祁崗， 朱艷媚， 李玉娟， 李焱， 羅世文， 李曼

1青海省人民醫(yī)院核醫(yī)學科(青海西寧 810007)； 2青海大學醫(yī)學院(青海西寧 810016)

自身免疫性甲狀腺疾病(autoimmune thyroid disease,AITD)是人類常見的器官特異性自身免疫性疾病，其發(fā)病部位主要位于甲狀腺，主要包括Graves病(GD)和橋本甲狀腺炎(Hashimotos thyroiditis,HT)[1]。目前研究發(fā)現(xiàn)其發(fā)病機制包括遺傳因素和環(huán)境因素，兩者共同作用導致免疫失衡和信號通路異常，形成自身免疫性炎癥[2-4]。已有大量研究發(fā)現(xiàn)在自身免疫性甲狀腺疾病和實驗性自身免疫性甲狀腺炎中，存在明顯的免疫失衡和信號通路的異常[5-7]。有研究發(fā)現(xiàn)在AITD組織中核因子-κB(NF-κB)通路被異常激活[8]，但并未有對NF-κB通路在AITD發(fā)病過程中不同階段的激活情況以及與炎癥相關(guān)因子的關(guān)系進行研究，因此,2016年11月至2017年10月,本研究通過相關(guān)實驗技術(shù)探索NF-κB通路在實驗性自身免疫性甲狀腺炎中不同階段激活情況以及與相關(guān)炎癥因子的關(guān)系，為自身免疫性甲狀腺炎的發(fā)病提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 150只雄性清潔級昆明小鼠購買自蘭州大學動物實驗中心，體重 35～55 g，飼養(yǎng)條件：12 h晝夜交替，溫度23℃，按需攝入食水。SPF級CBA/j小鼠購買自北京華阜康生物科技股份有限公司，體重14～20 g，飼養(yǎng)條件：12 h晝夜交替，溫度23℃，按需攝入食水。Sephadex G-200凝膠(索萊寶生物科技有限公司)，腫瘤壞死因子-α(TNF-α) ELISA試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)，SP9001免疫組化試劑盒、RIPA裂解液、超敏型ECL檢測試劑、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、SDS-PAGE電泳液以及蛋白質(zhì)印跡轉(zhuǎn)膜液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；NF-κB、IKK抗體均屬于兔單克隆抗體(Abcam公司)；HRP標記的山羊抗兔IgG(CST公司)，Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時定量PCR試劑盒(Takara)，引物(Takara公司)。引物信息：TNF-α：上游5′-CCTCTAGCCCACGTCGTAGC-3′， 下游5′-AGCAATGACTCCAAAGTAGACC- 3′；Bcl-2：上游5′-TGACCCGCAGCAAGAAAGTG-3′，下游5′-ATCTGTGGAGAAGACAGCTA-3′；細胞間黏附分子-1(ICAM-1)：上游5′ -GACCACGGAGCCAA-TTTCTCA-3′，下游5′ -TCCAGTTCCCCAAG- CAGTCC-3′；β-actin：上游5′-TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAAC-3′，下游5′-TAAAACGCA GCTCAGTAACAGTCCCG-3′。

1.2 方法

1.2.1 mTg蛋白純化 取昆明小鼠150只，剝離甲狀腺組織，并迅速置于4℃預冷0.01 mmol/L 的pH 7.2的PBS中。研磨成勻漿液。經(jīng)4℃ 3 000 r/min離心30 min，取上清，再經(jīng)4℃ 10 000×g離心1 h，取上清液經(jīng)飽和度為42%、37%和42%硫酸銨3次沉淀后，溶于PBS中， 4℃透析48 h，換液6次，凍干，溶于洗脫液，經(jīng)Sephadex G-200凝膠層析純化。

1.2.2 mTg蛋白鑒定 將純化的蛋白加入4×上樣緩沖液，煮沸變性后，加到4%濃縮膠濃縮，10%分離膠分離，然后用考馬斯亮藍R250染色，根據(jù)條帶的分子量鑒定是否為甲狀腺球蛋白。

1.2.3 動物飼養(yǎng)及造模 于8周齡時，給予CBA/j小鼠mTg+CFA皮下注射初次免疫，10周齡時模型組再給予相同mTg+IFA重復免疫1次，分別于初次免疫后第0、1、2周以及加強免疫后第2周齡時處死小鼠，取血清及甲狀腺組織進行檢測。

