孫朝徽，姜秀鳳，張紅濤，趙雅賢，任玉芹，周 勤

(中國水產科學研究院北戴河中心實驗站, 河北秦皇島 066100)

星點東方鲀(Takifuguniphobles)，俗稱龜魚、蠟頭、花龜魚等，屬鲀形目，鲀科，東方鲀屬。分布于太平洋西岸的日本、韓國和我國從渤海到南海的廣泛海域[1-3]。成魚全長約10～17cm，是東方鲀屬中生物個體最小的品種[4]。

星點東方鲀有著獨特、嚴格的半月周期性繁殖習性，這種有規(guī)律和易觀察的自然產卵行為為開展相關研究提供了極大便利[5-6]，因此星點東方鲀也成為了魚類繁殖行為學研究的模式種。日本利用星點東方鲀開展了海水魚生物學相關的系列研究：生殖周期中相關基因的表達研究[7]；河鲀毒素(tetrodotoxin, TTX)的相關研究[8-9]；HAMASAKI等[10]通過冷休克誘導不育3倍體制備魚類生殖細胞移植受體的研究；河鲀由于在脊椎動物中具有最小的基因組而被做為比較基因組學的模式生物[11-12]。緊湊的紅鰭東方鲀(Takifugurubripes)基因圖譜幫助科學家解決了長期以來對人類基因數(shù)量估計的爭論，并且發(fā)掘了近千個人類新基因[13-14]。星點東方鲀與紅鰭東方鲀親緣關系很近, 它們之間的雜交后代成活可育[4]；而相比紅鰭東方鲀2 kg以上的成魚體質量，星點東方鲀成魚的維持成本大大降低；而且星點東方鲀成熟期短，繁殖力強，相比青鳉(Oryziaslatipes)、斑馬魚(Barchydanioreriovar)每次產卵幾十粒，星點東方鲀每次的懷卵量在萬粒以上；星點東方鲀有成熟的育苗程序，且實驗材料容易獲得；因此完全可以替代紅鰭東方鲀用于脊椎動物基因組學研究[15]。小型硬骨魚用作模式生物時，由于其易操作和具有透明的胚胎發(fā)生，長久以來被用于發(fā)育生物學、比較解剖學和生理學的研究[16-18]。目前以魚類為模式生物的主要為小型淡水硬骨魚，尚無海水硬骨魚，星點東方鲀因具有上述優(yōu)勢，具備成為海水魚模式生物的潛質。本研究對北戴河海域種群的星點東方鲀胚胎發(fā)育過程進行詳細的觀察,以期積累星點東方鲀的生物學基礎資料, 為星點東方鲀作為海水魚遺傳生物學和魚類行為學研究的實驗動物提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 受精卵的獲得

2015年6月15-18日，在北戴河老虎石海域收購128尾星點東方鲀親魚，體質量13.60～58.68g(平均為26.88 g)。此時，雄魚大部分可以擠出精液。選取10尾體質量在20 g以上、可擠出精液的雄魚，10尾體質量在25 g以上、體質強壯、腹部飽滿的雌魚，分別暫養(yǎng)在北戴河中心實驗站良種場300 L玻璃鋼水槽中，流水培養(yǎng)。6月19日，雌魚按500 IU·kg-1體質量一次性注射人體絨毛膜促性腺激素HCG后輕擠親魚腹部，獲得成熟卵子和精液，進行干法人工授精。

1.2 卵膜的去除

與其它同屬品種類似，星點東方鲀受精卵為乳白色半透明粘性卵。為了便于觀察其胚胎發(fā)育，按照MIYAKI等[19]的方法去除受精卵的粘膜。將受精卵放入10 L單寧酸溶液(0.05%)中浸泡30s后，用篩網收集清洗放入孵化水槽中。

