劉玥玥，劉 博

（1．恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院消化內(nèi)科，恩施 445000；2．恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院乳腺外科，恩施 445000）

胃癌在當(dāng)今社會人群中的發(fā)生率越來越高，并且其死亡率在所有惡性腫瘤中位于第2位[1－2]，嚴(yán)重威脅著人類的生命健康。隨著醫(yī)療技術(shù)水平的提升，針對胃癌治療的措施也越來越多，然而市場上治療胃癌的藥物效果有限、且還會帶來不同程度的毒副作用，于是新藥的開發(fā)及其作用機(jī)制的深入探討仍然是目前研究的熱點[3]。

Traf6/TAK1信號通路的活化在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用[4]，通路中關(guān)鍵銜接蛋白腫瘤壞死因子相關(guān)受體因子6（Traf6）可以傳導(dǎo)胞外信號，在腫瘤細(xì)胞增殖、遷移過程中扮演重要角色[5]。因為中藥來源廣、價格低、副作用低等特點一直應(yīng)用在抗腫瘤活性研究中，迷迭香酸為丹參、紫蘇等中草藥的活性組分，為天然多酚羥基化合物，在抗炎、抗氧化及抗腫瘤方面表現(xiàn)出較好的藥理活性[6－8]。本研究采用HGC27細(xì)胞為研究對象，考察了迷迭香酸對HGC27細(xì)胞增殖、凋亡的作用效應(yīng)及對Traf6/TAK1信號通路活化的影響。

1 材料及方法

1.1 材料

1.1.1 人胃癌細(xì)胞（HGC27） 購自中國科學(xué)院生物研究所。

1.1.2 藥物與試劑 迷迭香酸（上海原葉生物公司，批號：20283－92－5）；RPMI 1640培養(yǎng)基（杭州四季青生物材料研究所）、胰蛋白酶（美國Sigma公司）；CCK－8試劑盒購自北京智杰方遠(yuǎn)科技有限公司；胎牛血清購自杭州四季青公司；AnnexinV/PI試劑盒購于BENDER公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒（上海谷歌生物有限公司，批號P0012S－07）；一抗稀釋液（上海吉諾公司，批號：C154855）；ECL顯色液（Sigma公司）；β－actin、Bax、Bcl－2、Traf6、TAK1以及p－TAK1兔抗人一抗均購自英國Abcam公司；二抗羊抗兔IgG購自武漢谷歌生物科技有限公司。

1.1.3 主要儀器 單人超凈工作臺（北京六一儀器廠）；CB15C02型細(xì)胞培養(yǎng)箱（北京六一儀器廠）；Victor3 1420 Multilable Counter酶標(biāo)儀（美國BD，F(xiàn)ACSAriaIII）；HD－3000凝膠成像儀（上海上天精密儀器有限公司）；CytoFLEX流式細(xì)胞儀（貝克曼公司）。

1.2 HGC27細(xì)胞培養(yǎng) HGC27細(xì)胞培養(yǎng)基用RPMI 1640培養(yǎng)液（含10%FBS，100 U/mL青霉素，100μg/mL鏈霉素），將細(xì)胞放置于37℃，飽和濕度，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，根據(jù)生長狀況進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.3 分組與干預(yù)方法 將細(xì)胞接種于96孔板，分為正常對照組、25、50、100μmol/L迷迭香酸干預(yù)組24～72 h，然后進(jìn)行CCK8實驗。將細(xì)胞接種于6孔板，分為正常對照組、25、50、100μmol/L迷迭香酸干預(yù)組，藥物作用細(xì)胞24 h后進(jìn)行流式細(xì)胞實驗和免疫印跡實驗。

1.4 檢測指標(biāo)與方法

1.4.1 CCK8 取對數(shù)生長期的HGC27細(xì)胞，消化、重懸、計數(shù)后，以1×104/mL的濃度接種于96孔板，每孔終體積200μL，待細(xì)胞貼壁生長至70%左右時，以迷迭香酸終濃度為25、50、100μmol/L的培養(yǎng)液處理細(xì)胞，并設(shè)置調(diào)零孔。每組設(shè)置5個復(fù)孔，分別培養(yǎng)24、48、72 h后，棄去舊培養(yǎng)基，每孔加入10μL CCK8試劑，繼續(xù)孵育1 h后，采用酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光度值。