1.2.4 HE染色 摘取甲狀腺組織，PBS洗滌后，4%多聚甲醛固定1周后，經(jīng)脫水后，石蠟包埋，切成4 μm切片。進行HE染色，簡要步驟如下：依次經(jīng)二甲苯、梯度酒精水化后，蘇木素浸染5 min，鹽酸乙醇分色，自來水沖洗，伊紅浸染2～3 min、脫水、透明及封片，光鏡觀察并照相。參考Tang等[9]的炎癥分級標準，光鏡下觀察甲狀腺組織的炎癥細胞(包括淋巴細胞、漿細胞、嗜中性粒細胞)浸潤程度，并參考Tang等[9]的炎癥分級標準進行評分。

1.2.5 ELISA實驗 眼球取血后，將血液于室溫放置30 min，待其凝固后，3 000 r/min離心10 min，取血清，進行ELISA實驗。實驗步驟簡要如下：按照說明書，分為標準孔、空白孔、樣品孔。在標準孔中加入梯度標準品，空白孔不加樣品及酶標試劑，其余各部操作相同，樣品孔中加入稀釋5倍的樣品，37℃溫浴30 min，洗滌液洗5次，加入酶標試劑，溫浴30 min，洗滌液洗滌5次，顯色15 min，終止反應，450 nm波長測量各孔OD值。

1.2.6 qPCR實驗 將甲狀腺組織在Trizol中快速研碎，室溫靜置5 min，13 000 r/min離心5 min，吸取上清，加入氯仿，靜置離心，吸取上清加入異丙醇，靜置離心，棄去上清，75%乙醇清洗沉淀，離心棄上清，保留沉淀干燥，用DEPC水溶解。然后按照Takara反應試劑盒依次經(jīng)過去除基因組DNA反應、反轉(zhuǎn)錄反應和qPCR進行擴增，擴增程序為：預變性：95℃、10 min、1循環(huán)數(shù)；擴增：95℃、15 s，60℃、15 s，72℃、30 s、40循環(huán)數(shù)。

1.2.7 Western blot實驗 甲狀腺組織中加入RIPA裂解液，置于冰上研碎至勻漿后，4℃放置30 min，13 000 r/min離心10 min，取一部分上清，BCA試劑盒檢測蛋白濃度，另一部分上清加入4×上樣緩沖液，煮沸變性后，加到4%濃縮膠濃縮，10%分離膠分離，再經(jīng)過轉(zhuǎn)膜、封閉、4℃孵育一抗、室溫孵育二抗、ECL發(fā)光液顯色、X醫(yī)用膠片顯影、定影等步驟，最后進行拍照分析。

1.2.8 免疫組化實驗 按照SP免疫組化試劑盒說明書進行實驗。甲狀腺組織切片經(jīng)過抗原熱修復、封閉、孵育一抗、生物素標記的二抗。PBS沖洗，3 min×3次。將辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素工作液滴加適量于切片的組織上，37℃孵育10 min。PBS 沖洗，3 min×3次。經(jīng)DAB顯色、蘇木素復染、0.5%的鹽酸酒精分化后，將切片脫水后二甲苯透明，中性樹膠封片，晾干后保存。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件，多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 蛋白純化及鑒定 由圖1可知，在純化mTg過程中，圖1-A中第1個峰代表丙酮分子，單一平滑表明柱子安裝合格。第2個峰圖代表分離純化的甲狀腺球蛋白，在甲狀腺中，甲狀腺球蛋白分子量是最大的，因此第2個峰推測即為甲狀腺球蛋白，進行收集。為驗證是否為甲狀腺球蛋白，進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，圖1-B中3條帶為稀釋不同濃度的收集的純化蛋白，根據(jù)分子量顯示分析為甲狀腺球蛋白且蛋白純度較高，達到實驗動物造模的要求。

A：純化峰圖；B：電泳鑒定圖

2.2 病理變化 與初次免疫第0周小鼠甲狀腺組織相比，初次免疫后第1周甲狀腺組織可見炎癥細胞的輕微浸潤，炎癥評分差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，但甲狀腺濾泡體積、數(shù)量、形狀以及濾泡間壁膜厚度并未發(fā)生變化；初次免疫后第2周(即2次加強免疫時)，小鼠甲狀腺組織濾泡間壁膜厚度增加，體積、形狀以及數(shù)量并未發(fā)生明顯變化，組織中可見較多炎癥細胞浸潤，與0周小鼠甲狀腺炎癥評分相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；初次免疫后第4周(即2次加強免疫后第2周)，甲狀腺組織濾泡體積減小、數(shù)量減少，濾泡間壁膜厚度明顯增加，組織中可見明顯炎癥細胞浸潤，與0周小鼠甲狀腺炎癥評分相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2和表1。

A:0周；B:1周；C:2周; D：4周

時間n病理評分F值P值0周40.50±0.5822.60.0001周41.50±0.58?2周42.75±0.50?4周43.50±0.58?

