋白表達(dá)。

1.5 實(shí)驗(yàn)用藥及方法

依普利酮為美國Pfizer公司產(chǎn)品，由日本Research Diets Inc公司根據(jù)動(dòng)物的進(jìn)食量與藥物用量(100 mg/kg/d)按1.25 g/kg加入飼料中；化瘀解毒中藥(組成：黃芪2袋、醋鱉甲1袋、地龍1袋、僵蠶1袋、烏梢蛇1袋、丹參2袋、赤芍1袋、黃芩1袋、金銀花1袋、公英1袋、大黃1袋)由廣東一方制藥有限公司提供中藥配方顆粒，規(guī)格為每袋裝2.0 g，相當(dāng)于臨床使用量飲片10 g。按比例混勻煎煮15 min，水煎液含生藥0.43 kg/L，參照徐叔云《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》折合大鼠用量為14 g/kg/d給藥。依普利酮組給予依普利酮100 mg/kg/d 加入飼料喂養(yǎng)，中藥組給予化瘀解毒中藥煎劑14 g/kg/d 灌胃。

1.6 腎組織標(biāo)本制作及觀察

1.6.1 HE染色觀察腎臟組織形態(tài)學(xué)改變

采用蘇木精-伊紅(HE)染色，觀察各組大鼠腎臟組織病理改變。

1.6.2 免疫組化檢測F4/80、MCP-1、IL-1、TNF-α表達(dá)

采用ABC法觀察腎組織中F4/80(1∶100)、MCP-1(1∶100)、IL-1(1∶100)及TNF-α(1∶100)的表達(dá)，以鏡下觀察到棕黃色顆粒為陽性表達(dá)。PBS替代二抗作為染色陰性對(duì)照。

1.6.3 Western Blot檢測SGK-1、MCP-1、IL-1、TNF-α蛋白表達(dá)

冰凍腎組織100 mg加裂解液(含蛋白酶抑制劑)0.4 mL，提取蛋白并測定含量；取樣品上樣蛋白20～60 ug，電泳后轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉，加入一抗SGK-1、MCP-1、IL-1、GAPDH抗體(1∶1 000)，TNF-α抗體(1∶500)，4 ℃過夜，清洗3次，加入兔二抗(1∶20 000)孵育后顯影，與所得內(nèi)參進(jìn)行校正后比較。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)資料采用SPSS21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，數(shù)值變量以Mean±SD表示，組間比較采用SNK法。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腎臟組織病理學(xué)改變

由圖1可知，HE染色結(jié)果假手術(shù)組腎組織結(jié)構(gòu)正常，腎小管上皮細(xì)胞排列整齊，間質(zhì)無水腫及擴(kuò)張，少量炎性細(xì)胞浸潤；UUO組大鼠腎臟腎小管擴(kuò)張明顯，遠(yuǎn)端小管尤為顯著，上皮細(xì)胞脫落，間質(zhì)大量炎性細(xì)胞浸潤；依普利酮組及中藥組遠(yuǎn)端小管擴(kuò)張程度及上皮細(xì)胞脫落與UUO組大致相同，但炎性細(xì)胞浸潤較UUO組明顯減少。

2.2 免疫組化法檢測腎組織F4/80、MCP-1、IL-1、TNF-α表達(dá)

由圖1可知，F(xiàn)4/80在假手術(shù)組中偶見表達(dá)，模型組陽性細(xì)胞明顯增多，以腎間質(zhì)為甚；中藥及依普利酮組與模型組相比，F(xiàn)4/80陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少，表明中藥及依普利酮可以抑制巨噬細(xì)胞浸潤，繼而減輕腎臟損傷。

由圖1可知，假手術(shù)組MCP-1、IL-1、TNF-α呈弱表達(dá)，主要表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞；模型組中MCP-1、IL-1、TNF-α表達(dá)明顯增強(qiáng)，主要見于腎小管上皮及間質(zhì)細(xì)胞；中藥及依普利酮組MCP-1、IL-1、TNF-α表達(dá)范圍及強(qiáng)度較模型組均明顯減弱，結(jié)果顯示化瘀解毒中藥可以抑制炎性介質(zhì)表達(dá)。

