李秀軍， 張雨凝， 張玉珊， 雷婷

貴陽中醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院(貴州貴陽 550001)

白血病多藥耐藥(multidrug resistance,MDR)是白血病化療失敗和復(fù)發(fā)的主要原因之一。目前很多西藥如維拉帕米、奎尼丁、環(huán)孢菌素A等均具有一定的耐藥逆轉(zhuǎn)作用，但當(dāng)這些藥物與其轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白底物相結(jié)合時(shí)，可能會(huì)導(dǎo)致正常細(xì)胞和組織對(duì)化療藥物的自我保護(hù)作用下降，產(chǎn)生毒性不良反應(yīng)，從而限制了該類藥物在臨床上的運(yùn)用[1]。中藥具有資源豐富、作用靶點(diǎn)廣泛、毒性不良反應(yīng)小的優(yōu)勢(shì)，成為耐藥逆轉(zhuǎn)劑研究的熱點(diǎn)，但目前對(duì)中藥逆轉(zhuǎn)劑的研究或?yàn)榍鍩峤舛?、或?yàn)橐鏆怵B(yǎng)陰，而將二者相結(jié)合的扶正祛邪法作為逆轉(zhuǎn)劑的研究幾乎空白。對(duì)耐藥機(jī)制的研究也集中在對(duì)p糖蛋白、Bcl-2等指標(biāo)的影響，而對(duì)耐藥細(xì)胞凋亡率的影響的研究比較少。而MDR形成的中醫(yī)病機(jī)主要為“伏邪留于陰分”，治療上需使陰分之邪透出于陽分，方可達(dá)到扶正祛毒之功。本課題率先將養(yǎng)陰透邪與清解毒邪相結(jié)合，以扶正祛邪法逆轉(zhuǎn)MDR，并通過檢測(cè)凋亡率探討其逆轉(zhuǎn)機(jī)制。在臨床工作中，課題組也發(fā)現(xiàn)扶正祛邪法能有效減輕化療不良反應(yīng)、提高臨床療效及患者生存質(zhì)量、延長生存期[2-3]。筆者自2015年5月至2017年5月期間，以體外實(shí)驗(yàn)的方式觀察了扶正祛邪中藥復(fù)方含藥血清對(duì)人慢性粒細(xì)胞白血病急變期耐藥細(xì)胞K562/A02的抑制率以及凋亡率的表達(dá)的影響，實(shí)驗(yàn)運(yùn)用MTT法檢測(cè)含藥血清對(duì)K562/A02細(xì)胞的抑制率，并以流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)該細(xì)胞凋亡的情況，結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株 人慢性粒細(xì)胞白血病急變期耐藥細(xì)胞株K562/A02(購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院上海細(xì)胞庫)。

1.2 藥品及試劑 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑(AnnexinV-FITC):InvitrogenCorportation。阿霉素配制液(ADM)：10 mg/支，3 mL滅菌雙蒸水加入瓶中，待藥物充分溶解后，加入到盛有97 mL的無菌雙蒸水的玻璃瓶中，所配制液體濃度100 μg/mL，分裝后于4℃環(huán)境下保存。干擾素配制液：300萬U/瓶，3 mL滅菌雙蒸水加入到瓶中，使藥物充分溶解后，加入到盛有97 mL的無菌雙蒸水的玻璃瓶中，使其終濃度為3萬U/mL，分裝后于4℃環(huán)境下保存。扶正祛邪中藥復(fù)方(由貴陽中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院制劑室制備成中藥濃縮劑，每毫升含1 g生藥)主要成分：人參20 g，黃芪30 g，麥冬15 g，五味子15 g，青黛10 g(包煎)，白花蛇舌草30 g等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將細(xì)胞株K562/A02置于37℃、5%CO2條件下，接種于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，在培養(yǎng)體系中加入濃度為1 μg/mL的ADM維持其耐藥性，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，2～3 d傳代1次，并更換細(xì)胞液。