1.3 胚胎發(fā)育觀察

將去除粘膜的受精卵約1萬粒放入300 L玻璃鋼水槽中。以1～2 L· min-1的速率長流海水以控制水質、用電熱棒(廈門海立方制冷設備有限公司， 鈦合金2kW)控制水溫在20.0～21.0℃。在受精后48 h內，連續(xù)觀察，48 h后至孵化完成每1 h觀察1次。觀察時從孵化水槽用燒杯取卵，在解剖鏡(LEICA M165 FC)下觀察并拍照(LEICA DFC 450C)、記錄。首次觀察到出現(xiàn)形態(tài)特征的時間為劃分胚胎發(fā)育分期時間點。在出膜前期，隨機取100粒發(fā)育正常的受精卵置于500 mL燒杯中，將燒杯置于藻類培養(yǎng)器中，設置與孵化水槽同樣的溫度和光照條件。每1 h觀察計數(shù)孵出的仔魚，并確定不同時間點的孵化率。當50%的受精卵孵化時，確定為初孵仔魚期。

1.4 形態(tài)學特征及分期

為詳細描述星點東方鲀的胚胎發(fā)育，筆者參照暗紋東方鲀(Takifuguobscurus)[20]和模式生物青鳉[21]、斑馬魚[22]的研究成果，確定了星點東方鲀胚胎發(fā)育的主要分期方案和形態(tài)學特征。

2 結果與分析

不同時期受精卵形態(tài)學特征如下：

2.1 卵間隙期(perivitelline space stage)

受精卵呈圓形粘性， 卵黃豐富，呈淡黃色。卵膜較薄， 半透明，卵徑約為756 ～863 μm，平均(814±31)μm。含有大量小顆粒聚集在一起的油球塊，直徑約為卵徑的一半。卵吸水后膨脹不明顯， 形成的卵間隙較小， 約為0.018～ 0.038 mm。(圖版Ⅰ-1)

2.2 胚盤形成期(blastodisc stage)

受精后, 動物極與植物極隨即分化，原生質開始從植物極向動物極聚集，并集中在卵黃表面，形成隆起的胚盤。(圖版Ⅰ-2)

2.3 2細胞期(2-cell)(1 h 40 min)

胚盤對等分裂為2個分裂球。(圖版Ⅰ-3)

2.4 4細胞期(4-cell)(2 h 11 min)

第2次卵裂為經裂，與第1次分裂面相垂直，產生4個體積相等的分裂球。(圖版Ⅰ-4)

2.5 8細胞期(8-cell)(2 h 43 min)

第3次卵裂形成2個卵裂面，都是經裂。與第2次卵裂面垂直，而與第1次卵裂面平行。第3次卵裂形成8個分裂球。(圖版Ⅰ-5)

2.6 16細胞期(16-cell)(3 h 32 min)

第4次卵裂也有2個分裂面， 仍為經裂。圖版Ⅰ-6可見清晰的4個分裂球，說明第4次分裂與第2次分裂面平行，位于兩側，分裂成16個分裂球。

2.7 32細胞期(32-cell)(4 h 17 min)

中部細胞形成2層，可觀察到明顯的邊緣細胞。(圖版Ⅰ-7)

2.8 64細胞期(64-cell)(5 h 9 min)

自32細胞期后，已經不能清楚追蹤細胞分裂狀況，圖版Ⅰ-8根據(jù)發(fā)育分裂進程連續(xù)觀察到由32細胞期到64細胞期過程。與斑馬魚相同，在512細胞期前均為同步1→2的均裂[17]。

2.9 多細胞期(multicellular stage)(5 h 44 min)

經過幾次連續(xù)分裂， 分裂球的數(shù)量越來越多， 體積也越來越小。在卵黃囊上方的分裂球呈現(xiàn)多層。細胞界線仍然清晰可見。(圖版Ⅰ-9)

2.10 桑椹期(morula stage)(6 h 42 min)

(圖版Ⅰ-10)

2.11 高囊胚期(high blastula stage)(8 h 6 min)

卵裂已進行到后期，分裂球的數(shù)目越來越多， 越來越小，細胞界線變得模糊。由它們組成的囊胚層突出在卵黃之上，其高度約為卵徑的1 /4。(圖版Ⅰ-11)

2.12 低囊胚期(low blastula stage)(11 h 37 min)