1.4.2 流式細(xì)胞 取對數(shù)生長期的HGC27細(xì)胞，消化、重懸、計數(shù)后，以1×105/mL的濃度接種于6孔板，按實驗要求加入迷迭香酸終濃度為25、50、100μmol/L，作用24 h后收集細(xì)胞，先用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗細(xì)胞2遍，然后分別加入Annexin－VFITC和PI處理細(xì)胞（按照試劑盒操作說明書進(jìn)行），最后用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.4.3 Western Blot 藥物干預(yù)24 h后，離心收集細(xì)胞，加入RIPA細(xì)胞裂解液，冰上裂解30 min后，離心收集上清提取細(xì)胞蛋白。BCA法測定細(xì)胞總蛋白濃度。各孔取30μg的蛋白上樣，于12%聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行蛋白分離（濃縮膠70 V電壓，30 min；分離膠120 A電壓，120 min）。將分離后的蛋白電轉(zhuǎn)移（275mA電流90min）至聚偏氟乙烯（PVDF）膜。加入5%脫脂奶粉封閉液于搖床上室溫封閉1 h。用TBST洗膜3次，每次10 min，分別加入對應(yīng)一抗抗體（體積稀釋比例均為1∶1 000），4℃反應(yīng)過夜。次日先以TBST洗膜，3次，每次10 min。后加入HRP標(biāo)記的二抗IgG（體積稀釋比例為1∶3 000），室溫反應(yīng)1 h。再用TBST洗膜3次，每次10 min。按ECL試劑盒說明進(jìn)行顯影。采用雙色紅外激光成像系統(tǒng)分析管理系統(tǒng)對蛋白條帶灰度值進(jìn)行分析。

1.5 統(tǒng)計分析 采用SPSS 20．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩組間比較采用LSD－t檢驗，P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 迷迭香酸對HGC27細(xì)胞增殖的抑制作用 迷迭香酸干預(yù)對HGC27細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05）。隨著迷迭香酸干預(yù)時間的延長及濃度的升高，對HGC27細(xì)胞增殖抑制能力明顯增強(qiáng)，表現(xiàn)出時間－劑量依賴性。結(jié)果見表1。

表1 迷迭香酸對HGC27細(xì)胞增殖的影響Tab.1 Effectsof rosmarinic acid on proliferation of HGC27 cells

表1 迷迭香酸對HGC27細(xì)胞增殖的影響Tab.1 Effectsof rosmarinic acid on proliferation of HGC27 cells

注：與0μmol/L比較，*P＜0．05。

迷迭香酸（μmol/L）A570 24 h 48 h 72 h 0 1．29±0．09 1．54±0．14 1．69±0．15 25 1．01±0．11* 1．21±0．11* 1．44±0．09*50 0．56±0．07* 0．69±0．07* 0．91±0．10*100 0．38±0．05* 0．49±0．06* 0．68±0．07*

2.2 迷迭香酸對HGC27細(xì)胞周期的影響 低、中、高劑量迷迭香酸干預(yù)HGC27細(xì)胞后，與對照組相比，G0/G1期細(xì)胞明顯升高，S期、G2/M期細(xì)胞明顯減少，差異有顯著性（P＜0．05）。說明迷迭香酸干預(yù)可將HGC27細(xì)胞停留在G0/G1期，抑制了細(xì)胞的增殖分裂。結(jié)果見表2。

表2 迷迭香酸對HGC27細(xì)胞周期的影響（x±s）Tab.2 Tab.2 Effects of rosmarinic acid on cell cycle of HGC27

表2 迷迭香酸對HGC27細(xì)胞周期的影響（x±s）Tab.2 Tab.2 Effects of rosmarinic acid on cell cycle of HGC27

注：與0μmol/L比較，*P＜0．05。

迷迭香酸（μmol/L） G0/G1 S G2/M 0 50．95±3．51 30．85±2．06 18．20±0．730 25 60．54±2．95* 25．04±1．24* 14．42±0．840*50 66．97±1．96* 23．47±1．16* 9．56±0．520*100 73．07±1．84* 19．95±1．08* 6．98±0．638

2.3 迷迭香酸對HGC27細(xì)胞凋亡的影響 25、50、100μmol/L迷迭香酸干預(yù)HGC27細(xì)胞后凋亡率分 別為（11．94±1．16）%、（19．05±1．21）%及（26．08±1．74）%。與對照組（6．47%±1．08%）相比迷迭香酸組細(xì)胞凋亡率明顯升高（P＜0．05）；迷迭香酸誘導(dǎo)HGC27細(xì)胞凋亡表現(xiàn)出良好的劑量關(guān)系。結(jié)果見圖1。

2.4 迷迭香酸對HGC27細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響 迷迭香酸可以明顯誘導(dǎo)HGC27細(xì)胞中促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，抑制抗凋亡蛋白Bcl－2表達(dá)，與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05），并且表現(xiàn)出濃度依賴性。結(jié)果見圖2。