1.3.2 含藥血清的制備[4]將28只新西蘭大白兔[體重(3.5±0.5)kg，購于重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司]。隨機(jī)分成空白對(duì)照組和低、中、高劑量實(shí)驗(yàn)組，每組7只，以扶正祛邪復(fù)方中藥液灌服，低劑量組灌服3 g(生藥)/kg(體重)中藥液、中劑量組灌服6 g/kg中藥液、高劑量組灌服12 g/kg中藥液，連續(xù)灌胃3 d，每天灌胃2次，空白對(duì)照組正常喂養(yǎng)，于最后一次給藥2 h后，在無菌條件下取股動(dòng)脈血，分離采集血清，同組血清混合，使用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，置于-20℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 MTT法檢測(cè)不同劑量含藥血清對(duì)K562/A02細(xì)胞的抑制率 將含藥血清分為3組：高劑量含藥血清組(HD組)、中劑量含藥血清組(MD組)，低劑量含藥血清組(LD組)。將處于對(duì)數(shù)生長期的K562/A02細(xì)胞離心，棄上清，培養(yǎng)液重懸細(xì)胞后，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×105/mL，每個(gè)孔放置180 μL，將細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中。含藥血清組每孔中加入不同劑量含藥血清20 μL；以不含藥正常培養(yǎng)的K562/A02細(xì)胞作為對(duì)照組，使每孔終體積為200 μL，每組均需設(shè)3個(gè)平行孔，每板需加入RPMI-1640、生理鹽水作為空白調(diào)零孔，其目的是為了矯正其他孔的檢測(cè)值；為排除邊緣效應(yīng)，周邊孔均加入200 μL的生理鹽水。將96孔板置于37℃，5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，72 h后每孔加入MTT配置液20 μL，配置液的濃度為5 mg/mL，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。4 h后取出離心，去上清。每孔加入二甲基亞砜(DMSO)150 μL，完畢后放置于搖床上低速振蕩10 min，使每孔中的結(jié)晶物得以充分溶解。全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定各孔吸光度值(OD)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，據(jù)上述實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，細(xì)胞抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組平均OD/對(duì)照組平均OD)×100%。

1.3.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)經(jīng)含藥血清處理后K562/A02細(xì)胞的凋亡率 分組：(1)高劑量含藥血清+ADM組(HD+ADM組)；(2)中劑量含藥血清+ADM組(MD+ADM組)；(3)低劑量含藥血清+ADM組(LD+ADM組)；(4)陰性對(duì)照組：空白兔血清+ADM組(NS+ADM組)；(5)陽性對(duì)照組：干擾素+ADM組(IFN+ADM組)。

將處于對(duì)數(shù)生長期的K562/A02用細(xì)胞培養(yǎng)液制成1×106/mL的細(xì)胞懸液，接種于24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)組中加入高、中、低劑量含藥血清進(jìn)行培養(yǎng)，陰性對(duì)照組中加入空白兔血清培養(yǎng)，陽性對(duì)照組加入干擾素培養(yǎng)[5]，每組均設(shè)3個(gè)平行孔，每組適應(yīng)性培養(yǎng)6 h后均加入不同濃度的ADM 20 μL。培養(yǎng)24、48、72 h后收集細(xì)胞，將細(xì)胞轉(zhuǎn)入EP管中，離心(2 000 r/min，5 min)，棄上清，4℃PBS洗2次，調(diào)節(jié)其密度為1×106/mL，加入5 μL AnnexinV-FITC混合后，加入5 μL碘化丙啶(PI)混勻，取100 μL上述細(xì)胞懸液于5 mL流式管中，室溫避光反應(yīng)15 min，上機(jī)檢測(cè)得出相應(yīng)的細(xì)胞凋亡百分率。

2 結(jié)果

2.1 MTT法檢測(cè)不同劑量含藥血清對(duì)K562/A02細(xì)胞的抑制率 細(xì)胞的抑制率為高劑量含藥血清組>中劑量含藥血清組>低劑量含藥血清組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表1。

組別OD值抑制率(%)對(duì)照組6.951 4±0.002 3 HD組2.780 0±0.001 160.015 0±0.048 6??MD組4.030 2±0.003 442.175 1±0.095 4?LD組4.650 1±0.001 330.769 5±0.036 9?

與對(duì)照組比較 *P<0.05, **P<0.01

2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)含藥血清對(duì)K562/A02細(xì)胞凋亡率的影響 K562/A02經(jīng)扶正祛邪中藥復(fù)方含藥血清處理72 h后流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡所見圖1。

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示各組在24 h的凋亡率較低，在72 h后的凋亡率最高。各組間在72 h后進(jìn)行比較：HD+ADM組>干擾素+ADM組>MD+ADM組>LD+ADM組>NS+ADM組，具體見表2。

3 討論

多藥耐藥的白血病患者一般經(jīng)歷了多次聯(lián)合化療的攻伐，精氣耗傷嚴(yán)重，患者多表現(xiàn)為氣血陰陽虛損，無力祛邪外出。而由于化療藥物的局限性，白血病細(xì)胞并不能完全消除，伏留于人體血脈、骨髓等至陰之分，形成所謂“伏毒”。周仲瑛指出“伏毒”即是邪毒潛藏于人體某個(gè)部位，其病理特性為伏而不覺、發(fā)時(shí)始顯，具有表現(xiàn)隱伏、纏綿、暗耗、毒性猛烈、病情危重、遷延難愈等臨床特點(diǎn)[6-7]。這與多藥耐藥導(dǎo)致的白血病緩解率低、復(fù)發(fā)率高、預(yù)后較差等特點(diǎn)相一致。因而白血病多藥耐藥患者的病理狀態(tài)為正氣虧虛、臟腑功能失調(diào)而余毒留伏陰分。黃禮明等[8]認(rèn)為余毒留伏陰分，清熱解毒之品對(duì)陽分邪毒有效，對(duì)于陰分邪毒卻能力有限，難達(dá)病所，而單純的扶正培本之品難以托毒外出，故應(yīng)以扶正祛邪為治療原則，結(jié)合養(yǎng)陰透邪和清解毒邪之品，使陰分之邪透出于陽分，再行祛毒之劑以收祛毒之功。

