李媛媛，王珊珊，郭曉雨，崔宇通，王云慧，王儒曉，李釗霞，蔡建平，張運發(fā)，曲江勇

(1. 煙臺大學生命科學學院，山東煙臺 264005; 2. 煙臺大學數(shù)學與信息科學學院，山東煙臺 264005)

生態(tài)遺傳研究核心問題是探究生物在其分布邊界的環(huán)境中形態(tài)、遺傳變異趨勢與規(guī)律[1-2]，環(huán)境是種群遺傳進化的一個重要因素，物種的分布、行為、生理與遺傳分化受環(huán)境因子的影響顯著[3]。生物形體變異是受環(huán)境影響最顯著的生理學和生態(tài)學特征指標[4]，空間尺度上的種內(nèi)地理變異反映了物種適應當?shù)丨h(huán)境變異趨向[5]，貝格曼定律假定寒冷地區(qū)的同種體型較溫暖地區(qū)的更小[6]，此理論同時適用于恒溫動物[7]和外溫動物[8]。研究發(fā)現(xiàn)多變量形態(tài)度量學方法比傳統(tǒng)的形態(tài)學分析方法在反映形態(tài)差異方面更有效[9]，目前在海洋生物生態(tài)遺傳研究領(lǐng)域上應用廣泛[10]。在形態(tài)學差異反映種群間的遺傳差異基礎上，還需結(jié)合遺傳變異等共同研討種群遺傳分化等問題，PEPIN[11]認為基于形態(tài)特征來進行種群的研究必須通過遺傳學證據(jù)予以進一步證明，通過形態(tài)標記、遺傳標記來共同闡明種群間的形態(tài)與遺傳變異、種群間連續(xù)或隔離模式以及受環(huán)境、氣候因子影響的種群分化是目前生態(tài)遺傳研究的主要方法[11]。生物在適應環(huán)境過程中DNA、RNA均會隨生態(tài)環(huán)境而變化，致使形態(tài)、遺傳產(chǎn)生變異[12]。

DNA序列是可以直接從核苷酸序列上分析遺傳變異的遺傳標記，目前已廣泛用于解決動物生態(tài)遺傳等問題[13]。動物線粒體DNA (mt DNA)具有分子量小、進化速度快、結(jié)構(gòu)簡單、表現(xiàn)為母系遺傳等特點，其中細胞色素c氧化酶亞基I (COI)基因突變速度較快且進化速率適中，可用于種群水平的遺傳多樣性分析[14]。

矮擬帽貝(Patelloidapygmaea)屬于軟體動物門(Mollusca)笠貝科(Acmaeidae)[15]，中國海沿岸習見種。該種普遍分布于海岸帶以上到淺層潮下帶的整個潮間帶，營附著生活，適宜生存的環(huán)境因子跨度大，受古地理歷史事件及現(xiàn)今環(huán)境、氣候因子影響明顯，是研究種群生態(tài)遺傳的模式物種[16-18]。目前矮擬帽貝研究主要集中在系統(tǒng)學和分類學等領(lǐng)域[19]，對現(xiàn)今環(huán)境因子影響的遺傳進化和形態(tài)變異并未得到進一步的研究[20]。本研究選取矮擬帽貝線粒體基因COI序列作為分子標記，探究環(huán)境因子對矮擬帽貝遺傳多樣性的影響，以期對中國海矮擬帽貝種群遺傳多樣性研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 采樣及測序

矮擬帽貝采集于中國海13個地域137個個體(圖1)，于無水乙醇中保存；并測量其形態(tài)量度[殼長(length,L)、殼寬(width,W)、殼高(height,H)、殼周長(perimeter,P)、短斜邊(short hypotenuse,SH)、長斜邊(long hypotenuse,LH)、干重(dry weight,DW)、壁厚(wall thickness,WT)]并計算頭端角度(headend angle,HA)與尾端角度(end angle,EA)(表1，部分形態(tài)數(shù)據(jù)參考之前已發(fā)表論文[21])。

總DNA提取采用DNeasy?組織&血液試劑盒(GTIN：04053228006077，Lot：151046088，GIAGEN，德國)。使用COI通用引物進行PCR擴增(華大基因合成)，COIForward：5-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3;COIReverse：5-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3[22]，25 μL的PCR擴增反應體系。PCR反應條件設置：94°C預變性2 min；94°C變性30 s，42°C退火40 s，72°C延伸50 s，35個循環(huán)；72°C延伸5 min。反應結(jié)束后利用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。PCR產(chǎn)物進行ABI PRIMS 3730雙向測序。

