張濤，甘金華，周劍光，張林，陳建武，何力

(農業(yè)部水產品質量安全風險評估實驗室(武漢)，農業(yè)部淡水魚類種質監(jiān)督檢驗測試中心，中國水產科學研究院長江水產研究所，武漢 430223)

魚類同工酶的遺傳學研究始于20世紀60年代初期，其作為一種生化指標，已廣泛應用于魚類的物種和雜交種鑒定、倍性鑒定、親緣關系比較、系統(tǒng)分類及胚胎發(fā)育過程中基因的表達與調控、雜交育種以及種群遺傳結構分析等理論研究和實際應用領域[1-2]。

細鱗斜頜鲴(Xenocyprismicrolepis)，隸屬鯉形目(Cypriniformes)、鯉科(Cyprinidae)、鲴亞科(Xenocyprininae)、斜頜鲴屬(Plagiognathops)，廣泛分布于長江、珠江、黑龍江等流域，為中小型水體中下層魚類。由于其具有適應性強、食物鏈短、生長速度快、繁殖力強、營養(yǎng)價值高、不與草魚等主養(yǎng)品種爭食，又能攝食草魚不能利用的腐殖質和底棲藻類等特點，于20世紀70年代前后成為優(yōu)良的大水面引進增殖品種之一。隨著人工繁殖的成功，如今細鱗斜頜鲴已成為一個優(yōu)良的養(yǎng)殖品種。目前，關于細鱗斜頜鲴的研究，主要集中在生物學特性和增養(yǎng)殖技術[3-5]、年齡與生長[6]、繁殖特性[7]、細胞遺傳特性[8]、分子生物學特性[9]、營養(yǎng)學特征[10]以及生理特性[11-12]等方面。有關細鱗斜頜鲴生化遺傳特性的研究，主要集中于從生化遺傳學角度探討鲴亞科魚類的親緣關系及進化地位和細鱗斜頜鲴幾種組織乳酸脫氫酶(lactatedehydrogenase, LDH)的表達情況。朱藍菲[13]發(fā)現細鱗斜頜鲴和黃尾密鲴的LDH譜形非常相似，細鱗斜頜鲴♀×黃尾密鲴♂所獲雜交種不僅成活率高，而且可繁殖后代。曹麗琴等[14]對鲴亞科6種魚的骨骼系統(tǒng)和同工酶進行了研究，發(fā)現其生化分類和經典分類結果完全一致。楊品紅等[15]對細鱗斜頜鲴各主要組織的LDH酶帶進行了分析，發(fā)現酶譜的表達具有明顯的組織特異性。酶帶共有3個基因座位編碼(LDH-a、-b、-c)，肌肉和肝臟中分別發(fā)現1條和7條帶，其余組織均發(fā)現3條帶。張林等[16]報道了湖北丹江水庫細鱗斜頜鲴的肌肉和腎臟中LDH同工酶的表達情況，發(fā)現腎臟和肌肉組織中各有5條LDH酶帶表達，均由LDH-A和LDH-B兩個基因編碼。上述研究在一定程度上豐富了細鱗斜頜鲴生化遺傳方面的研究內容，但并沒有確定其特征生化遺傳參數。本研究通過不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳技術對細鱗斜頜鲴5種組織的LDH和蘋果酸脫氫酶(malate dehydrogenase，MDH)進行了分析，旨在更全面地探索細鱗斜頜鲴的LDHMal和MDH表達特征，同時篩選出細鱗斜頜鲴種質的特征生化遺傳參數，從而更方便地從生化遺傳角度鑒定細鱗斜頜鲴的種質特性，以期為細鱗斜頜鲴的種質標準制定、遺傳育種以及種質資源保護利用提供科學依據和理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗用細鱗斜頜鲴于2016年采自浙江湖州，共30尾，均為人工養(yǎng)殖的成魚，體重范圍175.66～323.78 g，體長范圍20.3～27.31 cm，所有樣本魚均健康無傷病。

