董靖，劉永濤，胥寧，楊秋紅，楊移斌，艾曉輝

(中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所，武漢430223)

嗜水氣單胞菌 (Aeromonashydrophila)是一種人獸魚共患病原菌，廣泛分布于水體、土壤和環(huán)境中，能夠引起淡水養(yǎng)殖魚類、陸生動(dòng)物和人的多種疾病[1]。嗜水氣單胞菌及其他運(yùn)動(dòng)性氣單胞菌是可在世界范圍內(nèi)傳播的水產(chǎn)動(dòng)物致病菌，國(guó)內(nèi)外的水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)常因嗜水氣單胞菌感染而導(dǎo)致巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。嗜水氣單胞菌感染魚類后可以引起運(yùn)動(dòng)性氣單胞菌敗血癥和出血性敗血癥，使患病魚出現(xiàn)爛鰓、爛尾、豎鱗和潰瘍等癥狀[3-4]。此外，Yousr等[5]研究發(fā)現(xiàn)嗜水氣單胞菌可以通過(guò)水和未煮熟的水產(chǎn)品傳染給人類。人感染該菌后能夠?qū)е履c胃炎、敗血癥及全身性感染，嚴(yán)重時(shí)甚至可危及生命[6]?？股厥悄壳坝糜谥委熂?xì)菌性疾病的主要手段，在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中，嗜水氣單胞菌感染的治療也主要依賴于抗生素，但由于長(zhǎng)期不合理的藥物使用，導(dǎo)致該病原菌產(chǎn)生耐藥性[7]。此外，抗生素的不合理使用會(huì)造成水產(chǎn)品中藥物殘留超標(biāo)和水體中抗生素含量超標(biāo)，引起食品質(zhì)量安全問(wèn)題和生態(tài)安全問(wèn)題[8]。因此，近年來(lái)以毒力因子為靶標(biāo)的藥物研究受到國(guó)內(nèi)外的廣泛關(guān)注[2]。

近年來(lái)，大量研究表明，嗜水氣單胞菌的致病力與其自身攜帶的毒力因子種類密切相關(guān)[9]。其中，嗜水氣單胞菌分泌的外毒素氣溶素是極其重要的毒力因子之一，是該菌引起各種疾病的物質(zhì)基礎(chǔ)，可以作為鑒別致病菌株的標(biāo)志[10]。氣溶素是一種水溶性蛋白，其前體經(jīng)蛋白酶酶切后成為具有生物學(xué)活性的氣溶素，具有細(xì)胞毒性、溶血性和腸毒性[11]。氣溶素通過(guò)特定的糖蛋白受體結(jié)合到真核細(xì)胞表面，形成具有孔道的七聚體插入到脂質(zhì)雙分子層中，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡[12]。

基于以上情況，本研究通過(guò)研究重組氣溶素的純化方法和生物活性，以期篩選能抑制氣溶素活性的小分子化合物，為抗嗜水氣單胞菌藥物的研發(fā)提供新思路。目前國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)氣溶素的表達(dá)、純化和生物活性測(cè)定進(jìn)行了大量的研究，但大部分研究得到的主要目的產(chǎn)物為包含體，且未對(duì)重組蛋白進(jìn)行精細(xì)純化[13-15]，不利于藥物篩選和功能性試驗(yàn)的開展。因此，本研究在總結(jié)文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，采用含有谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(GST)標(biāo)簽的pGEX-6p-1 載體構(gòu)建了重組載體，以期提高重組蛋白的可溶性。通過(guò)優(yōu)化表達(dá)溫度和誘導(dǎo)時(shí)間，建立了氣溶素前體(Pre-AerA)可溶性蛋白的表達(dá)方法，同時(shí)建立了氣溶素的離子交換純化方法，得到了純度95%以上的目的產(chǎn)物，并對(duì)其溶血活性進(jìn)行了測(cè)定，為進(jìn)一步研究以氣溶素為靶標(biāo)的抗嗜水氣單胞菌的小分子藥物開展鋪墊性工作。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

