黃曉榮,馮廣朋，劉鑒毅，王 妤，張 濤,趙 峰，章龍珍，莊 平

(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部東海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點實驗室，上海 200090)

魚類精子冷凍保存開始于20世紀(jì)50年代初期，有關(guān)魚類精子的冷凍保存已有許多報道[1-4]。我國已建立了包括“四大家魚”在內(nèi)的淡水魚類精子庫[5-7]，并建立了相關(guān)技術(shù)規(guī)程。在海水養(yǎng)殖魚類方面，也開展了精子冷凍保存技術(shù)的探索[8-11]。精子運(yùn)動性能是判斷精液質(zhì)量與受精能力的關(guān)鍵因素及進(jìn)行人工受精的重要參數(shù)[12]，在生產(chǎn)應(yīng)用及生殖研究方面具有重要的意義。傳統(tǒng)的分析方法是采用顯微鏡觀察后進(jìn)行評估分級，存在較大的主觀性。CASA(computer-aided sperm analysis)，即計算機(jī)輔助精子自動化分析，通過半自動或全自動的方法測得精子運(yùn)動的速度、軌跡和距離等參數(shù)，能夠真正實現(xiàn)對精子運(yùn)動性能的客觀評價[13]。運(yùn)用CASA技術(shù)已開展了幾種魚類和無脊椎動物精子的運(yùn)動性能研究[13-16]，也在人類精液冷凍前后精子的變化研究上進(jìn)行了應(yīng)用[17]，但用于檢測冷凍前后魚類精子運(yùn)動性能變化的對比研究尚未見詳細(xì)報道。

褐牙鲆(Paralichthysolivaceus)屬鰈形目，牙鲆科，牙鲆屬，俗稱片口、比目魚，是近海暖溫性底層魚類，具有生長快、個體大、肉質(zhì)細(xì)嫩鮮美等特征，是名貴的重要海水養(yǎng)殖品種之一[18]。章龍珍等[19]已開展了褐牙鲆精子生理特性及超低溫冷凍保存研究，建立了冷凍保存方法，但未對冷凍前后精子運(yùn)動性能開展評估。本研究運(yùn)用CASA技術(shù)開展冷凍前后褐牙鲆精子運(yùn)動特征的變化研究，旨在為褐牙鲆精子超低溫冷凍保存及精子質(zhì)量檢測提供技術(shù)支撐，為開展重要海水養(yǎng)殖魚類人工繁育提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 精子采集

2016年4月，挑選來源于浙江省海洋水產(chǎn)研究所繁殖用褐牙鲆雄性親本10尾，親本體長(38.25±1.24)cm、體質(zhì)量(1.02±0.26)kg。將親魚從池中撈出后用紗布將魚體表面的水擦干，輕擠壓腹部，用滴管從生殖孔吸取無污染(無血、無水、無糞尿等)的精液放入密封袋內(nèi)，充氧保存于4℃冰盒中帶回實驗室。光學(xué)顯微鏡(Olympus DP71)下觀察精子活力，挑選活力90%以上的精子用于實驗。采集部分精液，用蒸餾水稀釋100倍后，用血球計數(shù)板計數(shù)，在光學(xué)顯微鏡(Olympus DP71)下觀察統(tǒng)計，計算精液的密度。

1.2 精子活力觀察

每隔一段時間從低溫(4 ℃)和室溫(25 ℃)下取出精子，用鹽度31的砂濾海水激活，觀察和記錄精子活力和存活時間。精子活力以激活后視野中運(yùn)動精子占所有精子的百分?jǐn)?shù)表示，存活時間為精子從被激活到90%以上精子停止運(yùn)動的時間。每個處理重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

1.3 精子超低溫冷凍保存

在前期研究基礎(chǔ)上，選取S3液(135 mmol·L-1NaCl+20 mmol·L-1NaHCO3+24 mmol·L-1KCl+1mmol·L-1CaCl2，pH=8)作為精子稀釋液，16%的DMSO作為抗凍劑，形成精子冷凍保存液。精子冷凍保存液在實驗前配制，存于冰箱(4 ℃)中備用。用0.2 mL的塑料離心管保存精子，按精液與抗凍保護(hù)液比1∶1迅速混勻，將裝有混合液的離心管置于液氮面上-20 ℃處平衡1 min后迅速投入液氮中保存。凍精的解凍采用水浴(38 ℃)快速解凍法。解凍后，用砂濾海水(pH為8.0、鹽度為31)激活精子，在顯微鏡下觀察精子活力。