2.5 迷迭香酸對HGC27細(xì)胞Traf6/TAK1信號通路的影響 迷迭香酸對HGC27細(xì)胞中Traf6/TAK1信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響如圖3所示，提示迷迭香酸能顯著抑制Traf6、p－TAK1蛋白表達(dá)，抑制Traf6/TAK1信號通路活化，從而誘導(dǎo)HGC27細(xì)胞凋亡。

圖1 迷迭香酸對HGC27細(xì)胞凋亡的影響Fig.1 Impacts of rosmarinic acid on apoptosisof HGC27 cells

圖2 迷迭香酸對HGC27細(xì)胞凋亡蛋白的影響Fig.2 Impactsof rosmarinic acid on apoptosisrelated proteinsin HGC27 cells

3 討論

胃癌是全球第二大惡性腫瘤，病人死亡的主要因素是由遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)及癌細(xì)胞的不斷增殖擴(kuò)散導(dǎo)致，于是嚴(yán)格控制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)其凋亡是治療癌癥發(fā)生與發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[9]。中藥活性成分在干預(yù)胃癌方面重于溫陽益胃和健脾理氣，引發(fā)的毒副作用低，對腫瘤組織周圍的正常細(xì)胞傷害小，而且中藥價格便宜、來源廣泛、并且在降低或防止復(fù)發(fā)侵襲等方面表現(xiàn)出獨特的優(yōu)勢[10－11]。迷迭香酸是來源于多種中草藥的天然活性成分，特別是它抗腫瘤功效一直受到醫(yī)療界的重視。早期報道迷迭香酸可以抑制炎性因子及血管生成因子的釋放，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的凋亡，它可能的作用機(jī)制與降低NF－kB信號通路活化相關(guān)[12]；還有關(guān)報道證實迷迭香酸可濃度依賴性的誘導(dǎo)白血病HL－60細(xì)胞凋亡，并且能夠?qū)⒓?xì)胞停留在G0/G1期[13]。現(xiàn)在有關(guān)迷迭香酸對胃癌細(xì)胞增殖凋亡的作用效應(yīng)并不清楚，于是本文探討了迷迭香酸對HGC27細(xì)胞增殖、凋亡的作用效應(yīng)及對Traf6/TAK1信號通路的影響，實驗數(shù)據(jù)提示迷迭香酸能夠成時間－劑量依賴性的抑制HGC27細(xì)胞增殖。采用低、中、高濃度迷迭香酸處理24 h后流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況及細(xì)胞周期，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，該藥物能夠?qū)⒓?xì)胞周期停留在G0/G1期，并且細(xì)胞凋亡率明顯增加。

細(xì)胞凋亡屬于正常的生理現(xiàn)象，能夠保持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，在這過程中由多種基因參與。其中Bax及Bcl－2蛋白是重要的凋亡調(diào)節(jié)因子，前者為促凋亡蛋白，后者為抑凋亡蛋白，在癌細(xì)胞凋亡過程起著重要作用[14]。早期證實迷迭香酸能介導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞中Bax、Bcl－2基因的表達(dá)，進(jìn)一步抑制細(xì)胞增殖[15]。本實驗提示，不同劑量迷迭香酸干預(yù)HGC27細(xì)胞后，促凋亡蛋白Bax表達(dá)升高，抑凋亡蛋白Bcl－2表達(dá)降低。結(jié)果說明迷迭香酸了通過誘導(dǎo)Bax表達(dá)、抑制Bcl－2表達(dá)來增強(qiáng)HGC27細(xì)胞凋亡。

Traf6是細(xì)胞內(nèi)的一種銜接蛋白，它可以介導(dǎo)細(xì)胞膜上多種受體信號通路的傳導(dǎo)（TLR4為其中一種受體），進(jìn)一步發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[16]。Traf6的活化可進(jìn)一步激活TAK1介導(dǎo)的信號通路，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的不斷增殖[17]。因此，對Traf6進(jìn)行抑制，便可抑制腫瘤細(xì)胞增殖、抑制其凋亡。為了研究迷迭香酸對胃癌細(xì)胞中Trfa6/TAK1信號通路的作用，本文采用不同劑量藥物干預(yù)HGC27細(xì)胞后檢測發(fā)現(xiàn)Trfa6及TAK1磷酸化水平顯著下降，結(jié)果提示迷迭香酸能通過抑制Trfa6/TAK1信號通路活化抑制胃癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡。本研究結(jié)果為迷迭香酸成為治療胃癌的參考藥物提供理論依據(jù)。

圖3 迷迭香酸對HGC27細(xì)胞Traf6/TAK1信號通路的影響Fig.3 Impactsof rosmarinic acid on Traf6/TAK1 pathway in HGC27 cells