駱德強, 陳自力, 戴巍, 顧林銘

1上饒市第五人民醫(yī)院ICU(江西上饒 334000)； 2南昌大學(xué)附屬長城醫(yī)院ICU (江西南昌 330002)

膿毒癥(sepsis)誘發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)是感染、創(chuàng)/燒傷、外科術(shù)后導(dǎo)致休克甚至死亡常見原因[1]。在膿毒癥早期即存在腸屏障受損致通透性增加，細菌毒素入血，造成遠隔器官損傷衰竭甚至死亡[2-4]。因此，膿毒癥腸道損傷的可能機制及治療方法探求尤其迫切。核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)與抗氧化反應(yīng)原件(ARE)相結(jié)合，誘導(dǎo)編碼抗氧化蛋白和Ⅱ相解毒蛋白的表達[5-6]。研究表明Nrf2通過上調(diào)與ARE相關(guān)的解毒和抗氧化因子血紅素氧合酶-1(HO-1)，可以減輕腸組織的損傷，降低氧化應(yīng)激指標和升高抗氧化應(yīng)激指標，在大鼠腸道缺血再灌注損傷中起保護作用，說明Nrf2-ARE信號通路參與了小腸缺血再灌注損傷的保護過程[7-8]。甲烷氣體近年被發(fā)現(xiàn)在動物氧化應(yīng)激中可以起到重要保護作用[9-11]。本研究于2016年2—9月開展實驗，擬探討Nrf2/ARE在甲烷鹽水(methane saline，MS)治療膿毒癥腸損傷中的作用。本研究經(jīng)南昌大學(xué)動物實驗管理委員會批準，動物處置符合動物倫理學(xué)標準。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組及實驗?zāi)Ｐ椭苽?成年雄性SD大鼠，由南昌大學(xué)實驗動物中心提供，動物合格證號：SCDK(南動)2016-004，體質(zhì)量220～280 g，按隨機數(shù)字法分為假手術(shù)組(Sham)組、膿毒癥組(sepsis組)、甲烷鹽水組(Sham+MS組)和膿毒癥甲烷鹽水組(Sepsis+MS組)，每組32只。采用盲腸結(jié)扎穿孔法(cecal ligation and puncture,CLP)法建立膿毒癥大鼠模型[12]。Sham組和Sham+MS組動物不進行CLP術(shù)，其他操作相同。

1.2 甲烷鹽水治療 將大鼠在CLP或假手術(shù)后 0.5 h、12 h后每24 h分別給予Sepsis+MS組及Sham+MS組大鼠10%的MS腹腔注射10 mL/kg而其他組別的大鼠不進行甲烷鹽水注射，用等量生理鹽水注入腹腔。實驗室環(huán)境維持生理恒溫恒濕狀態(tài)，治療期間食物和水保持供應(yīng)。

1.3 檢測觀察指標及方法 每組取20只觀察CLP術(shù)后7 d生存率，剩下每組12只于術(shù)后6、18 h處死6只檢測相關(guān)指標。

1.3.1 腸組織病理觀察及Chiu′S[13]評分 CLP模型后18 h取大鼠中段空腸0.5 cm，用4%多聚甲醛溶液固定24 h，經(jīng)脫水、石蠟包埋和切片，用蘇木素-伊紅(HE)染色，封片后200倍鏡下觀察小腸黏膜出血、水腫及連續(xù)性改變，并進行Chiu′S評分。

1.3.2 小腸超氧化物歧化酶(SOD)及髓組織過氧化物酶含量(MPO)含量檢測 取中段空腸組織去濕稱重后采用Elisa試劑盒說明檢測各組SOD及MPO含量。

1.3.3 小腸腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細胞介素-10(IL-10)的檢測 按ELISA試劑盒說明檢測TNF-α和IL-10的含量。

1.3.4 Nrf2、HO-1和腸道閉合蛋白(Occludin)的表達 采用Western blot方法。Sepsis造模后6、18 h取腸組織，蛋白裂解液100 mg比500 μL加入去濕稱重后腸組織，提取組織蛋白，提取蛋白后用濕式電轉(zhuǎn)移法電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜封閉、洗膜，加入一抗鼠單克隆抗體Nrf2(1∶200，美國Santa公司)、兔抗人多克隆抗體Occludin(1∶50，美國Abcam公司)、HO-1(1∶1 000，美國Cell Signaling公司)和β-肌動蛋白(β-actin：1∶1 000杭州華安公司)4℃孵育過夜，將膜取出后，用1×TBST沖洗5 min×5次。膜置于玻璃皿內(nèi)，加入稀釋后的二抗(山羊抗兔1∶5 000，山羊抗小鼠1∶5 000)孵育 90 min,1×TBST 沖洗 5 min×5 次。β-actin、HO-1及Occludin使用羊抗兔二抗(1∶2 000、1∶1 000和1∶50，北京中杉金橋生物有限公司)室溫孵育1 h；Nrf2使用羊抗小鼠二抗(1∶2 000，北京中杉金橋生物有限公司)室溫孵育1 h,TBST清洗，顯色底物曝光，掃描，內(nèi)參照為β-actin，采用圖像分析軟件Gene tool測定條帶灰度值，以假手術(shù)組條帶灰度值與β-actin灰度值的比值為基準，用其他3組的比值與sham組相對比來反映目的蛋白的表達。

