王正全，倪玲，謝慶超，齊自元，劉源，汪立平，趙勇,，王錫昌,，謝晶,3

(1. 上海海洋大學(xué)食品學(xué)院； 2. 農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(上海)；3. 農(nóng)業(yè)部冷庫及制冷設(shè)備質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心(上海)：上海 201306)

丁香酚(eugenol)化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1，分子式為C10H12O2，常溫下呈黃色或透明的油狀液滴，是芳香植物精油中可以萃取得到的一類苯基丙烯類化合物，其化學(xué)名是4烯丙基-2-甲氧基苯酚，CAS號(hào)碼是97-53-0，密度為1.06 g/cm3，熔點(diǎn)為-7.5 ℃，沸點(diǎn)為254 ℃，在25 ℃時(shí)酸度(pKa)為10.19，可溶于水。在藥理作用上，丁香酚可與氧化鋅結(jié)合形成氧化鋅丁香酚，有局部麻醉、防腐、鎮(zhèn)痛、抗炎和抗菌的作用，并可作用于生物體弓狀核區(qū)的敏感神經(jīng)元，影響其放電作用及相關(guān)細(xì)胞通路，產(chǎn)生局部降溫等作用，因此常用于牙根管手術(shù)麻醉以及生產(chǎn)清涼油等驅(qū)蚊蟲藥物藥水[1-2]。

丁香酚可用于麻醉景觀魚，并被全球水產(chǎn)養(yǎng)殖從業(yè)人員廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)品養(yǎng)殖和運(yùn)輸[3-4]。由于丁香酚比漁用麻醉劑MS-222價(jià)格低廉，麻醉后的復(fù)蘇時(shí)間長，毒性機(jī)理和毒害作用不明確，僅有可參考的殘留限量值和半致死量[5]，國際上對(duì)其危害性一直存在爭議，因此，受政府監(jiān)督管理措施約束力小，目前已成為滬浙閩地區(qū)水產(chǎn)運(yùn)輸環(huán)節(jié)的應(yīng)用主流[4，6]。據(jù)報(bào)道，高濃度的丁香酚(0.15 mL/L)能使羅非魚出現(xiàn)短暫呼吸停止的現(xiàn)象，而低水溫時(shí)魚體對(duì)麻醉劑的吸收效果變差，需要更高劑量和更長的麻醉時(shí)間以提升魚類血液中的促腎上腺皮質(zhì)激素和皮質(zhì)醇的濃度，從而緩解魚類運(yùn)輸過程中的應(yīng)激反應(yīng)[7]。同時(shí)，國內(nèi)外養(yǎng)殖場在溫水魚和冷水魚的高密度養(yǎng)殖環(huán)節(jié)也在使用丁香酚增肥止損[8]。進(jìn)入水體的丁香酚可通過水體顆粒物和底泥吸附沉降及生物富集的方式進(jìn)入生物體內(nèi)循環(huán)代謝，帶來潛在的風(fēng)險(xiǎn)[5]。另外，商用丁香酚精油在檢測時(shí)表現(xiàn)出殘留久、可降解的特性，目前僅有部分發(fā)達(dá)國家如美國、捷克等，允許使用有限劑量的丁香酚，并給出了推薦參考值，而國內(nèi)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)使用丁香酚卻沒有遵照參考劑量(40～150 mg/L)用藥[5]，也沒有設(shè)置合理的休藥期，并存在因低溫運(yùn)輸導(dǎo)致麻醉劑效用低下而被迫追加大劑量?；畹那闆r，使丁香酚無法從短暫的暫養(yǎng)環(huán)節(jié)消除而被消費(fèi)者直接食用[5]。因而，近年來國內(nèi)外關(guān)于水產(chǎn)品及其養(yǎng)殖、運(yùn)輸和暫養(yǎng)環(huán)節(jié)的丁香酚殘留的研究顯著增多，如使用固相萃取(SPE)[9-10]、超聲萃取[10]、流通液體閃爍計(jì)數(shù)技術(shù)[11]、液液萃取[12]、分散固相萃取(d-SPE)[13]等提取方法配合內(nèi)標(biāo)物為14C-丁香酚[11]、d3-丁香酚[12]、異丁香酚[13-15]的內(nèi)標(biāo)法檢測魚肉、蝦肉基質(zhì)中丁香酚殘留的研究，還有一些對(duì)血漿[14, 16-18]、血清[19]、茶[20]、環(huán)境水[21]、純凈水[22-23]、養(yǎng)殖水體[24]等液體基質(zhì)中丁香酚殘留的研究。

