李亞男， 馬曉峰， 王小英， 秦靜

蘭州大學(xué)第二醫(yī)院急診科(甘肅蘭州 730000)

非酒精性脂肪肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一種無過量飲酒史、以肝細(xì)胞內(nèi)脂肪過渡貯積為主要特征的臨床病理綜合征[1-2]。其發(fā)病率隨高脂血癥、肥胖、2型糖尿病和代謝綜合征等疾病在全世界范圍的流行而不斷上升。目前NAFLD已成為慢性肝病的主要誘因，研究發(fā)現(xiàn)大約50%的NAFLD患者經(jīng)過4～13年發(fā)展會出現(xiàn)非酒精性脂肪肝炎(NASH)，40%發(fā)展為肝纖維化[3-4]。在臨床上由于其發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，因此尚無理想藥物用于NAFLD的治療。但大量研究證明，腸道菌群在NAFLD的發(fā)生發(fā)展中起著非常重要的作用，攝入乳酸桿菌、雙歧桿菌等益生菌可調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)系統(tǒng)的平衡[5]，減少內(nèi)毒素的生成和吸收[6]，提高機(jī)體免疫力[7]，改善胰島素抵抗[8]，從而降低NAFLD風(fēng)險的發(fā)生。在提高腸道益生菌菌群數(shù)量的效應(yīng)因子中，功能性寡糖被認(rèn)為是重要的腸道功能調(diào)節(jié)劑，其中甘露寡糖更被重視，由于甘露寡糖會競爭性地與病原菌表面的外源凝集素相結(jié)合，削弱了病原菌與宿主腸道黏膜上皮細(xì)胞受體的結(jié)合，同時可對大腸桿菌、梭狀菌、沙門菌及溶血性糞桿菌等致病菌進(jìn)行有效吸附[9]。2017年9—12月,本研究通過構(gòu)建高脂飲食的SD小鼠模型，觀察了乳桿菌聯(lián)合甘露寡糖對NAFLD的影響，從而為NAFLD的臨床治療提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 甘露寡糖(上海伯奧生物科技有限公司)；三酰甘油(TG)試劑盒、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)試劑盒和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)試劑盒(南京建成生物技術(shù)有限公司)；膽固醇、膽酸鈉、丙硫氧嘧啶(上海生工有限公司)；包埋石蠟、伊紅Y(水溶性)、中性樹膠(國藥集團(tuán)藥業(yè)股份有限公司)；無水乙酸鈉、葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、吐溫-80等常規(guī)試劑(天津市凱信化學(xué)試劑有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物 雄性清潔級健康SD小鼠50只，18～22 g，由新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供，動物許可證號SYXK(豫) 2014-0005。

1.3 菌種及培養(yǎng)基 實(shí)驗(yàn)用乳桿菌由本實(shí)驗(yàn)室分離，采用MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)基成分為無水乙酸鈉5.0 g，葡萄糖20.0 g，蛋白胨10.0 g，酵母粉5.0 g，牛肉膏10.0 g，磷酸氫二鉀2.0 g，檸檬酸三銨2.0 g，硫酸鎂0.58 g，硫酸錳0.25 g，吐溫-80 1 mL，溶于 1 000 mL 蒸餾水后121℃高壓滅菌備用。

1.4 高脂飼料配制 高脂飼料的配制方法參考謝慧臣等[10]提供的配方配制。其中基礎(chǔ)飼料占總重的82.3%，膽固醇、膽酸鈉、丙硫氧嘧啶分別占比2%、0.5%、0.2%，另外蔗糖和豬油分別占比7.5%、7.5%。

1.5 NAFLD小鼠模型分組 SD 大鼠被隨機(jī)分為5組，每組10只。分別為空白對照組(正常飲食)、模型組(高脂飲食)、乳桿菌組、甘露寡糖組(200 mg/kg)、乳桿菌+甘露寡糖組(200 mg/kg)，灌胃總體積1 mL，菌液濃度為1×109CFU/mL，空白對照組及模型組用生理鹽水取代。造模4周，造模期間自由飲食并記錄小鼠體重變化。所有造模小鼠干預(yù)10周后處死，收集肝臟及血清，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 乳桿菌菌液的制備 將分離的菌種接種于 MRS 液體培養(yǎng)基中，在37℃下培養(yǎng)24 h，再以2%的接種量活化接種3次，9 000 r/min 離心 10 min，棄上清，采用比濁法在OD560下調(diào)整菌懸液濃度為1×109CFU/mL 備用。

1.7 血清生化檢測 采用摘除眼球法采血，EP管收集血液，室溫放置15 min后，3 000 r/min下離心10 min，收集血清，試劑盒檢測血清中TG、ALT和AST的變化。

1.8 肝臟組織學(xué)分析 取小鼠肝葉同一位置的肝組織大小約0.5 cm3，采用甲醛固定和石蠟包埋后，常規(guī)切片并經(jīng)HE染色，光鏡觀察并比較分析肝組織結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)小鼠體重變化 在實(shí)驗(yàn)10周后，肥胖模型小鼠的體重明顯高于空白對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，而單獨(dú)的乳桿菌組和甘露寡糖組與空白對照組之間差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但乳桿菌+甘露寡糖組與空白對照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與模型組比較，乳桿菌組和甘露寡糖組的小鼠在實(shí)驗(yàn)10周后的體重變化差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且乳桿菌+甘露寡糖組小鼠體重的變化差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表1。