2 結(jié)果

2.1 大鼠生存率 Sham組和Sham+MS組大鼠生存率均為100%；Sepsis組大鼠于膿毒癥模型建立后隨著時間推移，大鼠逐漸死亡，大多數(shù)大鼠在48 h內(nèi)死亡。Sepsis組大鼠生存率與Sham組相比明顯降低(0vs100%，P<0.05)，Sepsis+MS組較Sepsis組明顯升高(50%vs0，P<0.05)，低于sham組(P<0.05)(圖1)。

圖1 MS對膿毒癥大鼠不同時間點生存率的影響

2.2 MS對SOD、MPO及TNF-α、IL-10的影響 與Sham組比較，Sepsis組的SOD和IL-10顯著降低，MPO和TNF-α顯著升高(P<0.05)，而Sepsis+MS組則較Sepsis組抗氧化酶升高、氧化產(chǎn)物和促炎細胞因子顯著降低(P<0.05)。見表1～2。

組別nTNF-αIL-106 h18 h6 h18 hSham組628.20±4.5030.30±5.5012.50±1.4514.20±1.39Sham+MS組629.50±4.9531.85±5.0013.00±2.0016.00±1.85Sepsis組61 340.50±78.40?1 003.40±70.28?70.00±5.90?100.80±8.50?Sepsis+MS組6700.40±56.25?△615.30±87.50?△110.65±7.94?△149.00±8.10?△

*與Sham組比較P<0.05；△與Sepsis組比較P<0.05

組別nSODMPO6 h18 h6 h18 hSham組6130.20±11.50129.40±9.402.00±0.082.00±0.05Sham+MS組6132.50±8.60131.80±9.502.20±0.052.16±0.06Sepsis組690.50±8.28?70.30±7.84?12.50±3.50 ?18.35±3.24 ?Sepsis+MS組6115.40±7.60 ?△100.30±7.25 ?△6.30±2.20 ?△8.40±2.20 ?△

*與Sham組比較P<0.05；△與Sepsis組比較P<0.05

2.3 腸組織Nrf2、HO-1和Occludin的蛋白表達 Sham組和Sham+MS組術(shù)后各時間點腸組織Nrf2和Occludin蛋白表達比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與Sham組比較，Sepsis組和Sepsis+MS組術(shù)后6和18 h腸組織Sepsis組和Nrf2、HO-1和Occludin蛋白表達量明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；且Sepsis+MS組腸組織Nrf2、HO-1和Occludin蛋白表達量明顯高于Sepsis組(P<0.05)，且呈時間依賴性。見圖2，表3。

組別nOccludinHO-1Nrf26 h18 h6 h18 h6 h18 hSham組61.02±0.041.02±0.031.02±0.051.01±0.061.02±0.031.00±0.02Sham+MS組61.02±0.151.01±0.021.03±0.041.02±0.031.01±0.021.03±0.03Sepsis組60.50±0.06 ?0.39±0.03 ?2.80±0.25 ?3.60±0.42 ?2.84±0.33 ?2.95±0.42 ?Sepsis+MS組60.87±0.05?△0.64±0.05?△4.22±0.20?△4.95±0.25?△3.46±0.40?△3.64±0.28?△

*與Sham組比較P<0.05；△與Sepsis組比較P<0.05

圖2各組大鼠術(shù)后不同時間點腸道Occludin、Nrf2和HO-1蛋白表達

2.4 腸組織病理改變 膿毒癥大鼠18 h出現(xiàn)明顯的腸道損傷，Sham組、Sham+MS組腸黏膜組織結(jié)構(gòu)完整，遠端絨毛結(jié)構(gòu)清晰無紊亂，無水腫滲出和中性粒細胞黏附，Chiu′S評分兩組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。Sepsis組腸黏膜組織排列紊亂，絨毛遠端明顯變鈍，腸微血管暴露，腸組織表面炎性細胞浸潤，有出血或者潰瘍征象。Sepsis+MS 組結(jié)構(gòu)稍紊亂，絨毛結(jié)構(gòu)能分辨，黏膜充血和水腫及中性粒細胞浸潤較Sepsis組明顯減輕。與Sham組相比,Sepsis組和Sepsis+MS組兩組大鼠腸黏膜損傷明顯加重，Chiu′S評分升高(P<0.05)；Sepsis+MS組與Sepsis組相比黏膜損傷明顯減輕，Chiu′S評分降低(P<0.05)。見圖3、表4。