圖1 丁香酚與對(duì)二苯基苯的化學(xué)結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Chemical structures of eugenol and diphenyl benzene

目前，針對(duì)液體樣品中丁香酚殘留的檢測方法不多，針對(duì)養(yǎng)殖、暫養(yǎng)環(huán)節(jié)復(fù)雜基質(zhì)水樣的檢測方法存在不足，僅有趙東豪等[22]和劉海新等[24]開發(fā)了養(yǎng)殖水(farming water)中丁香酚殘留的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)檢測法并完成了不確定度分析，柯常亮等[21]使用氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(GC-MS/MS)檢測純凈水中丁香酚的殘留。其中，HPLC-MS/MS雖然速度快卻消耗太多有機(jī)試劑，不夠經(jīng)濟(jì)和環(huán)保，而GC-MS/MS的研究則相對(duì)簡單基礎(chǔ)，還可更深入優(yōu)化。本研究旨在開創(chuàng)更經(jīng)濟(jì)環(huán)保、低消耗、高響應(yīng)的GC-MS/MS檢測運(yùn)輸和暫養(yǎng)水中丁香酚殘留的內(nèi)標(biāo)檢測方法，并應(yīng)用該方法檢測了2014年度滬浙閩地區(qū)采集的18個(gè)運(yùn)輸和26個(gè)暫養(yǎng)水樣，發(fā)現(xiàn)確實(shí)存在丁香酚殘留的情況，預(yù)期為政府監(jiān)督管理提供科學(xué)依據(jù)和支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究中使用的水樣品均為農(nóng)貿(mào)市場和批發(fā)市場隨機(jī)采樣，采樣方法依據(jù)GB/T 5750.2—2006 《生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法 水樣的采集和保存》的有關(guān)要求進(jìn)行。水樣樣品經(jīng)均質(zhì)混勻后，過0.45 μm有機(jī)相濾膜，于-40 ℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

丁香酚標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 000 μg/mL，純度為99.0%)和對(duì)二苯基苯內(nèi)標(biāo)溶液(1 000 μg/mL，純度99.5%)由上海安普生物科技有限公司提供。色譜純二氯甲烷，純度為99.0%，由SIGMA集團(tuán)提供。N-丙基乙二胺(PSA，40～60 μm)、聚合氧化鋁(PAC，純度為98.0%)，由天津博納艾杰爾科技有限公司提供。分析純NaCl，純度為99.5%；無水硫酸鎂，純度為97.0%，由國藥集團(tuán)提供。實(shí)驗(yàn)用水由Milli-Q提供。

1.2 儀器與設(shè)備

TSQ Vantage 8000三重四級(jí)桿氣質(zhì)聯(lián)用儀(配有Xcalibur1.2數(shù)據(jù)處理系統(tǒng))，由美國Thermo Fisher Scientific公司提供。小型設(shè)備：如國產(chǎn)JJ-2 組織搗碎勻漿機(jī)由武漢格萊莫檢測設(shè)備有限公司提供；TD5A_WS型臺(tái)式低速離心機(jī)由長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司提供；RE- S2A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀和SHB-IIIA循環(huán)水式真空泵由上海亞榮儀器廠提供；江蘇天翎 XH-D旋渦混合器由江蘇天翎儀器有限公司提供；ps-70A超聲波清洗儀由深華泰儀器有限公司提供；SartoriusBP211D分析天平由美國Sartorius公司提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品前處理

取樣品20.0 mL(精確到0.1 mL)[23]，置于50 mL離心管中，后續(xù)步驟如圖2所示。此過程中要注意2點(diǎn)，其一：若有機(jī)相仍出現(xiàn)渾濁或乳化的情況，可以向100 mL雞心瓶中加入4 g無水硫酸鎂后，振蕩超聲10 s，并渦旋10 s，混勻、靜置分層后，取有機(jī)相；其二：2 mL正己烷定容后需要先后分別過2層有機(jī)相濾膜(0.45 μm和0.22 μm)，目的是最大限度除去顆粒物，同時(shí)保證上機(jī)檢測時(shí)進(jìn)樣體積大于0.5 mL。