*與0周比較P<0.05

2.3 血清中TNF-α含量變化 與初次免疫第0周小鼠血清中TNF-α含量相比，初次免疫后第1周小鼠血清中TNF-α含量有所上升，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；初次免疫后第2周(即2次加強免疫時)，小鼠血清中TNF-α含量顯著增高，與0周小鼠血清中TNF-α含量相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；初次免疫后第4周(即2次加強免疫后第2周)，小鼠血清中TNF-α含量進一步增高，與0周小鼠血清中TNF-α含量相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

時間nTNF-α含量F值P值0周477.07±13.1968.4980.0001周492.38±8.812周4138.68±13.62?4周4188.14±12.22?

*與0周比較P<0.05

2.4 甲狀腺組織中TNF-α、Bcl-2、ICAM-1 mRNA變化 與初次免疫第0周小鼠甲狀腺組織中TNF-α mRNA、Bcl-2 mRNA以及ICAM-1 mRNA含量相比，初次免疫后第1周小鼠甲狀腺組織中三者含量均有所上升，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；初次免疫后第2周(即2次加強免疫時)，小鼠甲狀腺組織中TNF-α mRNA、ICAM-1 mRNA含量顯著增高，與初次免疫0周小鼠相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，Bcl-2 mRNA含量有所上升，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；初次免疫后第4周(即2次加強免疫后第2周)，小鼠甲狀腺組織中TNF-α mRNA、Bcl-2 mRNA以及ICAM-1 mRNA含量進一步增高，與初次免疫0周小鼠相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

項目nTNF-αBcl-2ICAM-10周41.00±0.001.00±0.001.00±0.001周41.04±0.161.01±0.051.03±0.082周41.44±0.10?1.07±0.111.39±0.08?4周41.76±0.06?1.50±0.08?1.66±0.09?F值51.40144.14677.905P值0.0000.0000.000

*與0周比較P<0.05

2.5 甲狀腺組織中NF-κB蛋白變化 與初次免疫第0周小鼠甲狀腺組織中NF-κB蛋白含量相比，初次免疫后第1周小鼠甲狀腺組織中NF-κB蛋白含量有所上升，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；初次免疫后第2周(即2次加強免疫時)，小鼠甲狀腺組織中NF-κB蛋白含量顯著增高，與初次免疫0周小鼠甲狀腺中NF-κB蛋白含量相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；初次免疫后第4周(即2次加強免疫后第2周)，小鼠甲狀腺組織中NF-κB蛋白含量進一步增高，與0周小鼠甲狀腺組織中NF-κB蛋白含量相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖3和表4。

圖3 甲狀腺組織中NF-κB蛋白變化

2.6 甲狀腺組織中IKK蛋白變化 與初次免疫第0周小鼠甲狀腺組織中IKK蛋白含量相比，初次免疫后第1周小鼠甲狀腺組織中IKK蛋白含量有所

時間n相對含量F值P值0周40.30±0.08172.7470.0001周40.33±0.062周41.30±0.10?4周41.31±0.10?

*與0周比較P<0.05

上升，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；初次免疫后第2周(即2次加強免疫時)，小鼠甲狀腺組織中IKK蛋白含量顯著增高，與初次免疫0周小鼠甲狀腺中IKK蛋白含量相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；初次免疫后第4周(即2次加強免疫后第2周)，小鼠甲狀腺組織中IKK蛋白含量進一步增高，與0周小鼠甲狀腺組織中IKK蛋白含量相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖4和表5。

A:0周；B:1周；C:2周；D:4周

時間n相對表達量F值P值0周40.276 5±0.0950.44 60.0001周40.377 5±0.092周40.662 5±0.06?4周40.857 5±0.06?

