王香青，馬振軍，包洪云，王 茹，陳雪蓮，劉志勇，孔方方

（1．解放軍464醫(yī)院婦產(chǎn)科，天津 300381；2．天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院病理科，天津 300060）

在發(fā)展中國(guó)家的婦女中，宮頸癌僅次于乳腺癌，是第二常見的惡性腫瘤類型，其癌癥病死率僅次于乳腺癌和卵巢癌。在2012年，全球約有527 600個(gè)新增宮頸癌病例，265 700個(gè)宮頸癌死亡病例[1]。槲皮素是一種廣泛分布于植物中的抗氧化類黃酮。槲皮素在B環(huán)3位上的酚類羥基組具有清除自由基的作用。在小鼠實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，槲皮素能夠抑制化學(xué)誘導(dǎo)劑誘發(fā)的結(jié)腸癌發(fā)生[2]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外細(xì)胞學(xué)研究探討了槲皮素對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖及遷移能力的影響及其對(duì)Wnt/β－catenin信號(hào)通路的作用，為槲皮素應(yīng)用于宮頸癌的防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 HeLa細(xì)胞株（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤細(xì)胞庫(kù)）；槲皮素（美國(guó)Sigma公司）；DMEM（Dvalineminimal essential medium）培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；CCK－8試劑盒購(gòu)自日本DOJINDO公司；Transwell細(xì)胞遷移小室購(gòu)自美國(guó)BD公司；小鼠抗人β－catenin單克隆抗體購(gòu)自Santa cruz公司；羊抗小鼠IgGAlexa Flour488購(gòu)自Invitrogen公司；TopFlash熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Addgene公司；熒光素酶胸苷激酶、Lipofectamine 2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Promega公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及槲皮素處理 將HeLa細(xì)胞株放人含10%胎牛血清、DMEM培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。槲皮素處理組中細(xì)胞加入不同濃度的（10、40、100μmol/L）的以二甲基亞砜（DMSO）為溶劑的槲皮素，對(duì)照組加入等量DMSO，培養(yǎng)24 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 CCK－8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞增殖能力用細(xì)胞增殖－毒性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)。將各組細(xì)胞胰酶消化后接種至96孔板中，接種密度為100個(gè)/孔，每種細(xì)胞每板種18個(gè)復(fù)孔，加入不同濃度槲皮素培養(yǎng)24 h后，每孔加5 mg/mL的CCK8溶液10μL，37℃孵育3 h后，酶標(biāo)儀檢測(cè)595 nm處的光密度（OD）值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

抑制率（%）＝[1－（用藥組OD值/空白對(duì)照組OD值）]×100%

1.4 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞經(jīng)0．05%胰酶消化液消化后，收集離心，用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度至5×105個(gè)/每孔接種于6孔板中。待細(xì)胞貼壁后，用10μL槍頭用力均勻地在培養(yǎng)皿中劃痕，磷酸鹽緩沖溶液（PBS）輕輕洗滌2次；為了排除細(xì)胞增殖對(duì)實(shí)驗(yàn)的干擾，劃痕后改用無(wú)血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)觀察18 h，測(cè)量記錄細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的距離，并于倒置顯微鏡（100×）下拍照。

1.5 Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 在8μm微孔的Transwell小室下室中加入300μL DMEM+20%FBS培養(yǎng)液，在上室孔中加入200μL濃度為5×105/mL的細(xì)胞懸液，每種細(xì)胞做3個(gè)復(fù)孔，置于5%CO2培養(yǎng)箱于37℃培養(yǎng)8 h后，棄去上室液體，用濕棉簽擦去膜上未穿過(guò)膜的細(xì)胞后固定、蘇木精染色，觀察計(jì)數(shù)顯微鏡（400×）下穿過(guò)膜的細(xì)胞數(shù)，每張膜中央部分和周圍部分各隨機(jī)取5個(gè)視野。

1.6 免疫熒光 將各組細(xì)胞以5×104/mL提前鋪于含有蓋玻片的12孔板中，4%多聚甲醛4℃固定10 min，PBS沖洗，0．5%Triton室溫處理10 min；PBS沖洗，3%BSA封閉室溫1 h；PBS沖洗，加入小鼠抗人β－catenin單克隆抗體（1∶50）4℃孵育過(guò)夜，PBS洗3次，加入羊抗小鼠IgGAlexa Flour488（1∶200）避光室溫1 h；PBS洗3次，加入4，6－二乙?；?－苯基吲哚酸鹽，避光室溫10 min進(jìn)行細(xì)胞核染色；PBS洗2次，將蓋玻片移至載玻片上，用抗熒光衰減封片劑封片，熒光顯微鏡觀察、拍照。