目前對(duì)中藥逆轉(zhuǎn)劑的研究或?yàn)榍鍩峤舛?、或?yàn)橐鏆怵B(yǎng)陰，[9-10]，而將二者相結(jié)合的扶正祛邪法作為逆轉(zhuǎn)劑的研究較少。對(duì)耐藥機(jī)制的研究也集中在對(duì)p糖蛋白、Bcl-2等指標(biāo)的影響，而對(duì)耐藥細(xì)胞凋亡率的影響的研究比較少。在白血病多藥耐藥發(fā)生機(jī)制中，細(xì)胞凋亡受抑是多藥耐藥化療失敗的重要機(jī)制之一，因此如何誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡對(duì)逆轉(zhuǎn)多藥耐藥具有重要的意義[11]。

扶正祛邪中藥復(fù)方遵循“扶正固本、清解伏毒”的組方原則組方，現(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)，方中主藥均具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及抗腫瘤的作用[12]。筆者在前期通過大量實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，扶正祛邪復(fù)方含藥血清可增加長春新堿(VCR)對(duì)白血病耐藥細(xì)胞HL60/VCR的細(xì)胞抑制率，并且能夠降低凋亡抑制基因Bcl-2的表達(dá)。與INF聯(lián)合還可以下調(diào)P-gp表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮逆轉(zhuǎn)耐藥的作用[13-14]。

本實(shí)驗(yàn)中我們?cè)诘湫湍退幖?xì)胞K562/A02中加入不同劑量的含藥血清以觀察含藥血清對(duì)耐藥細(xì)胞的抑制率。結(jié)果顯示抑制率為高劑量含藥血清組>中劑量含藥血清組>低劑量含藥血清組，高劑量含藥血清組分別與中、低劑量含藥血清組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，說明含藥血清對(duì)細(xì)胞的增殖具有一定的抑制作用，對(duì)細(xì)胞的抑制作用與藥物劑量呈正比。實(shí)驗(yàn)證明扶正祛邪中藥復(fù)方中藥具有直接抑制白血病細(xì)胞增殖的作用，能夠起到逆轉(zhuǎn)多藥耐藥的作用。同時(shí)，試驗(yàn)檢測(cè)了經(jīng)含藥血清處理后的各組細(xì)胞凋亡率的表達(dá)。結(jié)果顯示，不同劑量的含藥血清均可隨著時(shí)間的延長誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，在72 h，高劑量含藥血清組的凋亡率達(dá)到最高為50.63±1.36，高劑量含藥血清組與中劑量含藥血清組、低劑量含藥血清組、干擾素組、空白兔血清組的凋亡率進(jìn)行比較具有顯著性差異(P<0.01)；各組實(shí)驗(yàn)均在72 h的凋亡率最高，但壞死細(xì)胞也增多。由此可知，扶正祛邪中藥復(fù)方含藥血清不僅能夠直接抑制白血病細(xì)胞增殖，且能以劑量及時(shí)間依賴的方式誘導(dǎo)耐藥細(xì)胞的凋亡，實(shí)驗(yàn)提示扶正祛邪復(fù)方中藥具有逆轉(zhuǎn)多藥耐藥的作用，且其發(fā)揮逆轉(zhuǎn)作用的機(jī)制與其促進(jìn)耐藥細(xì)胞的凋亡密切相關(guān)。

A:HD+ADM組；B:MD+ADM組；C:LD+ADM組；D:IFN+ADM組;E:NS+ADM組

圖1流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果

組別24 h凋亡率48 h凋亡率72 h凋亡率HD+ADM組10.72±0.2430.81±1.56??△△50.63±1.36??△△▲#MD+ADM組9.20±0.9020.75±0.48?△33.02±0.39??△LD+ADM組8.87±0.709.44±0.8315.85±0.37IFN+ADM組9.34±0.3523.50±1.08?△35.38±0.94??△NS+ADM組6.91±1.189.16±1.0714.40±0.36

與NS+ADM組比較 *P<0.05, **P<0.01; 與LD+ADM組比較 △P<0.05, △△P<0.01;▲與IFN+ADM組比較P<0.05;#與MD+ADM組比較P<0.05