1.2 實驗方法

1.2.1 組織酶液的制備

組織酶液的制備方法參照賀剛等[17]的方法，依據實驗情況酌情考慮變動。首先對所測樣本中10尾魚進行LDH同工酶的普遍篩查，結合初步篩查結果，若確定某種組織LDH同工酶是單態(tài)，再對所測樣本中另10尾樣本魚的該種組織該同工酶進行驗證。若驗證樣本中，該種組織LDH同工酶同樣是單態(tài)，則可初步確定該組織LDH同工酶可作為細鱗斜頜鲴種質的特征生化遺傳參數。再隨機選取剩余樣本魚為試驗對象，研究MDH同工酶在不同組織中的表達情況。

剪鰓放血后在魚尚存活時，冰浴條件下取心臟、晶狀體、肌肉、腎臟和肝臟，組織經預冷的生理鹽水沖洗干凈后用濾紙吸干水分，放入低溫冰箱(-80 ℃)保存?zhèn)溆谩?/p>

樣品稱重后放入洗凈預冷的勻漿器內，按1∶3(g/mL，m/V)加雙蒸水，冰浴條件下反復研磨至成漿狀，在4 ℃、16 097 g條件下離心3次，每次30 min，分裝上清液，-80 ℃保存以備電泳。

1.2.2 電泳方法

同工酶分析采用不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳方法，電泳時所有樣品上清液稍微解凍后與甘油溴酚藍混合點樣。LDH(酶編號：E.C.1·1·1·27)和MDH(酶編號：E.C.1·1·1·37)。濃縮膠濃度和分離膠濃度分別為4.0%和7.5%。電泳在4 ℃條件下進行，電泳緩沖系統(tǒng)為Tris-Gly系統(tǒng)，pH 8.3，每孔點樣量為20 μL。恒壓電泳，起始電壓為280 V，30 min后將電壓調至220 V，待溴酚藍條帶被電泳至膠底停止電泳，電泳時間為9.5 h。

1.2.3 染色及成像

電泳結束后，將凝膠板取下于室溫避光染色，LDH和MDH的染色分別參照張濤等[18]和賀剛等[19]的方法。待出現清晰條帶后，將凝膠板用去離子水漂洗2～3次。將漂洗后的凝膠板平放在自制燈箱上用尼康數碼相機(J5 10-100)拍照，并根據電泳圖譜結合相對遷移率繪制酶譜模式圖。

1.3 酶譜分析

同工酶的縮寫、基因座位和等位基因的命名參照Shaklee等[20]的方法，即以同工酶名稱縮寫的大寫代表酶蛋白，小寫代表編碼基因。控制同一種酶的不同基因座位據其相對遷移率Rf由大到小依次編號為1～10，酶帶分析參考熊全沫[21]的方法。

2 結果與分析

2.1 LDH的表達

從圖1A可以看出，10尾樣本魚心臟組織共檢測到8條LDH酶帶，其中LDH1～LDH6表達活性相對較強，其余兩條酶帶表達活性相對較弱，LDH1～LDH6為10尾樣本魚的共有酶帶，LDH3和LDH4為同一位點的兩個等位基因編碼。LDH7和LDH8僅在1～4號魚和7～10號魚中有檢出。LDH1、LDH2和LDH5表達活性相對較強。10尾樣本魚晶狀體組織中LDH表達的酶譜相同(圖1B)，都是單態(tài)，且為經典的5條LDH酶帶，從陽極向陰極依次對應為LDH1—B4、LDH2—A1B3、LDH3—A2B2、LDH4—A3B1和LDH5—A4。其中LDH1和LDH2表達活性相對較強，其余3條酶帶表達活性相對較弱。LDH在10尾樣本魚肌肉組織中表達程度不高，共檢測到4條LDH酶帶(圖1C)，除1號魚僅檢測到2條LDH酶帶外，其余9尾樣本魚均各檢測到4條LDH酶帶，而且2～4號樣本魚的LDH1和LDH2表達活性相對較弱，而9號和10號樣本魚LDH1和LDH2表達活性相對較強，所有樣本魚的LDH3和LDH4表達活性相對較強。LDH在10尾樣本魚腎臟組織中共檢測到5條LDH酶帶(圖1D)，其中5號魚未檢測到LDH酶帶，其余9尾樣本魚LDH酶譜相同，也是經典的5條LDH酶帶，其中LDH1和LDH5表達活性最強，其余LDH酶帶表達活性相對較弱。LDH在細鱗斜頜鲴肝臟中的表達較為復雜(圖1E)，10尾樣本魚共檢測到8條LDH酶帶，而且表現出多態(tài)，LDH8由C基因編碼[22]，2號樣本魚LDH酶帶數最多，共檢測到6條LDH酶帶，LDH1～LDH3為一獨立基因編碼區(qū)。