圖1 大鼠腎臟組織蘇木精-伊紅染色病理改變結(jié)果及F4/80、MCP-1、IL-1、TNF-α 免疫組化結(jié)果Fig.1 HE staining of kidney in rats with UUO and expression of F4/80、MCP-1、IL-1、TNF-α in kidneys of UUO rats with immunohistochemistry (×400)注：擴(kuò)張的腎小管；：炎性細(xì)胞；→：F4/80、MCP-1、IL-1、TNF-α在腎小管上皮細(xì)胞的表達(dá)。Note:The expansion of the renal tubules;:Inflammatory cells;→:Expression of F4/80、MCP-1、IL-1、TNF-α in renal tubular epithelial cells.

2.3 Western blot檢測SGK-1、MCP-1、IL-1、TNF-α的蛋白表達(dá)

采用Western Blot檢測腎組織SGK-1、MCP-1、IL-1、TNF-α的蛋白表達(dá)，由圖2可知，結(jié)果顯示模型組SGK-1、MCP-1、IL-1、TNF-α表達(dá)較假手術(shù)組明顯增強(qiáng)(P<0.05)；化瘀解毒中藥及依普利酮治療可下調(diào)其表達(dá)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

圖2 Western blot檢測UUO大鼠腎臟SGK-1，MCP-1，IL-1，TNF-α表達(dá)Fig.2 The protein expression of SGK-1,MCP-1,IL-1,TNF-α in UUO rats with Western blot注：與SHAM組比較，*P <0.05；與UUO組相比，△P <0.05。Note:vs SHAM group,*P <0.05;vs UUO group,△P <0.05.

3 討論

近年來，人們對(duì)炎性損傷在慢性疾病中的作用有了深刻的認(rèn)識(shí)。盡管起始原因有多種，疾病持續(xù)進(jìn)展中，炎性損傷是關(guān)鍵因素，故抗炎治療成為新的靶點(diǎn)[1]。腎臟病進(jìn)展中，炎性介質(zhì)同樣發(fā)揮著重要作用，可刺激細(xì)胞增殖[2]、轉(zhuǎn)化。

炎癥損傷可因于感染因素，這是腎臟病誘發(fā)或加重的常見原因，但更有意義的是體內(nèi)血管活性物質(zhì)等代謝異常所引起的內(nèi)源性損傷。醛固酮在炎性損傷過程中發(fā)揮著重要作用， Hans Selye于1955年論述了醛固酮在誘導(dǎo)炎癥方面的作用[3]，指出鹽皮質(zhì)激素是誘導(dǎo)炎癥的物質(zhì)。近年來，隨著對(duì)腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)的深入研究，認(rèn)識(shí)到醛固酮(ALD)是腎纖維化過程中的關(guān)鍵因素。ALD不僅可以導(dǎo)致鈉水潴留，而且可以促進(jìn)組織膠原沉積、纖維化，如腎臟、心臟、肝、肺等器官組織的纖維化[4]，也誘導(dǎo)氧化應(yīng)激與炎癥損傷[5,6]，誘導(dǎo)腎臟固有細(xì)胞增殖[7]，給以鹽皮質(zhì)激素受體阻斷劑，可有效減輕炎癥損傷及間質(zhì)纖維化改變[8]。