3 討論

CLP模型被認為研究膿毒癥的金標準模型。膿毒癥研究中能否提高生存率被認為是救治嚴重感染患者的最終目的。實驗結(jié)果表明本課題成功建立了CLP膿毒癥模型，能夠模擬膿毒癥的病程特點[14-15]。本實驗通過建立CLP膿毒癥模型并進行了為期1周時間的觀察表明MS對CLP誘導(dǎo)膿毒癥大鼠起到一定程度的治療作用，能降低死亡率，且生存率與膿毒癥組存在顯著性差異。

A：Sham組； B：Sham+MS； C：Sepsis組； D：Sepsis+MS組

組別nChiu′S評分Sham組60.78±0.39Sham+MS組60.79±0.25Sepsis組63.95±0.44?Sepsis+MS組61.57±0.48?△

*與Sham組比較P<0.05； △與Sepsis組比較P<0.05

膿毒癥時氧化應(yīng)激致氧化與抗氧化系統(tǒng)的平衡失調(diào)是膿毒癥腸道組織損傷的重要過程[16]。因此本實驗做了相關(guān)氧化應(yīng)激髓組織過氧化物酶和內(nèi)源性抗氧化劑SOD指標及炎癥因子的檢測。SOD能降低細胞內(nèi)超氧水平，抑制脂質(zhì)氧化，穩(wěn)定腸道細胞膜結(jié)構(gòu)[17]。腸組織MPO是中性粒細胞特異性酶，被認為是反映中性粒細胞浸潤的指標。中性粒細胞產(chǎn)生過量的MPO與炎癥反應(yīng)的病理過程有關(guān)[18]。而TNF-α和IL-10在炎癥反應(yīng)中扮演了促炎和抗炎的對抗系統(tǒng)[19]。本實驗中MS治療膿毒癥大鼠抑制了SOD、IL-10活性降低和MPO、TNF-α含量的增高，同時通過調(diào)節(jié)膿毒癥大鼠的腸道連接緊密蛋白改善腸道的屏障結(jié)構(gòu)。由此可見，MS能降低膿毒癥大鼠的氧化應(yīng)激水平，增強抗氧化因子表達，調(diào)節(jié)腸道連接緊密蛋白，減輕腸道組織損傷程度。

膿毒癥時腸道的生物、機械、化學(xué)和免疫屏障遭受不同程度的破壞[16]。Occludin蛋白是高度聚集于上皮細胞的緊密連接蛋白，發(fā)生變異、減少和缺失可以引起腸上皮細胞間隙通透性增加[20]。其水平可在一定程度上反映致病菌對腸道緊密連接及屏障的破壞情況。Nrf2-ARE通路中Nrf2是多種氧化性和親電性化合物激活序列的激活因子[21]。遭受氧化應(yīng)激刺激時，Nrf2從keap1解離在核內(nèi)與maf蛋白結(jié)合成新的生物復(fù)合體結(jié)構(gòu)，調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄發(fā)揮作用。Nrf2-ARE通路重要的內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激通路[6]。Nrf2介導(dǎo)激活HO-1 的抗氧化損傷功能，HO-1及其酶解的產(chǎn)物廣泛參與心、腦、肺、肝、腎等組織細胞的抗氧化應(yīng)激損傷，是機體重要的內(nèi)源性保護體系統(tǒng)之一[22-23]。MS治療膿毒癥不僅不破壞內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)，而且可提高內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)的活性[24]。我們研究中發(fā)現(xiàn)經(jīng)過MS治療的膿毒癥大鼠腸組織Nrf2、HO-1和Occludin蛋白表達升高，由此我們推測MS對膿毒癥大鼠腸黏膜的保護作用是通過激活Nrf2/ARE通路誘導(dǎo)HO-1表達，促進緊密連接蛋白Occludin增加。而以往研究發(fā)現(xiàn) HO-1表達能增強腸黏膜屏障抗損傷與修復(fù)[25]。同時HO-1可將血紅蛋白分解為膽綠素、 膽紅素、鐵離子及一氧化碳，這些分子通過不同的途徑減輕細胞膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，降低機體炎癥反應(yīng)和細胞凋亡，從而對膿毒癥腸道損傷發(fā)生保護作用[22]。

綜上所述，MS治療能降低膿毒癥大鼠的炎癥水平，增加抗氧化酶和抗炎因子水平，促進腸道緊密連接蛋白增加，減輕腸道損傷的程度。MS對膿毒癥大鼠腸組織損傷的保護作用與內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)Nrf2-ARE通路激活導(dǎo)致HO-1的上調(diào)增加腸道緊密連接蛋白增加有關(guān)。