圖1 細鱗斜頜鯝LDH電泳圖譜A、B、C、D、E分別表示心臟、晶狀體、肌肉、腎臟和肝臟的LDH酶譜；1～10泳道分別表示不同個體的酶譜。Fig.1Electrophoretogram of LDH isozymes in Xenocypris microlepisA,B,C,D,E: electrophoretograms of LDH isozymes expressed in heart, eye, muscle, kidney and liver respectively.1～10: the zymograms of different individuals.

2.2 MDH的表達

細鱗斜頜鲴各組織MDH同工酶的表達如圖2所示，心臟、肝臟和腎臟組織中MDH酶帶可分為上清液型(s-MDH)和線粒體型(m-MDH)，晶狀體和肌肉組織中未檢測到上清液型s-MDH。心臟組織中共檢測到8條MDH酶帶(圖2 H1、H2)，m-MDH6在2號魚有表達，在1號魚未檢出，m-MDH3表達活性最強，m-MDH4次之，其余MDH酶帶表達活性相對較弱。晶狀體組織中共檢測到6條m-MDH酶帶(圖2 E1、E2)，m-MDH3表達活性最強，其余MDH酶帶表達活性相對較弱，m-MDH4在2號魚中有表達，在1號魚中未檢出。肌肉組織中共檢測到8條MDH酶帶(圖2 M1、M2)，m-MDH5表達活性較強且在1號魚中有表達，在2號魚中未檢出，除m-MDH5外，m-MDH3、m-MDH4以及m-MDH10表達活性相對較強，其余酶帶表達活性程度相對較弱。肝臟組織中檢出MDH酶帶數較少(圖2 L1、L2)，共檢測到4條，而且2尾樣本魚MDH酶譜相同，m-MDH3表達活性程度最強，m-MDH6表達活性最弱。腎臟組織中也檢測到4條MDH酶帶(圖2 K1、K2)，2號魚MDH酶帶數最少，僅3條；m-MDH4在1號魚中有檢出，在2號魚中未檢出；m-MDH3表達活性最強。

2.3 細鱗斜頜鲴特征生化遺傳參數

本研究中，10尾樣本魚的心臟、肌肉、腎臟和肝臟組織中LDH酶帶均有多態(tài)，表現在不同樣本魚的酶帶數不同，或者酶帶數相同但表達程度有差異，而所有樣本魚晶狀體LDH不僅酶帶數相同，而且分離效果相對較好，酶帶清晰，可初步確定以晶狀體LDH作為從生化遺傳特征層面鑒定細鱗斜頜鲴種質的備選對象。隨機選擇另外10尾樣本魚的晶狀體進一步電泳以驗證晶狀體LDH酶帶表達情況(圖3)，結果全為單態(tài)，所以本研究認為可以將晶狀體組織LDH作為鑒定細鱗斜頜鲴種質的特征生化遺傳參數。

圖2 細鱗斜頜鯝MDH電泳圖譜H1、H2、E1、E2、M1、M2、L1、L2、K1和K2分別表示1號魚和2號魚心臟、晶狀體、肌肉、肝臟和腎臟中的MDH酶譜。Fig.2Electrophoretogram of MDH isozymes in Xenocypris microlepisH1, H2, E1, E2, M1, M2, L1, L2, K1, K2: electrophoretograms of MDH isozymes expressed in heart, eye, muscle, liver and kidney from theNo.1 and No.2 specimen respectively.