囊胚層隆起變低，其高度約為卵徑的1/5。邊緣細胞開始下包，囊胚腔清晰可見。細胞大小不均(圖版Ⅰ-12)。這一時期部分胚細胞(blastomeres)開始異步分裂[21]。

2.13 原腸早期(early blastula stage)(13 h 38 min)

沿卵黃囊向下延伸(下包，epiboly)的囊胚層細胞，由于卵黃的阻礙，有大量細胞積聚在囊胚層外周的邊緣，形成胚環(huán)。胚環(huán)向植物極延伸下包達卵徑的1/3。(圖版Ⅰ-13)

2.14 原腸中期(middle gastrula stage)(16 h 13 min)

隨著下包運動的進行，下包達卵徑的1 /2以上。胚環(huán)繼續(xù)增厚，十分清晰。出現(xiàn)胚盾。(圖版Ⅰ-14)

2.15 原腸后期(later gastrula stage)(18 h 56 min)

胚層細胞下包達卵徑的2 /3以上, 胚盾進一步增厚，且繼續(xù)向植物極移動。出現(xiàn)清晰的胚孔。胚體雛形出現(xiàn)。(圖版Ⅰ-15)。

2.16 神經胚期(neurula stage)(22 h 41 min)

胚層細胞下包達卵徑的4 /5以上。胚環(huán)明顯縮小， 卵黃大部分被包圍?？捎^察到胚體背部有一由頭部向后延伸的條狀細胞體，為神經物質增厚凹陷形成的神經溝。(圖版Ⅰ-16)

2.17 胚孔封閉期(blastopore close stage)(25 h 48 min)

胚孔逐漸縮小變得模糊，胚層合攏，胚孔封閉。(圖版Ⅰ-17)

2.18 肌節(jié)出現(xiàn)期(somite stage)(28 h 43 min)

胚體中部出現(xiàn)1～3對肌節(jié)，胚體前端稍膨大隆起為頭部。胚體匍匐在卵黃上，胚體環(huán)繞卵黃囊達2/3(圖版Ⅰ-18)

2.19 眼基出現(xiàn)期(eye rudiment stage )(30 h 33 min)

在胚體頭部兩側出現(xiàn)泡狀結構為眼原基。肌節(jié)3～5對，胚體匍匐在卵黃上，圍繞卵黃約3/4。(圖版Ⅰ-19)

2.20 眼囊期(eye vesicle stage)(32 h 38 min)

頭部之間的卵黃囊開始內陷呈橢圓形眼囊，胚體大為伸展，腦開始分化成前、中、后3個腦泡。(圖版Ⅰ-20)

2.21 嗅板期(flat body stage)(36 h 11 min)

眼囊前下方出現(xiàn)一對近圓形的嗅板。肌節(jié)6～8對。(圖版Ⅰ-21)

2.22 尾芽期(tail bud stage)(38 h 17 min)

胚體后端伸長并突起形成圓錐狀尾芽與卵黃囊游離，脊索開始形成。肌節(jié)增至10～14對。(圖版Ⅰ-22)

2.23 耳囊期(ear vesicle stage)(40 h 31 min)

后腦兩側出現(xiàn)橢圓形耳囊，其中尚無耳石。眼囊中央出現(xiàn)凹陷，并逐漸形成視杯。(圖版Ⅰ-23)

2.24 晶體出現(xiàn)期(lens stage)(42 h 1 min)

視杯擴大，在視杯口出現(xiàn)圓形的晶體，尾尖偏向一邊，明顯與卵黃囊分離。肌節(jié)增至20～22對。胚體圍繞卵黃囊約5/6。(圖版Ⅰ-24)

2.25 肌肉效應期(motility stage)(49 h 40 min)

胚體中后部肌肉開始緩慢的、顫動式的收縮，每分鐘5～8次。晶體已經非常清晰。(圖版Ⅰ-25)

2.26 耳石形成期(otoliths stage)(53 h 31 min)

耳囊中出現(xiàn)2個黑色顆粒狀耳石。胚體中部及卵黃囊上出現(xiàn)星芒狀黑色素細胞(melanophores)。 (圖版Ⅰ-26)