經(jīng)過臨床驗(yàn)證，中醫(yī)中藥在治療慢性腎臟病方面發(fā)揮著重要作用，已有研究表明化瘀通絡(luò)中藥可通過上調(diào)腎小球足細(xì)胞裂孔膜蛋白的表達(dá)，減少尿蛋白，延緩糖尿病腎病病程進(jìn)展[9]，故研究中醫(yī)中藥的作用機(jī)制對(duì)于臨床治療有著重要的意義。根據(jù)“久病入絡(luò)”、“久病必虛”、“久病必瘀”的中醫(yī)理論，結(jié)合臨床實(shí)踐和現(xiàn)代研究，我們認(rèn)為“虛、毒、瘀”是慢性腎臟病的基本病機(jī)，“虛為本，瘀為果，毒為兇”，因此擬定了益氣活血解毒通絡(luò)的中藥治療?；鼋舛局兴幹饕牲S芪、醋鱉甲、地龍、僵蠶、烏梢蛇、丹參、赤芍、黃芩、金銀花、公英、大黃組成。諸藥相伍共奏益氣活血化瘀通絡(luò)，標(biāo)本兼顧之功效。

醛固酮的作用途徑有多種，其中血清和糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)蛋白激酶1(SGK-1)途徑在炎性損傷中最為重要。醛固酮可以刺激SGK-1迅速表達(dá)并上調(diào)，在梗阻性腎病大鼠實(shí)驗(yàn)中，醛固酮活化誘導(dǎo)SGK-1在腎組織中表達(dá)增強(qiáng)，與腎臟炎癥反應(yīng)及纖維化呈正相關(guān)[10]。

巨噬細(xì)胞浸潤并分泌炎性介質(zhì)，刺激細(xì)胞增殖參與腎臟纖維化[11]，有效抑制巨噬細(xì)胞浸潤，對(duì)于減輕腎臟炎性損傷、抑制細(xì)胞增殖有重要意義。巨噬細(xì)胞浸潤過程中，MCP-1發(fā)揮著重要作用。作為單核/巨噬細(xì)胞特異性趨化物和結(jié)合物，MCP-1趨化和激活單核/巨噬細(xì)胞至炎癥部位；還可活化并促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞等固有細(xì)胞分泌炎癥介質(zhì)如IL-1，進(jìn)一步放大炎癥信號(hào)；活化的單核/巨噬細(xì)胞同時(shí)可以分泌腫瘤壞死因子-α(TNF-α)[1]。TNF-α是公認(rèn)的直接炎性因子，在體內(nèi)介導(dǎo)了廣泛的細(xì)胞反應(yīng)，是參與多種生理和免疫過程的重要遞質(zhì)[12]。TNF-α可刺激系膜細(xì)胞表達(dá)黏附分子、血管活性肽等細(xì)胞因子，并刺激成纖維細(xì)胞增生，促進(jìn)膠原纖維的沉積。TNF-α的產(chǎn)生與多種因素有關(guān)，在梗阻性腎病中，其高表達(dá)考慮為醛固酮所介導(dǎo)。

本實(shí)驗(yàn)通過采用UUO方式復(fù)制腎間質(zhì)纖維化模型，激活RAAS系統(tǒng)，誘導(dǎo)醛固酮活化通過巨噬細(xì)胞浸潤介導(dǎo)腎臟炎癥反應(yīng)，給予化瘀解毒中藥和醛固酮受體拮抗劑依普利酮治療后，結(jié)果顯示化瘀解毒中藥可以下調(diào)SGK-1、MCP-1、IL-1、TNF-α等相關(guān)指標(biāo)的表達(dá)，抑制巨噬細(xì)胞浸潤，進(jìn)而抑制梗阻性腎病炎癥反應(yīng)從而達(dá)到減輕腎間質(zhì)纖維化的作用。

本研究主要觀察醛固酮誘導(dǎo)的炎性損傷以及信號(hào)傳導(dǎo)，結(jié)果顯示梗阻性腎病誘導(dǎo)的醛固酮活化通過巨噬細(xì)胞浸潤、介導(dǎo)腎臟炎癥反應(yīng)，參與纖維化進(jìn)展，給予化瘀解毒中藥治療后，炎性細(xì)胞浸潤、炎性介質(zhì)表達(dá)及纖維化程度均得以抑制。

致謝：本實(shí)驗(yàn)主要在河北省中西醫(yī)結(jié)合肝腎病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成，在此對(duì)實(shí)驗(yàn)室的各位老師及同學(xué)的幫助致以衷心的感謝！