1.7 TOPFlash熒光素酶報(bào)告系統(tǒng) 轉(zhuǎn)染前24 h，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以2×104/孔的濃度接種于48孔板內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。利用Lipofectamine 2 000轉(zhuǎn)染試劑將TopFlash（100 ng）及海腎熒光素酶胸苷激酶（50 ng）共轉(zhuǎn)染于細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48 h后加入槲皮素處理24 h后，收集細(xì)胞利用Promega雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒檢測(cè)熒光素酶活性。通過(guò)與海腎熒光素酶活性相對(duì)比對(duì)結(jié)果進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 結(jié)果應(yīng)用SPSS20．0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理系統(tǒng)。數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間的差異比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD－t檢驗(yàn)。采用雙尾檢測(cè)法，以P＜0．05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 槲皮素抑制SRA 01/04細(xì)胞增殖 組間OD值有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明槲皮素具有抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖的作用，見表1。組間兩兩比較發(fā)現(xiàn)40μmol/L及100μmol/L槲皮素濃度處理組與空白對(duì)照之間組OD值也具有明顯差異（40μmol/L，P＜0．05；100μmol/L，P＜0．05），且呈現(xiàn)濃度依賴性作用。

2.2 槲皮素抑制HeLa細(xì)胞水平及垂直遷移能力 Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)被用來(lái)分別檢測(cè)槲皮素對(duì)于HeLa細(xì)胞垂直及水平運(yùn)動(dòng)遷移能力的影響。Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：各組間細(xì)胞的遷移細(xì)胞相對(duì)數(shù)比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05），組間兩兩比較發(fā)現(xiàn)除了10μmol/L組外，40μmol/L、100μmol/L槲皮素處理組細(xì)胞遷移數(shù)均顯著低于對(duì)照組細(xì)胞（40μmol/L，P＜0．05；100μmol/L，P＜0．05），見圖1、表2。表明槲皮素處理能夠抑制HeLa細(xì)胞的垂直運(yùn)動(dòng)能力。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)表明各組間劃痕后18 h槲皮素處理組的HeLa細(xì)胞無(wú)細(xì)胞區(qū)域?qū)挾缺容^，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．01），組間兩兩比較發(fā)現(xiàn)除了10μmol/L組外，40μmol/L、100μmol/L槲皮素處理組細(xì)胞遷移數(shù)均顯著低于對(duì)照組細(xì)胞（40μmol/L，P＜0．05；100μmol/L，P＜0．01），見圖2、表2。表明槲皮素處理能夠抑制HeLa細(xì)胞的水平運(yùn)動(dòng)能力。

表1 槲皮素對(duì)HeLa細(xì)胞增殖影響Tab.1 Inhibition of quercetin on proliferation of HeLa cells

表1 槲皮素對(duì)HeLa細(xì)胞增殖影響Tab.1 Inhibition of quercetin on proliferation of HeLa cells

注：與空白對(duì)照組，*P＜0．05。

組別 樣本數(shù) OD值 抑制率（%）空白對(duì)照組 3 1．123±0．063 －溶劑對(duì)照組 3 1．047±0．048 －10μmol/L槲皮素處理組 3 1．017±0．055 9．39 40μmol/L槲皮素處理組 3 0．750±0．040* 32．70*100μmol/L槲皮素處理組 3 0．580±0．040* 47．70*

2.3 槲皮素抑制Wnt/β－catenin信號(hào)通路活化 βcatenin是Wnt/β－catenin信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白。在通路失活狀態(tài)下，β－catenin主要位于細(xì)胞膜的細(xì)胞連接處起著細(xì)胞骨架的作用，當(dāng)Wnt配體與Frizzled受體結(jié)合引起Dsh磷酸化，導(dǎo)致由Axin、APC、GSK－3β組成的破壞復(fù)合物解體，GSK－3β無(wú)法降解β－catenin而使其聚集并進(jìn)入細(xì)胞核激活TCF/LEF轉(zhuǎn)錄因子，引起通路活化，參與多種惡性腫瘤的發(fā)生和演進(jìn)。β－catenin的亞細(xì)胞定位能夠反應(yīng)Wnt/β－catenin信號(hào)通路的活化狀態(tài)。細(xì)胞免疫熒光結(jié)果發(fā)現(xiàn)β－catenin蛋白在對(duì)照組細(xì)胞中主要分布于細(xì)胞胞漿和細(xì)胞核內(nèi)，而在40μmol/L和100μmol/L槲皮素處理組HeLa細(xì)胞中不但βcatenin大部分分布于胞漿中，細(xì)胞核內(nèi)β－catenin蛋白明顯減少，提示槲皮素能夠抑制Wnt/β－catenin信號(hào)通路。見圖3。

TOPFlash熒光報(bào)告系統(tǒng)，除了含有TCF/LEF結(jié)合位點(diǎn)，還包含有一段熒光素酶報(bào)告基因，可以將Wnt/β－catenin信號(hào)通路的微觀變化通過(guò)熒光信號(hào)強(qiáng)度反映出來(lái)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，40μmol/L和100μmol/L槲皮素處理組細(xì)胞報(bào)告基因被顯著抑制（P＜0．05），進(jìn)一步驗(yàn)證了槲皮素具有抑制Wnt/β－catenin信號(hào)通路的作用。見圖4。