1.2 環(huán)境因子

獲取采樣地近30年氣象數(shù)據(jù)[年平均氣壓(annual average pressure,AAP)、年平均氣溫(annual average temperature,AAT)、年平均降水量(annual average precipitation,AAPR)、日照百分率(sunshine percentage,SP)、日照時數(shù)(sunshine hours,SS)、年平均水汽壓(annual average vapor pressure,AAVR)]并計算各因子變異系數(shù)[年平均氣壓變異系數(shù)(annual average pressure variation coefficient,VAAP)、年平均氣溫變異系數(shù)(annual average temperature variation coefficient,VAAT)、年平均降水量變異系數(shù)(annual average precipitation variation coefficient,VAAPR)、日照百分率變異系數(shù)(sunshine percentage variation coefficient,VCSP)、日照時數(shù)變異系數(shù)(sunshine hours variation coefficient,VCSS)、年平均水汽壓變異系數(shù)(annual average vapor pressure variation coefficient,VAAVR)]，數(shù)據(jù)來源中國氣象數(shù)據(jù)共享服務網(wǎng)(http://data.cma.cn/)并參考已發(fā)表論文[21]及各地的經(jīng)度(longitude,LO)和維度(latitude,LA)。

1.3 統(tǒng)計分析

為排除個體生長周期等因素對研究結(jié)果的影響，以樣本干重為基數(shù)換算各形態(tài)量度相對值，并統(tǒng)計計算平均數(shù)與標準差，通過SPSS 20.0[23]計算如下數(shù)據(jù)，單因素方差分析(ANOVA)測平均數(shù)差別的顯著性檢驗、正態(tài)分布檢驗(Kolmogorov-Smirnov test)判斷數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布、形態(tài)變異主成分分析提取主成分及與環(huán)境因子相關(guān)性分析衡量兩個變量因素的相關(guān)密切程度。

1.4 序列分析

得到的測序結(jié)果利用Conting軟件進行拼接；CLUSTAL_X 1.83進行序列比對；DnaSP v5[24]獲得單倍型信息；ARLEQUIN 3.5[25]軟件計算群體遺傳多樣性指數(shù)；MEGA7計算序列變異(S)[26]。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)變異分析

中國海13個地域137個個體的相對形態(tài)量度ANOVA分析結(jié)果顯示各形態(tài)量度差異均為顯著。主成分分析提取L/DW(92.21%)、W/DW(5.72%)、H/DW(1.60%)為形態(tài)變異主成分(表2)，將其與樣本量進行Pearson檢驗，提取的主成分均不受樣本量影響，因此形態(tài)變異主成分可作為該物種形態(tài)變異的指標。

2.2 序列變異與遺傳多樣性

137個矮擬帽貝個體線粒體DNACOI部分序列(601bp)堿基含量：A： 24.10%、T： 37.27%、C： 16.53%、G： 22.10%，共發(fā)現(xiàn)217個多態(tài)位點，轉(zhuǎn)換顛換比為1.25，無插入/缺失，界定30個單倍型，占樣本總數(shù)的21.89%。AMOVA結(jié)果顯示，矮擬帽貝遺傳變異主要來源于種群間(89.57%，P<0.001)。各種群遺傳多樣性比較顯示，汕頭(ST)種群呈現(xiàn)較高的遺傳多樣性，威海(WH)種群呈現(xiàn)較低的遺傳多樣性(表3)。對COI分子標記的遺傳多樣性指數(shù)進行圖示法和正態(tài)分布檢驗，所有遺傳多樣性指數(shù)都服從正態(tài)分布。與樣本量之間的相關(guān)性分析結(jié)果顯示，各多樣性指數(shù)均不受個體數(shù)量的影響(P>0.05)，正態(tài)分布檢驗和相關(guān)性分析的結(jié)果說明此數(shù)據(jù)可以用于表示各地理種群的遺傳多樣性高低。

2.3 遺傳多樣性和形態(tài)量度與環(huán)境因子的相關(guān)性分析

統(tǒng)計13個采樣地的環(huán)境因子(表4)并進行正態(tài)分布檢驗，結(jié)果表明所有數(shù)據(jù)均為正態(tài)分布，具有統(tǒng)計學意義。遺傳多樣性與環(huán)境因子相關(guān)性分析結(jié)果表明(表5)，矮擬帽貝種群單倍型多樣性、核苷酸多樣性以及序列變異與緯度、年平均氣溫變異系數(shù)、年平均降水量變異系數(shù)、日照百分率及日照時數(shù)呈顯著負相關(guān)(P<0.05)，