1.4 精子運(yùn)動分析

在室溫下，將5 μL稀釋后的鮮精和凍精(1∶100)與45 μL砂濾海水在干凈載玻片上充分混勻。在混勻后0.5 min、4 min和10 min，參照LINHART 等[20]的方法用CASA系統(tǒng)記錄精子運(yùn)動軌跡和速度等參數(shù)。即通過安裝顯微鏡(BX51， 200×)上并與計算機(jī)聯(lián)接的高敏感的數(shù)碼攝像機(jī)(CCD，DP71)進(jìn)行記錄，每次曝光時間為20 ms，連續(xù)自動曝光30次。精子運(yùn)動的軌跡用配套的自動分析軟件(Image-Pro Plus 5.1)進(jìn)行分析。目標(biāo)精子頭部的運(yùn)動軌跡呈現(xiàn)在計算機(jī)的顯示屏上，并以平面圖形記錄于軟件中。所有數(shù)據(jù)以Excel文件輸出、處理，并計算出精子運(yùn)動的百分?jǐn)?shù)、速度和距離。對于每個樣本，分析50～100個精子。

參考LINHART 等[20]的方法，將褐牙鲆精子運(yùn)動分為4種運(yùn)動類型：運(yùn)動速度大于70 μm·s-1接近直線方式前進(jìn)的為直線運(yùn)動；速度在30～70 μm·s-1之間呈曲線形運(yùn)動的為曲線運(yùn)動；速度在5～30 μm·s-1之間不規(guī)則運(yùn)動的為左右擺動運(yùn)動；運(yùn)動速度小于5 μm·s-1的視為不運(yùn)動。實驗中所涉及的參數(shù)為：

MOT：樣品精液中運(yùn)動精子占精子總數(shù)的百分率(%)；

VCL：精子頭部實際行走的軌跡路徑速度(μm·s-1)；

VSL：精子頭部呈直線移位的前向運(yùn)動速度(μm·s-1)；

VAP：精子沿軌跡曲線行走的平均速度(μm·s-1)；

LIN：精子實際運(yùn)動路線的曲折程度(%)，LIN=VSL/VCL×100。

1.5 統(tǒng)計分析

每個實驗重復(fù)3次，數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示(Mean±SD)，所得數(shù)據(jù)用Statistica中單因子方差分析(ANOVA)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 保存溫度對精子活力和壽命的影響

由圖1可見，低溫下在0～3 d內(nèi)精子活力變化趨于平穩(wěn)，但從4 d開始精子活力快速下降，在6 d時，精子活力降至10%左右，7 d時精子無活力。在室溫下，精子活力也隨時間的延長而逐漸降低，但活力下降速度明顯比低溫下快，4 d時精子無活力。

在室溫與低溫狀態(tài)下，精子壽命均隨著保存時間的延長逐漸縮短(圖2)。室溫下精子的壽命為4 d，低溫下精子的壽命為7 d，與不同溫度下精子的活力變化規(guī)律一致。

圖1 不同保存溫度下褐牙鲆精子活力與時間的關(guān)系Fig.1 Relationships between motility andstoring time of sperm of P. olivaceusunder different temperatures

圖2 不同保存溫度下褐牙鲆精子壽命與時間的關(guān)系Fig. 2 Relationship of longevity and storing time of sperm of P. olivaceus under different temperature

2.2 超低溫冷凍前后褐牙鲆精子運(yùn)動參數(shù)的比較

褐牙鲆鮮精中精子的密度為(1.02±0.08)×1010個·mL-1。鮮精用沙濾海水激活后0.5 min、4 min和10 min，精子的活性分別為(87.74±5.47)%、(71.58±6.19)%和(50.88±11.23)%；凍精用海水激活后0.5 min、4 min和10 min，精子活性分別為(84.00±3.67)%、(59.37±5.21)%、(39.27±8.97)%。鮮精和凍精被激活后，隨著運(yùn)動時間的延長，精子的運(yùn)動狀態(tài)逐漸發(fā)生變化。表1列出了激活后不同時間內(nèi)鮮精和凍精各運(yùn)動參數(shù)的變化。在3種激活時間下，除激活0.5 min時鮮精與凍精的運(yùn)動百分率(MOT)間無顯著差異外(P>0.05)，其它2種激活時間下，鮮精與凍精運(yùn)動百分比間都有顯著性差異(P<0.05)；在3種激活時間下，鮮精與凍精的平均曲線運(yùn)動速度(VCL)、平均直線運(yùn)動速度(VSL)、平均路徑運(yùn)動速度(VAP)和精子運(yùn)動路線的曲折程度(LIN)間都有顯著性差異(P<0.05)。