圖3 細鱗斜頜鲴晶狀體LDH電泳圖譜1～10泳道分別代表不同個體的酶譜。Fig.3 Electrophoretogram of LDH isozymes expressed in eyes from Xenocypris microlepis1～10: the zymograms of different individuals.

3 討論

3.1 同工酶表達具有組織特異性

本研究發(fā)現細鱗斜頜鲴的心臟組織、晶狀體組織、肌肉組織、肝臟組織和腎臟組織中均能檢測到LDH同工酶和MDH同工酶的表達，表明其在細鱗斜頜鲴體內分布較廣。從研究結果來看，2種同工酶的表達均有組織特異性，主要表現在：同一種同工酶在同一尾樣本魚不同組織中是否表達、表達的酶帶數以及活性程度不同。如心臟中共檢測到8條LDH酶帶(圖1A)，而肌肉中共檢測到4條LDH酶帶(圖1C)；MDH在心臟中的表達程度比晶狀體中要高(圖2)。B4、A1B3、A2B2、A3B1和A4這5條經典的LDH同工酶酶帶的生理功能不同，盡管都催化乳酸和丙酮酸之間的相互轉化，但靠近陰極的A4的主要功能是催化乳酸脫氫后轉化為丙酮酸，丙酮酸在線粒體中進行有氧氧化，以產生更多的能量供給組織需要，而靠近陽極的B4主要參與無氧酵解，催化丙酮酸還原成乳酸[23]，一般在耗氧量大的器官或組織中A4含量較大，而在對氧氣需求量低或無需氧氣的器官或組織中B4含量相對較高。本研究中,細鱗斜頜鲴心臟中LDH酶帶數超過經典的5條帶，可能是由于重復基因的存在和表達，該現象在其他魚類中也有發(fā)生，如在鮭(Samonsala)和部分鯉形目魚類(Cypriniformes)中發(fā)現有LDH的重復位點(A1和A2，B1和B2)[24]。本研究認為，細鱗斜頜鲴心臟組織中靠近陰極的2～3條帶是A4重復基因的表達，心臟中LDH酶帶數比肌肉中多的原因可能是：心臟作為耗氧量較大的器官，其中A4含量較高，在LDH同工酶酶譜中表現為，心臟組織在靠近陰極的部位出現比肌肉中多的酶帶。不同組織同工酶的特異性與其代謝功能密切相關。MDH是一種在糖代謝、三羧酸循環(huán)過程中扮演重要角色的酶類，它能使蘋果酸脫氫后參與到細胞中糖酵解后的有氧代謝反應中，心臟組織中有氧代謝旺盛[25]。本研究中，細鱗斜頜鲴心臟MDH表達活性較晶狀體中強，與兩種組織中有氧代謝旺盛與否或者說兩者行使的生理功能密切相關。分析認為造成同工酶表達具有組織特異性的原因主要是：同工酶是基因表達的產物，其表達受到溫度、壓力、激素、氧容量和營養(yǎng)等多種內外因素調控，致使該基因在各組織間的表達時間和強度不相一致，造成酶譜特異性[26]。

魚類LDH同工酶通常由3個基因編碼，其中A、B基因所編碼的酶出現在魚類的多種組織中，而C基因位點具有組織差異性，其編碼的蛋白質電荷量與A、B不同[22, 27-28]，C基因編碼的酶在鯉形目魚類中只存在于肝臟中[13]，有的學者稱之為“肝帶”[22]，在電泳行為上，“肝帶”一般表現為向陰極遷移。本研究中細鱗斜頜鲴肝臟LDH8由C基因編碼，離陰極端較近，與白甲魚[29]和草魚[30]的實驗結果類似。