嗜水氣單胞菌ATCC7966購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，原核表達(dá)載體pGEX-6p-1、大腸桿菌克隆菌株DH5α、表達(dá)菌株BL21(DE3)購(gòu)自武漢擎科生物科技公司，DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、T4連接酶和IPTG購(gòu)自Thermo Scientific公司，DNA片段凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Omega公司，Glutathione Sepharose 4B購(gòu)自美國(guó)GE Healthcare公司。

1.2 目的基因擴(kuò)增

根據(jù)GenBank中嗜水氣單胞菌ATCC7966株的基因組序列(NC008570.1)設(shè)計(jì)特異性引物，為了便于連接載體分別在上下游引物的5′端添加BamHI和NotI酶切位點(diǎn)。以ATCC7966菌株的全基因組為模板擴(kuò)增全長(zhǎng)的氣溶素(aerA)基因，用DNA片段凝膠回收試劑盒純化DNA片段。

1.3 分子克隆和鑒定

將純化回收的aerA片段和pGEX-6p-1載體用BamHI和NotI雙酶切，回收后將片段與載體以3∶1(V/V)混合后加入T4 DNA連接酶,置于16 ℃水浴中過(guò)夜連接。次日將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)中并涂布到含有100 μg/mL氨芐西林抗生素的LB平板上，平板置于37 ℃培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)。隨機(jī)挑取平板上的單菌落,置于含有100 μg/mL氨芐西林抗生素的液體LB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)16 h，提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定，陽(yáng)性質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定并測(cè)序。

1.4 誘導(dǎo)表達(dá)分析

選取測(cè)序正確的質(zhì)粒樣品轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)菌株中，從LB平板上挑取單菌落，接種至含有100 μg/mL氨芐西林抗生素的液體LB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。取培養(yǎng)后的菌液按1∶100(V/V)的比例接種至新鮮的LB液體培養(yǎng)基中(含有100 μg/mL氨芐西林)擴(kuò)大培養(yǎng)，檢測(cè)培養(yǎng)物的OD600nm吸收值。當(dāng)OD600nm達(dá)到0.6～0.8時(shí)，加入終濃度為1 mmol/L 的IPTG，繼續(xù)誘導(dǎo)6 h后于10 000 r/min下離心收集菌體，用PBS重懸后，通過(guò)12% SDS-PAGE電泳分析蛋白表達(dá)情況。

1.5 表達(dá)形式分析

為了得到具有活性的可溶性蛋白，本實(shí)驗(yàn)研究了溫度對(duì)重組蛋白表達(dá)形式的影響。當(dāng)菌液OD600nm達(dá)到0.6～0.8時(shí)，將菌液分別放置在37 ℃和16 ℃搖床中，分別加入終濃度為1 mmol/L和0.2 mmol/L的IPTG，繼續(xù)誘導(dǎo)6 h后收集菌體。菌體用PBS重懸后，分別加入終濃度為1 mg/mL的溶菌酶，于冰上反應(yīng)30 min，結(jié)束后以15 000 r/min離心10 min，分別收集上清和沉淀，通過(guò)12% SDS-PAGE電泳分析上清和沉淀中的目的蛋白。

1.6 誘導(dǎo)時(shí)間優(yōu)化

為了使重組蛋白表達(dá)量最大化，分析了不同誘導(dǎo)時(shí)間下的蛋白表達(dá)量。分別在誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后的4、8、12、16和20 h收集菌體，通過(guò)12% SDS-PAGE電泳分析誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)蛋白表達(dá)量的影響。