與年均氣溫、年均降水量及年均水汽壓呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。

圖1 矮擬帽貝采樣圖Fig.1 Sampling map of P. pygmaea注：“()”內(nèi)為采樣數(shù)量；JZ：錦州；ZH：莊河；DL：大連；YT：煙臺；WH：威海；QD：青島；LYG：連云港；ZS：舟山；XM：廈門；ST：汕頭；MM：茂名；ZJ：湛江；BH：北海Note: Value in “()” is sampling number； JZ: Jinzhou; ZH: Zhuanghe; DL: Dalian; YT: Yantai; WH: Weihai; QD: Qingdao; LYG: Lianyungang; ZS: Zhoushan; XM: Xiamen; ST: Shantou; MM: Maoming; ZJ: Zhanjiang; BH: Beihai

表1 矮擬帽貝形態(tài)數(shù)據(jù)的平均數(shù)(標準差)Tab.1 Mean values (standard deviation) of the morphological data of P. pygmaea populations

注：JZ：錦州；ZH：莊河；DL：大連；YT：煙臺；WH：威海；QD：青島；LYG：連云港；ZS：舟山；XM：廈門；ST：汕頭；MM：茂名；ZJ：湛江；BH：北海

Note: JZ: Jinzhou; ZH: Zhuanghe; DL: Dalian; YT: Yantai; WH: Weihai; QD: Qingdao; LYG: Lianyungang; ZS: Zhoushan; XM: Xiamen; ST: Shantou; MM: Maoming; ZJ: Zhanjiang; BH: Beihai

表2 矮擬帽貝形態(tài)變異的主成分分析Tab.2 Principal component analysis of P. pygmaea morphological variations

注：JZ：錦州；ZH：莊河；DL：大連；YT：煙臺；WH：威海；QD：青島；LYG：連云港；ZS：舟山；XM：廈門；ST：汕頭；MM：茂名；ZJ：湛江；BH：北海

Note: JZ: Jinzhou; ZH: Zhuanghe; DL: Dalian; YT: Yantai; WH: Weihai; QD: Qingdao; LYG: Lianyungang; ZS: Zhoushan; XM: Xiamen; ST: Shantou; MM: Maoming; ZJ: Zhanjiang; BH: Beihai

表3 矮擬帽貝的遺傳多樣性(標準差)Tab.3 Genetic diversity of P. pygmaea(standard deviation)

注：JZ：錦州；ZH：莊河；DL：大連；YT：煙臺；WH：威海；QD：青島；LYG：連云港；ZS：舟山；XM：廈門；ST：汕頭；MM：茂名；ZJ：湛江；BH：北海

Note: JZ: Jinzhou; ZH: Zhuanghe; DL: Dalian; YT: Yantai; WH: Weihai; QD: Qingdao; LYG: Lianyungang; ZS: Zhoushan; XM: Xiamen; ST: Shantou; MM: Maoming; ZJ: Zhanjiang; BH: Beihai

表4 13個矮擬帽貝地理種群近30年環(huán)境因子的平均值(標準差)Tab.4 Average values of environmental factors of 13 P. pygmaea populations in 30 years(standard deviation)

注：JZ：錦州；ZH：莊河；DL：大連；YT：煙臺；WH：威海；QD：青島；LYG：連云港；ZS：舟山；XM：廈門；ST：汕頭；MM：茂名；ZJ：湛江；BH：北海

Note: JZ: Jinzhou; ZH: Zhuanghe; DL: Dalian; YT: Yantai; WH: Weihai; QD: Qingdao; LYG: Lianyungang; ZS: Zhoushan; XM: Xiamen; ST: Shantou; MM: Maoming; ZJ: Zhanjiang; BH: Beihai

表5 矮擬帽貝遺傳多樣性和形態(tài)量度與環(huán)境因子的相關(guān)性分析Tab.5 Relationship correlation between genetic diversity and morphology of P. pygmaea and environmental factors

注：*:P<0.05;**:P<0.01.

Note:*:P<0.05;**:P<0.01.

形態(tài)變異與環(huán)境因子相關(guān)性分析結(jié)果表明，主成分L/DW、W/DW、H/DW與年均降水量呈顯著負相關(guān)(P<0.05)。

3 討論

中國海矮擬帽貝各地理種群的COI序列研究表明，矮擬帽貝的單倍型多樣性(0.200～0.867)較高且核苷酸多樣性(0.000 7～0.091 4)較低，這一結(jié)果與GRANT等[27]提出的海洋類生物結(jié)果相符，說明該類型種群可能經(jīng)歷過歷史擴張事件。

遺傳結(jié)構(gòu)分化和自然環(huán)境變遷之間的相互作用導致生活在不同環(huán)境下的矮擬帽貝存在地理變異[28-29]。環(huán)境因子對生物進化的影響顯著，溫度和降水量則是影響物種進化的兩個最重要的環(huán)境因子[30]。