2.3 褐牙鲆鮮精與凍精運(yùn)動狀態(tài)的變化

圖3和圖4分別顯示了鮮精和凍精激活0.5 min、4 min和10 min后，不同運(yùn)動狀態(tài)精子的數(shù)目變化。鮮精在激活0.5 min時，呈直線運(yùn)動的精子數(shù)占(24.49±3.87)%，呈曲線運(yùn)動的精子數(shù)占(48.53±4.55)%，呈左右擺動型運(yùn)動的精子數(shù)占(24.72±2.86)%，不運(yùn)動的精子所占比例為(2.27±1.22)%。當(dāng)激活的時間延續(xù)到4 min和10 min時，向前直線運(yùn)動的精子數(shù)分別下降到(9.82±2.15)%和(2.16±0.98)% ，而不運(yùn)動的精子數(shù)則分別上升到(5.57±1.46)% 和(9.02±2.38)%。

凍精在激活0.5 min時，呈直線運(yùn)動的精子數(shù)占(18.58±1.33)%，呈曲線運(yùn)動的精子數(shù)占(35.67±3.00)%，呈左右擺動型運(yùn)動的精子數(shù)占(35.24±2.67)%，不運(yùn)動精子所占比例為(10.51±1.33)%。當(dāng)激活后的時間延續(xù)到4 min和10 min時，向前直線運(yùn)動的精子數(shù)分別下降到(2.57±1.45)%和(0.41±0.03)% ，而不運(yùn)動的精子數(shù)則分別上升到(14.43±2.86)%和(19.69±2.74)%。

表1 褐牙鲆鮮精與凍精運(yùn)動參數(shù)比較(Mean±SD，n=5)Tab.1 Comparison of parameter between fresh sperm and post-thawed sperm of P. olivaceus

注：相同激活時間下同列中不同字母表示差異顯著(P<0.05)

Note: Different letters in the same column at the same activation time mean significant differences (P<0.05)

圖3 褐牙鲆鮮精激活0.5、4、10min后不同運(yùn)動形式精子的百分率變化Fig.3 Percentages of fresh sperm of P. olivaceus0.5 min, 4 min and 10 min after activation

圖4 褐牙鲆凍精激活0.5、4、10min后不同運(yùn)動形式精子的百分率變化Fig.4 Percentages of frozen sperm of P. olivaceus0.5 min, 4 min and 10 min after activation

需要說明的是，精子運(yùn)動軌跡的變化是一個連續(xù)的動態(tài)的過程，沒有絕對的界限(圖5)。幾種運(yùn)動方式的劃分也是人為分類的。一個激活后0.5 min向前直線運(yùn)動的精子，延續(xù)到4 min或10 min后可能變成曲線運(yùn)動、左右擺動或不運(yùn)動。事實上，為了更好地分析鮮精和凍精的運(yùn)動狀態(tài)，常把精子運(yùn)動軌跡和運(yùn)動速度結(jié)合起來，綜合判斷精子的運(yùn)動情況。一般地，精子運(yùn)動速度越快，其運(yùn)動軌跡越直；運(yùn)動速度越慢，其運(yùn)動軌跡越彎曲(圖6，圖7)。

圖5 褐牙鲆鮮精激活0.5min時精子運(yùn)動軌跡Fig.5 Trajectory of fresh sperm ofP. olivaceus 0.5 min after activation

圖6 直線運(yùn)動褐牙鲆精子運(yùn)動速度與軌跡Fig.6 Velocity and trajectory of linear motion sperms of P. olivaceus

圖7 擺動運(yùn)動褐牙鲆精子運(yùn)動速度與軌跡Fig.7 Velocity and trajectory of swing sperms of P. olivaceus

3 討論

在魚類的繁殖中精子的質(zhì)量至關(guān)重要。除了精子本身的成熟度外，精子的活力是決定精子受精能力的主要因素，也是判斷精子質(zhì)量的重要指標(biāo)之一[21]。魚類精子在精漿和等滲液中是不動的，但精子離體后由于營養(yǎng)消耗、代謝產(chǎn)物積累、環(huán)境不適等原因會很快死亡。溫度對精子的作用主要通過低溫使精子消耗的ATP減少而延長精子運(yùn)動時間[22]，褐牙鲆精子的短期保存研究也表明，與常溫相比，低溫下精子能保存更長的時間，在4℃下褐牙鲆精子可以保存7d，這也證實了低溫能延長精子的壽命。在開展精子的超低溫冷凍保存研究中，為了提高精子冷凍保存的成活率，必須根據(jù)精漿的成分和滲透壓配制冷凍保存液[23]。在前期研究基礎(chǔ)上，篩選出了S3稀釋液和16%的DMSO作為冷凍保護(hù)液，經(jīng)過冷凍保存后，褐牙鲆凍精的最好活力為(84.00±3.67)%，與鮮精無顯著差異，這一結(jié)果表明篩選出的冷凍保護(hù)液較為適宜。