1.7 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和純化

將重組菌株接種至20 mL含有氨芐青霉素(100 μg/mL)的LB液體培養(yǎng)基中，在37 ℃條件下振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，然后按照1∶100(V/V)的比例將菌液轉(zhuǎn)接至1 L含有100 μg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，在37 ℃中培養(yǎng)至OD600nm為0.6時(shí)將菌液降溫至16 ℃，然后加入終濃度為0.2 mmol/L的IPTG，置于16 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)16 h。5 000 r/min收集菌體，并重懸于PBS溶液中。

將收集的菌體超聲破碎，4 ℃條件下16 000 r/min離心30 min,收集裂解上清，加入到Glutathione SepharoseTM4B 親和層析柱中，以重力反復(fù)過(guò)柱3次，然后用PBS洗脫雜蛋白，加入PreScission蛋白酶(1 mg/mL)在4 ℃中酶切過(guò)夜。用PBS洗脫目的蛋白,收集的目的蛋白用超濾管超濾脫鹽，將緩沖液替換為離子交換A液(20 mmol/L Bis-Tris，pH 6.8)。脫鹽后的目的蛋白過(guò)Hitrap Q陰離子交換柱，以離子交換B液(20 mmol/L Bis-Tris，500 mmol/L NaCl，pH 6.8)洗脫目的蛋白，收集含有目的蛋白的組分，進(jìn)行SDS-PAGE分析。將純度較高的目的蛋白合并，通過(guò)超濾法將緩沖液替換為AerA儲(chǔ)存液(25 mmol/L Tris，150 mmol/L NaCl，pH 8.2)，測(cè)定濃度后置于-80 ℃冰箱保存。

1.8 重組Pre-AerA的溶血活性測(cè)定

取純化的Pre-AerA，加入胰蛋白酶使其終濃度為10 μg/mL，在室溫條件下酶切10 min以激活，然后加入10倍濃度的胰蛋白酶抑制劑終止反應(yīng)。AerA的溶血活性通過(guò)其對(duì)綿羊紅細(xì)胞的溶解能力來(lái)測(cè)定。在溶血緩沖液(20 mmol/L Tris，150 mmol/L NaCl，pH 7.2)中分別加入質(zhì)量濃度為64、32、16、8、4和2 ng/mL的AerA，然后加入25 μL脫纖維綿羊紅細(xì)胞，在37 ℃中孵育15 min，10 000 r/min離心后測(cè)定上清液OD543nm吸收值，以1% Triton X-100代替AerA作為陽(yáng)性對(duì)照，溶血百分比計(jì)算公式見(jiàn)式(1)。一個(gè)單位的溶血活性(HU)定義為能夠?qū)е戮d羊紅細(xì)胞釋放出一半血紅蛋白需要的AerA的量。

式(1)

式(1)中，A表示吸光值。

2 結(jié)果

2.1 aerA-pGEX-6p-1表達(dá)載體構(gòu)建

通過(guò)PCR擴(kuò)增得到了編碼Pre-AerA的DNA片段，圖1所示為aerA基因的瓊脂糖凝膠電泳圖，發(fā)現(xiàn)在1 500 bp附近有特異性擴(kuò)增條帶，其分子量大小與預(yù)期一致。該片段和載體經(jīng)雙酶切、連接后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α菌株中，挑取的4個(gè)單菌落經(jīng)菌液PCR鑒定后發(fā)現(xiàn)菌落1、3、4、5含有aerA基因，2號(hào)菌落為空載體菌液PCR對(duì)照(圖2)。提取陽(yáng)性克隆菌落的質(zhì)粒后，經(jīng)雙酶切鑒定發(fā)現(xiàn)有5 kb左右的質(zhì)粒條帶和1.5 kb左右的目的基因條帶(圖3)，最終通過(guò)測(cè)序確定該片段與嗜水氣單胞菌ATCC7966菌株氣溶素基因同源性為100%。

圖1 aerA基因PCR電泳圖M: DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1和2: aerA基因。Fig.1Electrophoretogram of aerA gene by PCR amplificationM: DNA marker; 1 and 2: PCR product of aerA.