組別n實(shí)驗(yàn)前(g)10周后(g)凈增量(g)增長率(%)空白對照組1020.35±0.3626.87±1.546.52±0.7132.04±0.03模型組1020.92±1.4135.96±0.86??15.04±0.93??71.89±0.05??乳桿菌組1021.06±0.4930.66±1.29?△9.6±0.52?△45.58±0.05?△甘露寡糖組1019.98±0.6831.85±2.34?△11.87±1.22??△59.41±0.03??△乳桿菌+甘露寡糖組1020.77±1.2228.14±0.51△△7.37±0.66△△35.48±0.05△△

與空白對照組比較*P<0.05， **P<0.01；與模型組比較△P<0.05，△△P<0.01

2.2 乳桿菌聯(lián)合甘露寡糖對模型動物血清血脂的影響 與空白對照組相比，模型組血清TG、AST、ALT 顯著升高(P<0.01)，乳桿菌組、甘露寡糖組或乳桿菌+甘露寡糖組小鼠因高脂飲食引起的肝臟損傷均見減輕(P<0.05)。與模型組相比，乳桿菌+甘露寡糖組小鼠血清中TG、AST、ALT的含量能更有效降低，且效果明顯優(yōu)于乳桿菌組或甘露寡糖組。見表2。

組別TG (mmol/L)ALT (U/L)AST (U/L)空白對照組1.42±0.2625.16±1.3888.98±3.41模型組2.68±0.42??34.65±2.91??139.53±5.70??乳桿菌組1.98±0.18?△30.82±1.67?△118.22±2.56?△甘露寡糖組2.14±0.13?31.06±1.25?125.14±6.18?乳桿菌+甘露寡糖組1.71±0.28?△29.54±1.16?△△98.41±4.82?△△

與正常對照組比較*P<0.05， **P<0.01；與模型組比較△P<0.05，△△P<0.01

2.3 乳桿菌聯(lián)合甘露寡糖對NAFLD小鼠肝臟的改善作用 空白對照組肝臟正常，結(jié)構(gòu)清晰且無脂質(zhì)浸潤；模型組肝細(xì)胞腫大明顯，脂質(zhì)浸潤現(xiàn)象嚴(yán)重，肝小葉結(jié)構(gòu)消失，產(chǎn)生了大量的脂肪性空泡。這種病理學(xué)變化在乳桿菌組、甘露寡糖組、乳桿菌+甘露寡糖組中均得到了一定的改善，肝小葉結(jié)構(gòu)獲得了一定的恢復(fù)，其中乳桿菌結(jié)合甘露寡糖對肝臟的改善效果最為明顯。見圖1。

3 討論

人體微生物組是一個巨大又復(fù)雜的微生物群落。它包括棲息在腸道內(nèi)腔的各種微生物-細(xì)菌、病毒、真菌、古生菌、噬菌體和原生動物[11]。腸道微生態(tài)作為人體最大的微生態(tài)系統(tǒng)，在長期進(jìn)化的過程中形成了非常復(fù)雜的作用特性，而且與人體的各種生理病理代謝過程聯(lián)系緊密[12-13]。研究表明腸道微生物組的成分和功能與生活地點(diǎn)、個體的年齡性別、種族和飲食攝入有關(guān)，同時Rothschild等[14]證實(shí)腸道菌群群落結(jié)構(gòu)主要由環(huán)境因素決定，而且只有1.9%的腸道微生物組是可遺傳的，超過腸道微生物組β-多樣性20%的差異是由個人飲食和生活習(xí)慣所導(dǎo)致的。越來越多的研究證明腸道微生物的變化在個體的各種發(fā)病機(jī)制中占有重要地位。雖然健康個體的腸道菌群成分高度不同，但患有肥胖、糖尿病、高血脂、代謝障礙及部分癌癥的個體均具有菌群豐富度低的特點(diǎn)[15]。同時大量相關(guān)研究暗示了特定菌門、菌綱或菌種或細(xì)菌代謝活動可能會對個體的發(fā)病有益或有害，但嗜酸乳桿菌 (Lactobacillus)與空腹血糖和HbA1c水平正相關(guān)[16-17]。而甘露寡糖作為功能性寡糖在促進(jìn)嗜酸乳桿菌及雙歧桿菌的增殖中具有非常重要的作用。因此通過乳桿菌與甘露寡糖的聯(lián)合，將進(jìn)一步體現(xiàn)其臨床意義和研究價值。

在人體的代謝系統(tǒng)中，肝臟在解剖學(xué)上與腸道密切相關(guān)，通過門靜脈循環(huán)與腸道相互影響[18-19]。因此通過調(diào)整腸道菌群將有效預(yù)防和改善各種肝病的發(fā)生發(fā)展，通過益生菌結(jié)合功能性寡糖來提高腸道有益菌群的數(shù)量，為改善肝臟的代謝和分析肝臟與腸道菌群之間的關(guān)系提供提供依據(jù)。本研究通過觀察乳桿菌結(jié)合甘露寡糖對非酒精性脂肪肝小鼠的影響發(fā)現(xiàn)，在改善動物腸道菌群后，將有效改善肝臟結(jié)構(gòu)，恢復(fù)部分肝臟功能，控制小鼠體重，在血清血脂中的酶及TG指標(biāo)能獲得有效控制，研究數(shù)據(jù)證明腸道微生態(tài)與肝臟代謝有密切關(guān)系。同時通過組間比較分析發(fā)現(xiàn)，益生菌結(jié)合甘露寡糖的作用效果明顯優(yōu)于單獨(dú)的益生菌或甘露寡糖作用，因此為后期的相關(guān)機(jī)制研究提供了直接依據(jù)，也為后期臨床NAFLD的防治提供了思路與參考。

A：空白對照組；B：模型組；C：乳桿菌組；D：甘露寡糖組；E：乳桿菌+甘露寡糖組

圖1乳桿菌及甘露寡糖對小鼠肝臟病理學(xué)的影響(HE，×400)