3.2 與已有研究結果的比較分析

關于細鱗斜頜鲴LDH同工酶的研究已有相關報道[13-16]，本研究與之相同的地方為都證實了細鱗斜頜鲴LDH同工酶具有組織特異性，而且肝臟中都存在C基因編碼的同工酶(本研究認為曹麗琴等[14]發(fā)現的陽極側有特異的F4同工酶存在即C帶)；不同之處在于各組織中LDH同工酶酶帶數存在差異。朱藍菲[13]的研究表明細鱗斜頜鲴心臟、晶狀體和腎臟中LDH同工酶酶帶數均為3條，而曹麗琴等[14]發(fā)現上述3種組織LDH同工酶酶帶數均為經典5條帶；張林等[16]發(fā)現細鱗斜頜鲴肌肉和腎臟中LDH同工酶酶帶數均為5條；楊品紅等[15]發(fā)現細鱗斜頜鲴心臟、晶狀體、肌肉、肝臟和腎臟組織中LDH同工酶酶帶數分別為3條、3條、1條、7條和3條。本研究發(fā)現細鱗斜頜鲴心臟、晶狀體、肌肉、肝臟和腎臟組織中LDH同工酶酶帶數分別為6～8條、5條、2～4條、4～6條和5條，與楊品紅等[15]的研究結果存在一定的差異。分析造成這一現象的原因，除了試驗樣本不同外(野生樣本或養(yǎng)殖群體)，可能還與實驗方法不同有關，如凝膠濃度不同，導致凝膠孔徑不同，使電泳過程中酶蛋白經過膠孔的分離效果有差異；同時，增大電壓或延長電泳時間可能會使一些來不及分離的酶蛋白達到有效分離，如楊品紅等[15]所采用的電壓和電泳時間分別為150 V、5～6 h，而本研究分別為220 V、9.5 h。當然不排除制樣過程中的操作產生的差異，如冰浴勻漿、離心等。如對肝臟的離心，筆者認為應盡可能增加離心次數，以排除干擾物。

除了LDH同工酶，本研究還報道了細鱗斜頜鲴各主要組織的MDH同工酶的表達情況,和大多數硬骨魚類一樣，細鱗斜頜鲴的MDH也存在互相不形成異聚體的移動較快的細胞質型(s-MDH)和移動較慢的線粒體型(m-MDH)兩種類型，但僅存在于除了晶狀體和肌肉組織外的其他3種組織中。電泳條件下細胞質型(s-MDH)泳動速度要比線粒體型(m-MDH)快。曹麗琴等[14]發(fā)現細鱗斜頜鲴心臟、晶狀體、肌肉、肝臟和腎臟組織中MDH同工酶酶帶數分別為5、4、5、4和6條，而本研究中上述5種組織MDH同工酶酶帶數分別為8、6、8、4和4條。分析認為，造成這種差異的主要原因可能是實驗方法不同，兩者的電泳條件(電壓和電泳時間)和電極緩沖液類型及pH均不同，同時，不排除樣本來源存在地理種群差異的可能性。MDH是生物糖代謝的關鍵酶之一，能催化草酰乙酸與蘋果酸之間的相互轉化[30-31]。本研究中肝臟組織MDH表達活性程度比晶狀體組織強(圖2中L1、L2的m-MDH3的著色程度較E1、E2的m-MDH3著色深)，可能與肝臟行使重要的生理功能有關，楊書婷等[32]在研究雌核發(fā)育白鰱(Hypophthalmichthysmolitrix)時也發(fā)現類似的現象。

本研究較為系統(tǒng)地報道了細鱗斜頜鲴幾種組織中LDH和MDH的表達情況，通過細鱗斜頜鲴兩種同工酶酶譜結果分析其生化遺傳特征參數，可為制定其種質標準及其雜交育種提供參考依據，目前這一技術已廣泛應用于鲴亞科以及其他魚類中[13,33-34]。