2.2 Pre-AerA的表達(dá)和條件優(yōu)化

重組表達(dá)菌在37 ℃、1 mmol/L IPTG條件下誘導(dǎo)表達(dá)6 h后，取菌體進(jìn)行12% SDS-PAGE分析。從圖4中可以看到，與誘導(dǎo)前相比，誘導(dǎo)后的大腸桿菌在分子量約為81 kDa處有融合蛋白表達(dá)條帶，與理論分子量81 kDa一致，說(shuō)明該重組載體在大腸桿菌BL21(DE3)菌株中能夠表達(dá)。

圖2 菌液PCR鑒定電泳圖M: DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1, 3, 4, 5: 含有重組載體的菌液； 2: 空載體菌液。Fig.2Electrophoretogram of bacteria liquid PCRM: DNA marker; 1，3，4，5: PCR of recombinant vector; 2: PCR of blank vector.

圖3 重組質(zhì)粒雙酶切電泳鑒定圖M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1：質(zhì)粒雙酶切。Fig.3Electrophoretogram of double digestion of the recombinant plasmidM: DNA marker; 1: double digestion of the plasmid.

為了分析重組蛋白在不同溫度下的表達(dá)形式，分別分析了37 ℃和16 ℃兩個(gè)溫度誘導(dǎo)下的表達(dá)情況。收集的菌體經(jīng)溶菌酶裂解后高速離心，分別取上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE分析。如圖5所示，16 ℃條件誘導(dǎo)下目的蛋白大部分位于裂解上清中，說(shuō)明于16 ℃表達(dá)時(shí)該蛋白為可溶性表達(dá)；而37 ℃表達(dá)時(shí)目的蛋白位于裂解后的沉淀中，說(shuō)明于37 ℃表達(dá)時(shí)該蛋白的表達(dá)形式為包含體。如圖6所示，為了得到最大表達(dá)量，對(duì)誘導(dǎo)時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)當(dāng)加入IPTG誘導(dǎo)16 h后，氣溶素融合蛋白的表達(dá)量達(dá)到最大。因此，為了得到具有生物學(xué)活性的可溶性蛋白，在試驗(yàn)中選擇的表達(dá)溫度為16 ℃，IPTG濃度為0.2 mmol/L，誘導(dǎo)時(shí)間為16 h。

圖4 氣溶素融合蛋白預(yù)表達(dá)SDS-PAGE電泳圖M: 蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1: 誘導(dǎo)前；2: 37 ℃誘導(dǎo)6 h。Fig.4SDS-PAGE gel of pre-AerA expressionM: protein marker; 1: before induction; 2: induced at 37 ℃ for 6 h.

圖5 不同溫度下的表達(dá)形式SDS-PAGE電泳圖M: 蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1: 誘導(dǎo)前；2: 16 ℃誘導(dǎo)后菌體裂解上清；3: 16 ℃誘導(dǎo)后菌體裂解沉淀；4: 37 ℃誘導(dǎo)后菌體裂解上清；5: 37 ℃誘導(dǎo)后菌體裂解沉淀。Fig.5SDS-PAGE gel of the expressional form in different temperaturesM: protein marker; 1: before induction; 2: bacterial lysis supernatant after induced at 16℃; 3: bacterial lysis precipitation after induced at 16 ℃; 4: bacterial lysis supernatant after induced at 37 ℃; 5: bacterial lysis precipitation after induced at 37 ℃.

2.3 蛋白純化

將表達(dá)后的菌體超聲破碎和離心后，收集裂解上清液進(jìn)行親和層析,得到初步純化的蛋白。將所得蛋白合并脫鹽后進(jìn)行離子交換純化，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)得到純度較高的目的蛋白(圖7)。重組蛋白純度經(jīng)BandScan (Glyko)軟件初步計(jì)算大于95%，符合試驗(yàn)要求。

圖6 不同誘導(dǎo)時(shí)間表達(dá)量SDS-PAGE電泳圖M：蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；0：誘導(dǎo)前；4：誘導(dǎo)4 h后；8：誘導(dǎo)8 h后；12：誘導(dǎo)12 h后；16：誘導(dǎo)16 h后；20：誘導(dǎo)20 h后。Fig.6SDS-PAGE gel of target protein induced with IPTG in different timesM: protein marker; 0: before induction; 4: induced for 4 h; 8: induced for 8 h; 12: induced for 12 h; 16: induced for 16 h; 20: induced for 20 h.