溫度是貝類存活、生長、免疫、代謝的關(guān)鍵環(huán)境因子[31]，研究發(fā)現(xiàn)太平洋牡蠣(Crassostreaglgas)、華貴櫛孔扇貝(Chlamysnobilis)、蝦夷扇貝(Mizuhopectenyessoensis)、馬氏珠母貝幼蟲(Pinctadamartensii)、櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)等遺傳變異、分化均受氣候變暖影響顯著[32-33]；海洋其它類生物研究發(fā)現(xiàn)，高溫脅迫下紫色球海膽(Strongylocentrotuspurpuratus)蛋白代謝基因和信號傳導基因的改變致使產(chǎn)生遺傳分化[34]，原綠球藻(Prochlorococcus)因生存溫度不同，垂直分布的不同種群間遺傳結(jié)構(gòu)存在差異且溫度越高遺傳多樣性越高[35]。矮擬帽貝遺傳多樣性與環(huán)境因子相關(guān)性分析表明，年均氣溫越高，種群遺傳多樣性越高，且隨緯度的降低而升高。由此推測矮擬帽貝主要以巖石海床為棲息地，溫度是影響物種代謝及性成熟的直接因素，繼而影響種群遺傳多樣性，簡而言之，溫度越穩(wěn)定遺傳多樣性越高，這與其它軟體動物生態(tài)研究結(jié)果基本一致[36]。

矮擬帽貝遺傳多樣性與年均降水量、年均水汽壓呈顯著正相關(guān)，與日照百分率、日照時數(shù)呈顯著負相關(guān)。降水量是影響生物遺傳變異的另一重要因子[37]，降水量直接反應空氣環(huán)境中水分含量，水汽壓間接代表大氣中水汽含量，大氣中水汽含量多時，水汽壓越大[38]；且日照越強，大氣水汽含量越低，說明空氣中水汽含量可能是影響矮擬帽貝遺傳多樣性的重要因素。矮擬帽貝作為潮間帶生物，其生境可能更適于空氣水分含量高的環(huán)境；且日照時數(shù)越短，遺傳多樣性越高，說明較退潮時裸露的日照環(huán)境，矮擬帽貝更趨向于海面下生存。另一種解釋則為降水直接影響到矮擬帽貝生活區(qū)域的海水鹽度，產(chǎn)生外界壓力導致物種基因進化速率產(chǎn)生分歧。海水鹽度是影響海洋生物生存生長至關(guān)重要的環(huán)境因子，受緯度(正相關(guān))、降水量(負相關(guān))、水氣壓(負相關(guān))等多種因素的調(diào)節(jié)[39]。貝類生物對環(huán)境壓力和環(huán)境鹽度變化的適應性較差，環(huán)境因子可影響其生長發(fā)育進而導致遺傳分化。SORIA等[40]的研究顯示，隨著鹽度逐漸升高，智利扇貝(Argopectenpurpuratus)稚貝的氧循環(huán)和氮循環(huán)基因隨之發(fā)生改變，導致遺傳分化。由此得出鹽度可以影響貝類能量和滲透壓的變化。研究表明，在鹽脅迫下貝類需要依靠能量代謝來維持體內(nèi)滲透壓的平衡，但是，鹽度超出自身滲透壓調(diào)節(jié)的范圍，貝類的死亡率會升高[41]。外界非生物環(huán)境因素傾向于比內(nèi)源的因素(如機體發(fā)育)變化更快，研究表明外源環(huán)境因素比內(nèi)源機體因素更能促進遺傳表達分化[42]。矮擬帽貝遺傳多樣性隨緯度的降低而升高，與上述海水鹽度(緯度與海水鹽度呈正相關(guān))降低導致遺傳多樣性升高結(jié)果一致，且從地理位置來看南部種群具有比北部種群有更深的遺傳譜系、更高的遺傳多樣性。

海洋生物地理種群間的形態(tài)變異受到遺傳因子和棲息地氣候因子的雙重影響[43]，且形態(tài)量度主成分與年均降水量變異系數(shù)呈顯著負相關(guān)，說明降水量是影響形態(tài)變異的主要因素，作為潮間帶物種，落潮期暴露在空氣中，受雨水的沖刷腐蝕導致形態(tài)產(chǎn)生差異，同時降水對生活區(qū)的水體鹽濃度影響會導致攝食的變化而使形態(tài)產(chǎn)生差異。相對形態(tài)量度和其它環(huán)境因子的相關(guān)性分析表明其趨勢與遺傳分析的結(jié)果基本一致[44]，與個別環(huán)境因子相關(guān)性趨勢存在差異，其主要原因是自然選擇導致物種基因遺傳與形態(tài)變異的模式不同[45]。在穩(wěn)定的環(huán)境中，自然選擇壓力的降低可以最大限度地保留基因型，遺傳多樣性升高；在不穩(wěn)定的環(huán)境中，保留的種群適應多變環(huán)境，在選擇壓力下其有利的基因型被保留，遺傳多樣性則降低。