2.27 心臟原基期(heart anlage stage)(58 h 45 min)

胚體頭部腹面和卵黃囊之間出現(xiàn)圓管狀、中間略凹陷的心臟，心臟開始微弱博動。肌節(jié)增至24～30對。尚無血液循環(huán)。(圖版Ⅰ-27)

2.28 血液循環(huán)期(blood circulation stage)(63 h 42 min)

血管在胚體中形成，可見零星的血細胞沿一定的路線緩緩移動。心臟跳動，每分鐘25～68次。胚體圍繞卵黃約1周。(圖版Ⅰ-28)

2.29 眼色素形成期(retinal pigmentation stage)(70 h 5 min)

視網膜出現(xiàn)色素沉著， 眼部逐漸變成黑色，肉眼觀察受精卵可見兩個明顯黑色眼點。胚體及卵黃囊黑色素細胞在增多。(圖版Ⅰ-29)

2.30 胸鰭原基期(pectoral fin bud stage)(75 h 1 min)

耳囊下方出現(xiàn)圓扇形的胸鰭原基。胚體抽搐扭動更趨激烈，達到每分鐘35次。尾尖達到胚體眼部。(圖版Ⅰ-30)

2.31 出膜前期(pre-hatching stage)(88 h 36 min)

卵膜變薄變軟。胚體在膜內由于尾部抽動發(fā)生旋轉，血液循環(huán)清晰可見。(圖版Ⅰ-31)

2.32 孵化期(hatching stage)(99 h 31 min)

由于胚體尾部劇烈擺動，卵膜破裂，仔魚大部分為頭部先出膜，部分尾部先行出膜。隨著尾部擺動加劇，仔魚的整個身體脫離卵膜。初孵仔魚全長(2.10±0.03)mm。(圖版Ⅰ-32)

2.33 初孵仔魚(newly hatched larva)(108 h 31min)

當孵化率達到50%后，確定為整個孵化過程的結束。初孵仔魚全長(2.57±0.11) mm。所有受精卵孵化完成約124 h。

3 討論

3.1 卵徑

星點東方鲀是東方鲀屬內生物個體最小的魚種。本實驗中采用的北戴河種群，其受精卵卵徑為756～863 μm，平均(814±31)μm，明顯小于其它東方鲀屬品種：暗紋東方鲀：1118～1274 μm ,[19]、弓斑東方鲀(T.flavidus)：(1485±41)μm[23]、紅鰭東方鲀：1210～1300 μm[24]、菊黃東方鲀(T.flavidus)990～1010 μm[25]、豹紋東方鲀(T.pardalis)：(1310±30) μm、施氏東方鲀(T.snyderi)：(1000±20) μm、密點東方鲀(T.stictonotus)：(1090±20) μm[26]。而且小于日本星點東方鲀種群(870±20) μm[26]。星點東方鲀在我國沿海均有分布，對不同海域的種群進行形態(tài)學對比研究有助于豐富星點東方鲀的比較基因組學研究成果[3, 27-28]。

3.2 形態(tài)

本研究以暗紋東方鲀[20]為主要參照，結合模式生物魚種----青鳉[20]和斑馬魚[21]的發(fā)育分期，初步建立了以形態(tài)學和組織器官發(fā)生為依據(jù)的星點東方鲀胚胎發(fā)育分期方案。對照暗紋東方鲀及青鳉時發(fā)現(xiàn)：1)在32-cell期觀察到明顯的邊緣細胞(圖版Ⅰ-7)，不同于莫永根等[20]研究的暗紋東方鲀在32-cell期全部為水平分裂，而與青鳉[21]相同，表現(xiàn)為僅中部的 4個細胞水平分裂形成兩個胚層。2)星點東方鲀發(fā)育到肌節(jié)出現(xiàn)期(28 h 43 min)和晶體出現(xiàn)期(42 h 1 min)時，胚體環(huán)繞卵黃囊分別達2/3和5/6(圖版Ⅰ-25)，明顯快于暗紋東方鲀發(fā)育到晶體出現(xiàn)期(65 h 50 min)的2/3[20]和青鳉在胸鰭原基期時還不到2/3[21]。