3.3 同工酶表達具有多態(tài)性

本研究中，除了晶狀體和腎臟外，同種組織在不同個體間的LDH表達酶帶數不同，除肝臟組織外，心臟、眼睛、肌肉和腎臟組織中的MDH表達酶帶數不同，不同個體同一位點酶帶的表達活性也不同，如5、6號魚和9、10號魚肌肉組織LDH1和LDH2酶帶的表達活性程度不同，表明細鱗斜頜鲴LDH和MDH具有多態(tài)性。同工酶的多態(tài)性已見不少研究報道[26,32,35]，余敏等[35]研究發(fā)現，10尾云南高背鯽(Carassiusauratus)樣本魚心臟中EST-5只在部分魚中表達，而另一部分樣本魚中未表達，存在明顯的個體差異。同工酶是基因表達的產物，不同個體同種組織中同工酶的表達與否以及表達程度強弱受到一些因子的調控。同工酶在同一物種、不同個體的相同組織中的表達差異可能與其生長發(fā)育階段[36]、健康狀態(tài)[37]、所行使生理功能[32]等均有關聯，以便于適應環(huán)境，更廣泛地消化和利用底物[26]。正因為同工酶存在個體差異性，借助同工酶研究物種鑒定與分類、親緣關系比較以及群體遺傳多樣性水平時，需對多個樣本進行驗證分析，避免被因個體差異和樣本量不足造成假象而誤導。

3.4 晶狀體組織LDH為特征生化遺傳參數

通過同工酶分析可較深入、直接地了解物種的遺傳信息，是分析生物的發(fā)育、遺傳、系統(tǒng)進化和生理生化過程的有效探針。人們對同工酶的認識是從LDH開始的，LDH也是研究最透徹的同工酶，而MDH是生物糖代謝的關鍵酶之一，這兩種同工酶在機體執(zhí)行生理功能中扮演著重要的角色。本研究中細鱗斜頜鲴晶狀體組織LDH在各實驗魚樣本中均為單態(tài)，表明LDH在細鱗斜頜鲴晶狀體組織中的表達穩(wěn)定，應符合可遺傳性的特點，故選取晶狀體組織LDH作為細鱗斜頜鲴的特征生化遺傳參數。

盡管同工酶電泳技術是研究物種遺傳變異、系統(tǒng)發(fā)育以及生理生化過程的重要手段之一，且具有快速有效、花費較少等優(yōu)點，但由于同工酶是蛋白質水平的標記，是對基因的間接反映，檢測結果往往是被修飾的基因產物，而非基因本身[38]。隨著分子生物學技術的發(fā)展，DNA分子標記內容逐漸豐富，應用領域也越來越廣，盡管花費相對昂貴，但它是DNA水平上遺傳變異的直接反應。因此，建議在進行物種種質鑒定、生理生化過程、群體遺傳變異分析以及系統(tǒng)發(fā)育進化等研究時，將同工酶電泳技術與分子生物學技術結合起來，使兩者相互印證，取長補短。

4 結論

通過采用不連續(xù)丙烯酰胺凝膠垂直板電泳，對細鱗斜頜鲴心臟、晶狀體、肌肉、肝臟和腎臟LDH和MDH同工酶進行研究，發(fā)現細鱗斜頜鲴LDH和MDH兩種同工酶均呈現出組織特異性：所測樣本魚的心臟、晶狀體、肌肉、腎臟和肝臟中LDH酶帶數分別為6～8、5、2～4、5和4～6條，MDH酶帶數分別為7～8、5～6、7～8、3～4和4條。其中，晶狀體組織LDH可作為細鱗斜頜鲴特征生化遺傳參數。本研究為制定細鱗斜頜鲴種質標準，從生化遺傳角度鑒定其種質提供參考依據。