*與0周比較P<0.05

3 討論

為探索自身免疫性甲狀腺炎的發(fā)病機制，本研究選用CBA/j小鼠，采用2次注射mTg進行免疫的造模方法，建造自身免疫性甲狀腺炎模型。HE染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)在2次加強后，隨著時間的增加，小鼠甲狀腺組織逐漸出現(xiàn)炎癥，并在觀測時間內(nèi)不斷加重，推測在EMT發(fā)病過程中與炎癥相關(guān)信號通路逐漸被異常激活。

TNF-α作為重要的炎癥因子，與多種疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)其在自身免疫性甲狀腺炎發(fā)病過程中起重要的調(diào)控介導作用[10]，本研究發(fā)現(xiàn)隨著免疫時間的增加和2次加強免疫，小鼠血清中TNF-α含量逐漸升高，并在第2周和第4周小鼠血清中TNF-α含量顯著升高。TNF-α升高不僅導致炎癥部位釋放大量炎癥介質(zhì)和趨化因子，同時激活體內(nèi)的炎癥細胞，加重炎癥[11]。TNF-α的促炎作用與其激活體內(nèi)多條炎癥相關(guān)信號通路密切相關(guān)[12]，包括NF-κB通路，大量研究發(fā)現(xiàn)在許多免疫性疾病中TNF-α激活NF-κB通路，反過來激活的NF-κB通路可啟動TNF-α轉(zhuǎn)錄表達，形成正反饋作用[13]。因此，在自身免疫性甲狀腺炎中，異常表達的TNF-α可能導致NF-κB通路異常激活，促進炎癥。為此本研究進一步實驗發(fā)現(xiàn)隨著免疫時間的增加和2次加強免疫，觀測時間內(nèi)小鼠甲狀腺組織中NF-κB蛋白含量逐漸增加，與血清中TNF-α含量和甲狀腺組織中TNF-α mRNA含量變化趨勢保持同步，因此提示在甲狀腺炎的發(fā)病過程中TNF-α與NF-κB之間存在著相互促進的正反饋機制，使炎癥加重。

NF-κB作為轉(zhuǎn)錄因子，其激活可啟動下游炎癥相關(guān)因子的表達，在炎癥發(fā)生過程中起調(diào)控作用。其中凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2以及黏附遷移相關(guān)蛋白ICAM-1基因的啟動子中皆含有NF-κB轉(zhuǎn)錄因子識別結(jié)合序列，兩者受NF-κB的激活調(diào)控[14-15]。NF-κB是否啟動甲狀腺炎中Bcl-2和ICAM-1蛋白的表達，導致炎癥細胞的浸潤。本研究對EMT組織中兩者的mRNA含量進行檢測，研究發(fā)現(xiàn)隨著免疫時間的增加和2次加強免疫，觀測時間內(nèi)小鼠甲狀腺組織中Bcl-2 mRNA和ICAM-1 mRNA表達量逐漸增加，與甲狀腺組織中NF-κB含量變化趨勢幾乎保持同步，其中Bcl-2促進細胞增殖，加重炎癥[16]，而ICAM-1在炎癥組織中高表達可促進炎癥細胞的浸潤[17]。以上提示在EMT組織中NF-κB的異常表達可能導致Bcl-2 mRNA、ICAM-1 mRNA高表達，從而促進EMT炎癥的發(fā)生、發(fā)展。

NF-κB是通過IKK誘導IκB磷酸化所激活的。在本研究中通過免疫組化實驗發(fā)現(xiàn)隨著免疫時間的增加和2次加強免疫，觀測時間內(nèi)小鼠甲狀腺組織中IKK表達量逐漸增加，與甲狀腺組織中NF-κB含量變化趨勢幾乎保持同步，進一步證實NF-κB途徑在EMT發(fā)病過程中被逐漸激活。

綜上所述，在EAT發(fā)病過程中，隨著初次免疫及加強免疫后時間在一定范圍內(nèi)增加，NF-κB通路被逐漸異常激活。其可能機制在于免疫造模促使小鼠發(fā)生針對Tg的免疫反應，導致血清中TNF-α含量以及甲狀腺組織中TNF-α mRNA表達量上升，進一步使NF-κB通路與TNF-α所形成的正反饋作用導致NF-κB通路持續(xù)激活，啟動Bcl-2和ICAM-1基因表達，促使炎癥細胞增殖、浸潤至甲狀腺組織，導致炎癥。但是本研究僅僅對發(fā)病過程中NF-κB通路及其炎癥因子進行了動態(tài)檢測。在EAT發(fā)病過程中，所涉及通路很多，相互之間存在交叉對話，因此在后續(xù)研究中還應該用到特異性抑制劑或激活劑進一步探索NF-κB通路的重要性。