圖7 離子交換純化后的蛋白SDS-PAGE電泳圖M: 蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1: 純化的氣溶素前體蛋白。Fig.7SDS-PAGE gel of recombinant protein after anion exchange purificationM: protein marker; 1: purified pro-aerolysin.

2.4 重組Pre-AerA的溶血活性

將胰蛋白酶激活的Pre-AerA蛋白加入到溶血體系中進(jìn)行溶血試驗(yàn)，結(jié)果如圖8所示，隨著AerA濃度的增加，其溶血活性逐漸增強(qiáng)。將受試蛋白能引起一半紅細(xì)胞裂解的量作為一個(gè)溶血單位(hemolytic unit，HU)，經(jīng)測(cè)定在本實(shí)驗(yàn)條件下AerA對(duì)綿羊紅細(xì)胞的溶血單位為54.17 HU/μg。

圖8 不同質(zhì)量濃度氣溶素下綿羊紅細(xì)胞的溶血活性Fig.8 Hemolysis assay of aerolysin by sheep red blood cells

3 討論

很多病原菌通過(guò)分泌毒素導(dǎo)致各種疾病的發(fā)生，其中有一部分毒素能夠在靶細(xì)胞表面產(chǎn)生孔道致細(xì)胞損傷，這類毒素被稱為成孔毒素[16]。成孔毒素分為兩類，一類是能夠在細(xì)胞表面產(chǎn)生多孔結(jié)構(gòu)域而導(dǎo)致細(xì)胞死亡的酶；另一類破壞細(xì)胞的滲透壓導(dǎo)致細(xì)胞死亡，這一類也被稱為溶細(xì)胞素[17]。目前已發(fā)現(xiàn)和鑒定了多種細(xì)菌分泌的溶細(xì)胞素，其中AerA是最重要、研究最多的溶細(xì)胞素之一[18]。通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明AerA是嗜水氣單胞菌的主要毒力因子，并與嗜水氣單胞菌的致病力密切相關(guān)[19]。AerA單體是分子量約為52 kDa的水溶性蛋白，在細(xì)菌中以前體形式表達(dá)并分泌到細(xì)胞外，能被細(xì)胞表面的弗林蛋白酶、消化酶或細(xì)菌分泌的蛋白酶酶切形成有活性的單體形式[20]。AerA單體本身不具備孔道結(jié)構(gòu)，為了成孔，需要結(jié)合到細(xì)胞表面的糖基磷脂酰肌醇(GPIs)受體上，聚合成孔后插入細(xì)胞膜中。GPIs受體是一組廣泛存在于真核細(xì)胞細(xì)胞膜上的糖脂復(fù)合物，因此多數(shù)真核細(xì)胞對(duì)AerA敏感[18]。