圖1 對(duì)照組及各槲皮素處理組中的遷移細(xì)胞圖Fig.1 Imagesof the migrated cellsin control and quercetin-treated groups

表2 槲皮素對(duì)HeLa細(xì)胞垂直及水平運(yùn)動(dòng)能力影響Tab.2 Inhibition of quercetin on vertical and horizontal migration of HeLa cells（

注：與空白對(duì)照組，*P＜0．05。

18 h劃痕寬度（mm）空白對(duì)照組 3 65．33±3．76 0．19±0．02溶劑對(duì)照組 3 59．33±5．21 0．20±0．04 10μmol/L槲皮素處理組 3 55．00±1．73 0．22±0．03 40μmol/L槲皮素處理組 3 45．00±2．89 0．33±0．02*100μmol/L槲皮素處理組 3 33．00±2．52 0．39±0．03*組別 樣本數(shù) 遷移細(xì)胞數(shù)

3 討論

槲皮素是具有多種生物學(xué)活性的天然黃酮類化合物。在許多中草藥如三七、款冬花、槐米、合歡花、銀杏等均含有槲皮素。近些年來(lái)對(duì)于槲皮素類藥物的研究發(fā)現(xiàn)其具有抗氧化清除自由基、抗炎、舒張血管、增強(qiáng)免疫、抗抑郁、降血糖血脂等多種藥理作用[3]。國(guó)內(nèi)外的多項(xiàng)動(dòng)物及體外細(xì)胞學(xué)研究表明槲皮素對(duì)于包括乳腺癌、前列腺癌、淋巴瘤、胃癌、結(jié)腸癌、肝癌、肺癌、胚胎癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展也具有抑制作用[4－6]。

Wnt信號(hào)通路參與促進(jìn)多種腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，且Wnt信號(hào)通路的異?；罨Ｌ崾净颊哳A(yù)后不良[7]，而抑制該通路能夠減弱腫瘤細(xì)胞干細(xì)胞樣特性并阻斷腫瘤細(xì)胞異常增殖[8]。目前關(guān)于槲皮素對(duì)Wnt/β－catenin信號(hào)通路的作用僅在胚胎癌、結(jié)腸癌和乳腺癌細(xì)胞中可見有限的研究[9－11]，但其對(duì)于宮頸癌細(xì)胞中Wnt/β－catenin信號(hào)通路的作用還未見相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道。

國(guó)內(nèi)外已有的研究表明槲皮素可抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，其作用的機(jī)制可能有：槲皮素抑制抗凋亡蛋白激酶B（AKT）和Bcl－2的表達(dá)，使線粒體內(nèi)細(xì)胞色素c水平升高，線粒體膜電位去極化并伴隨著活性氧族的升高[12]，槲皮素抑制JAK/STAT信號(hào)通路，抑制細(xì)胞增殖，誘發(fā)細(xì)胞凋亡[13]；槲皮素可促進(jìn)nm23的表達(dá)抑制乙酰肝素酶，抑制腫瘤轉(zhuǎn)移[14－15]。本研究發(fā)現(xiàn)槲皮素能夠抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞的增殖、遷移能力，這與文獻(xiàn)報(bào)道中的結(jié)果一致。

已有不少研究表明Wnt信號(hào)通路中的重要蛋白在宮頸癌組織中表達(dá)增加，而通路的抑制因子表達(dá)缺失或下調(diào)[16]。人宮頸鱗狀上皮細(xì)胞中的HPV病毒的感染和轉(zhuǎn)化也與Wnt信號(hào)通路的活化狀態(tài)密切相關(guān)[17]。這些均表明Wnt/β－catenin信號(hào)通路在宮頸癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中具有重要作用。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)槲皮素處理能夠抑制HeLa細(xì)胞中β－catenin向細(xì)胞核內(nèi)聚集且進(jìn)一步抑制TCF/LEF的轉(zhuǎn)錄活化，進(jìn)而抑制Wnt/β－catenin信號(hào)通路，提示槲皮素可能通過(guò)抑制Wnt/β－catenin信號(hào)通路發(fā)揮抑制宮頸癌細(xì)胞增殖及遷移的作用。

盡管槲皮素來(lái)源廣泛，藥用價(jià)值高，目前對(duì)于其在腫瘤防治方面的研究越來(lái)越多，但大部分的研究仍處于臨床前期階段，關(guān)于槲皮素抗癌的作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步深入，為槲皮素的臨床應(yīng)用提供更多的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

圖3 對(duì)照組及槲皮素處理組中β-catenin的表達(dá)Fig.3 Expression ofβ-catenin in control and quercetin-treated groups

圖4 對(duì)照組及槲皮素處理組中相對(duì)Top Flash熒光素酶活性Fig.4 Relative TopFlash luciferase activity in control and quercetin-treated groups