3.3 發(fā)育進程

不同學者在記錄時采用的時間點存在差異。本實驗以首次觀察到的形態(tài)指標來參照劃分時間點，但孵化結束的時間點采用了與莫永根等[20]相同的標準，即：所觀察樣本中有50%表現(xiàn)出相應發(fā)育期特征為時間點。胚胎發(fā)育分期采用的標準略有不同。在孵化水溫均為20.0～21.0℃的條件下，孵化完成的時間為108 h 31 min，這個結果快于暗紋東方鲀(131 h 15 min)[20]；孵化仔魚開始出現(xiàn)的時間點(99 h 31min)快于紅鰭東方鲀(145 h)(孵化水溫：19.2℃)[29]；特別要指出的，也大大快于日本星點東方鲀種群(144 h)(孵化水溫：20.0～23.0℃)[26]。

圖版-Ⅰ 星點東方鲀胚胎發(fā)育各時期形態(tài)
Plate.Ⅰ Morphological features of embryonic development stages ofTakifuguniphobles
注：b: 囊胚腔; bd: 胚盤; bm: 分裂球; bp: 胚孔; bv: 腦泡 ; ch：絨毛膜; er: 眼基; em, 胚體; es: 胚盾; eve: 耳囊; ev: 眼囊; gr: 胚環(huán); ha:心臟原基; l: 晶體; mc：邊緣細胞; ml: 黑色素細胞； od: 油球; ot: 耳石; pa: 原生質聚集; pf: 胸鰭； ps: 卵周隙; sm: 體節(jié); tb: 尾芽；標尺=200μm
1. 卵間隙期; 2. 胚盤形成期; 3. 2細胞期; 4. 4細胞期; 5. 8細胞期; 6. 16細胞期; 7. 32細胞期; 8. 64細胞期; 9. 多細胞期; 10. 桑椹期; 11. 高囊胚期; 12. 低囊胚期; 13. 原腸早期; 14. 原腸中期; 15. 原腸后期; 16. 神經胚期; 17. 胚孔封閉期; 18. 肌節(jié)出現(xiàn)期; 19. 眼基出現(xiàn)期; 20. 眼囊期; 21. 嗅板期; 22. 尾芽期; 23. 耳囊期; 24. 晶體出現(xiàn)期; 25. 肌肉效應期; 26. 耳石形成期; 27. 心臟原基期; 28. 血液循環(huán)期; 29. 眼黑色素形成期; 30. 胸鰭原基期; 31. 出膜前期; 32. 孵化期; 33. 50%孵化期

Notes: b: blastocele; bd: blastodisc; bm: blastomeres; bp: blastopore; bv: brain vesicles ; ch：chorion; er: eye rudiment; em, embryonic body; es: embryonic shield; eve: ear vesicle; ev: eye vesicle; gr: germ ring; ha:heart rudiment; l: lens; mc：marginal cell; ml: melanophores； od: oil droplet; ot: otolith; pa: protoplasmic accumulation; pf: pectoral fins； ps: perivitelline space; sm: somite; tb: tail bud；bar=200μm

1. perivitelline space stage; 2. blastodisc stage; 3. 22-cell; 4. 4-cell; 5. 8-cell; 6. 16-cell; 7. 32-cell; 8. 64-cell; 9. multi-cell stage ; 10. morula stage; 11. high blastula stage; 12. low blastula stage; 13. Early blastula stage; 14. middle gastrula stage; 15. later gastrula stage; 16. neurula stage; 17. blastopore close stage; 18. somite stage; 19. eye rudiment stage; 20. eye vesicle stage; 21. flat body stage; 22. tail bud stage; 23. ear vesicle stage; 24. lens stage; 25. motility stage; 26. otolith emerge stage; 27. heart anlage stage; 28. blood circulation stage; 29. retinal pigmentation stage; 30. dorsal fin bud stage; 31. pre-hatching stage; 32. hatching stage; 33. 50% hatched