計算機(jī)輔助精子活力分析系統(tǒng)(CASA)是在包含顯微攝影、顯微圖像分析和熒光顯微技術(shù)等多項技術(shù)和設(shè)備的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的新技術(shù)[24]，此項技術(shù)最初是應(yīng)用在男性生殖學(xué)研究中，此后隨著技術(shù)的發(fā)展和完善逐漸被運(yùn)用于其它哺乳動物精子活力檢測中[25-27]。COSSON 等[28]首次使用頻閃觀測儀和錄像的方法對鮭魚的精子運(yùn)動進(jìn)行了描述。隨著這項技術(shù)的成熟，近年來，CASA技術(shù)已在魚類和無脊椎動物精子活力檢測上進(jìn)行了廣泛應(yīng)用[15, 28-29]。本文采用CASA技術(shù)對冷凍前后褐牙鲆精子運(yùn)動性能進(jìn)行了檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)鮮精和凍精隨激活時間的延長活力均逐漸下降，除了在激活最初的0.5min鮮精與凍精活力間無顯著差異外，其它激活時間兩者間均有顯著差異。此外，隨激活時間的延長，鮮精與凍精的VCL、VSL、VAP和LIN都呈逐漸下降的趨勢，在不同的激活時間下兩者間都有顯著性差異，表明激活時間的長短對褐牙鲆精子運(yùn)動性能有顯著影響，在開展褐牙鲆人工繁殖及授精實驗中精子激活時間最好集中在30s以內(nèi)。

與其它魚類精子和無脊椎動物精子相比，褐牙鲆精子運(yùn)動也可以分為向前直線運(yùn)動、弧形直線運(yùn)動、左右擺動和不運(yùn)動4種類型[12]。褐牙鲆鮮精在激活0.5min的平均運(yùn)動速度為(55.94±13.88)μm·s-1，低于虹鱒(Oncorhynchusmykiss)精子平均運(yùn)動速度77 μm·s-1[28]，略高于青島文昌魚(Branchiostomabelcheritsingtauens)精子平均運(yùn)動速度(46.00±32.60)μm·s-1[15]。褐牙鲆鮮精和凍精被激活后隨時間的延長，精子的運(yùn)動方式發(fā)生了明顯改變，向前直線運(yùn)動的精子逐漸變?yōu)榛⌒吻€運(yùn)動，原本曲線運(yùn)動的精子則變?yōu)樽笥覕[動，而左右擺動的精子變成不運(yùn)動，這種運(yùn)動方式的改變可能與細(xì)胞內(nèi)貯存的能量被逐漸耗盡有關(guān)[30]。

在對黃鰭石鮰(Noturusflavipinnis)、鯉(Cyprinuscarpio)、舌齒鱸(Dicentrarchuslabrax)和湖鱘(Acipenserfulvescens)精子的研究中發(fā)現(xiàn)，最重要的參數(shù)是精子的VCL和VSL[14,28,32]，本文對褐牙鲆精子的研究也表明，隨著激活時間的延長，褐牙鲆鮮精和凍精的VCL和VSL都發(fā)生了較大變化。另一個與精子運(yùn)動速度有關(guān)的參數(shù)是精子的VAP，有學(xué)者認(rèn)為它在魚類精子參數(shù)分析中不重要，因為魚類精子總是在一個方向上做平滑的曲線運(yùn)動。因此，認(rèn)為魚類的VAP和VCL基本相同[31-33]；但另有學(xué)者則認(rèn)為VAP和VCL同樣重要。在對花狼魚(Anarhfminor)和棘魚(Acanthodiiaculeatus)精子的研究中發(fā)現(xiàn)，由于這兩種魚精子要在膠體滲透壓很高的激活液中運(yùn)動，激活液所產(chǎn)生的阻力迫使精子的運(yùn)動軌跡呈飄逸狀，因此，VAP和VCL產(chǎn)生了很大的差異[34-35]。柳凌等[30]對4種鱘魚精子的研究也發(fā)現(xiàn)VAP和VCL有很大差異，分析認(rèn)為魚類精子的VAP和VCL是否有差異主要取決于精子的體積和形狀、精子運(yùn)動速度、精子運(yùn)動方式以及精子在激活液中所受到的阻力，精子在運(yùn)動過程中所受的阻力很大，則迫使精子做不規(guī)則的飄逸運(yùn)動。對人類精液冷凍前后的CASA分析表明，超低溫冷凍后，反映精子運(yùn)動速度的參數(shù)如VAP、VSL、VCL都有不同程度的下降[17]。本研究中，褐牙鲆鮮精和凍精在相同的激活時間下，VAP和VSL相差不大，這可能是因為褐牙鲆精子的體積小，精漿滲透壓低，對精子運(yùn)動的阻力小。此外，由于褐牙鲆精子的密度較高，激活后的精子相互間容易發(fā)生碰撞(從激活0.5 min時鮮精和凍精MOT差異不顯著可以看出)，不容易形成長的平滑的運(yùn)動曲線，因而造成VAP和VCL差異不顯著。