目前得到AerA純蛋白有從胞外成分中分離純化和原核表達(dá)純化兩種方式。從胞外成分中分離的蛋白具有較好的生物學(xué)活性，但其操作復(fù)雜且產(chǎn)率較低，因此近年來(lái)原核表達(dá)成為獲得AerA蛋白的主要方式。Pre-AerA是一種外分泌性蛋白，為了得到可在大腸桿菌胞內(nèi)高表達(dá)的Pre-AerA融合蛋白以便于后期純化，在設(shè)計(jì)PCR引物時(shí)去除了1～23位氨基酸的信號(hào)肽區(qū)域，以保證該基因在大腸桿菌胞內(nèi)的高效表達(dá)[21]。杜娜等[14]、盧強(qiáng)等[15]分別在PET28b和PET32a質(zhì)粒上構(gòu)建了氣溶素重組載體，但其表達(dá)形式為包含體。廖鏖等[22]采用pGEX-4T-1載體成功表達(dá)了含有GST標(biāo)簽的林蛙嗜水氣單胞菌氣溶素，但未對(duì)溫度和誘導(dǎo)劑濃度進(jìn)行優(yōu)化，得到的重組蛋白均為包含體形式。朱大玲[13]研究了不同溫度下重組工程菌的表達(dá)形式，發(fā)現(xiàn)重組菌株在25 ℃時(shí)有少量Pre-AerA以可溶性蛋白形式表達(dá)，但大部分仍位于包含體中。本實(shí)驗(yàn)為了提高Pre-AerA重組蛋白的可溶性表達(dá)，降低目的蛋白的包含體含量，選擇了能提高重組蛋白可溶性的pGEX-6p-1載體，該載體在重組蛋白N端含有分子量為26 kDa的谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(GST)標(biāo)簽。但在37 ℃，1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)時(shí)重組蛋白表達(dá)形式仍為包含體(圖5)。根據(jù)Vera等[23]研究發(fā)現(xiàn)降低溫度可以提高蛋白的正確折疊，使目的蛋白包含體形成最小化。因此本實(shí)驗(yàn)嘗試將溫度降低至16 ℃，IPTG濃度降低為0.2 mmol/L后進(jìn)行誘導(dǎo)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該條件下重組蛋白為可溶性表達(dá)(圖5)。

重組蛋白在親和層析后加入PreScission蛋白酶切除N端GST標(biāo)簽，在重組蛋白N端仍含有標(biāo)簽蛋白的5個(gè)氨基酸殘基(GPLGS)，但從溶血試驗(yàn)結(jié)果分析，殘留的氨基酸未對(duì)Pre-AerA的功能產(chǎn)生影響。龔暉等[24]通過(guò)親和層析法純化得到了嗜水氣單胞菌氣溶素，發(fā)現(xiàn)其對(duì)綿羊紅細(xì)胞的溶血效價(jià)為6.4 HU/μg，涂小林等[25]通過(guò)硫酸銨沉淀、纖維素層析和凝膠過(guò)濾純化得到了氣溶素，發(fā)現(xiàn)其對(duì)鯽紅細(xì)胞的溶血效價(jià)為15.23 HU/μg。通過(guò)溶血單位比較發(fā)現(xiàn)本實(shí)驗(yàn)所得到的氣溶素溶血活性遠(yuǎn)高于以上兩種方式，初步分析原因可能與溶血試驗(yàn)方法、純化溫度條件、純化方法及終產(chǎn)物純度等因素有關(guān)。此外，氣溶素對(duì)不同動(dòng)物來(lái)源的紅細(xì)胞的敏感性也有較大差異[25]。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了aerA-pGEX-6p-1原核表達(dá)載體，通過(guò)在目的蛋白N端融合提高可溶性的GST標(biāo)簽、降低表達(dá)溫度和誘導(dǎo)劑濃度等方法，在大腸桿菌BL21(DE3)菌株中成功表達(dá)得到了可溶性Pre-AerA融合蛋白。融合蛋白經(jīng)Glutathione SepharoseTM4B親和層析柱初步純化并切除標(biāo)簽蛋白后，根據(jù)等電點(diǎn)選擇陰離子交換法對(duì)蛋白進(jìn)行精細(xì)純化，最終得到了純度較高、電荷一致的重組蛋白。本實(shí)驗(yàn)建立了重組氣溶素溶血活性的測(cè)定方法，其對(duì)綿羊紅細(xì)胞的溶血單位為54.17 HU/μg，為下一步藥物篩選和機(jī)制研究有較好的指導(dǎo)作用。