1.3.2 色譜條件

色譜柱選用HP-5 MS氣相色譜石英毛細(xì)柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)。升溫程序：80 ℃保持1 min；以30 ℃/min升至280 ℃，保持4 min；再以30 ℃/min升至300 ℃，維持2 min。載氣(He)流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量1.0 μL，不分流進(jìn)樣。

1.3.3 質(zhì)譜條件

電子轟擊離子源電噴霧(ESI)正離子模式同時(shí)掃描；電子能量70 eV；傳輸線溫度280 ℃；離子源溫度280 ℃；采集方式選擇反應(yīng)監(jiān)控模式(select reaction monitor，SRM)；質(zhì)量掃描范圍m/z35～500，離子對(duì)信息參見表1。

圖2 運(yùn)輸水和暫養(yǎng)水中丁香酚的萃取步驟Fig.2 The extraction protocol of eugenol from transport water and temporary water

表1 丁香酚和對(duì)二苯基苯質(zhì)譜檢測參數(shù)Tab.1 The mass spectrometry parameters for determination of eugenol and diphenyl benzene

名稱保留時(shí)間/min母離子m/z子離子m/z碰撞能量/eV駐留時(shí)間/msNameRetention timeParent ionProduction ionCollision energyDell time丁香酚103.177.016.04.04.05.8131.177.024.04.0164.177.126.04.04.0對(duì)二苯基苯228.1226.126.01.01.09.3229.1228.110.01.0230.1228.124.01.01.0

1.4 結(jié)果計(jì)算

運(yùn)輸和暫養(yǎng)水樣品中丁香酚殘留量測定結(jié)果按內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算，計(jì)算結(jié)果需扣除空白值。

式(1)

式中：Xi為樣品中丁香酚的含量(μg/L)；Ci為樣品中丁香酚的進(jìn)樣質(zhì)量濃度(ng/L)；V為最終定容體積(mL)；Vi為樣品體積(L)。對(duì)于超出線性范圍的陽性樣品,使用單點(diǎn)定量法計(jì)算結(jié)果。

1.5 數(shù)據(jù)處理

用Microsoft Excel 2010和Origin 8.0軟件進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸分析和確認(rèn)，SPSS 20.0用于精密度計(jì)算。

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理方法的優(yōu)化

柯常亮等[23]開發(fā)的暫養(yǎng)水的丁香酚檢測方法可以簡單有效地檢出暫養(yǎng)水基質(zhì)中的丁香酚殘留，使用的儀器是氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，經(jīng)乙酸乙酯萃取水相(乙酸乙酯與水相完全互溶)后，用NaCl鹽析分離乙酸乙酯和水相的混合液，再用無水硫酸鈉去除分離出來的乙酸乙酯中的殘余水分，干燥后進(jìn)樣檢測。該方法相對(duì)簡單，僅使用一步類似于QuEChERS方法的優(yōu)化d-SPE法，在開發(fā)方法的時(shí)候較易實(shí)現(xiàn)高回收率，而在實(shí)際環(huán)境復(fù)雜樣品檢測時(shí)容易出現(xiàn)凈化不完全、干擾雜質(zhì)多、萃取不完全的現(xiàn)象。對(duì)此，本研究優(yōu)化了暫養(yǎng)水的前處理步驟，通過PAC先絮凝沉淀出帶負(fù)電荷的膠體，達(dá)到除菌、脫色和除臭的作用，再用PSA吸附色素、糖和有機(jī)酸，然后使用鹽析破除乳化，去除有機(jī)相中的的多余水分，后配合二氯甲烷和正己烷形成三相體系萃取，凈化和萃取步驟類似于一個(gè)簡化型基質(zhì)分散固相萃取(matrix solid phase dispersion, MSPD)方法，是專門針對(duì)基質(zhì)復(fù)雜的養(yǎng)殖水和運(yùn)輸水開發(fā)的方法。

2.2 回收率、檢測限和精密度

本研究開展了1.5～50.0 μg/L的丁香酚添加實(shí)驗(yàn)，內(nèi)標(biāo)物為對(duì)二苯基苯，添加質(zhì)量濃度為5.0 μg/L，同時(shí)對(duì)照空白實(shí)驗(yàn)，獲得方法回收率和精密度(圖3和表2)。結(jié)果表明，丁香酚的方法檢出限為(LOD)0.5 μg/L，定量限(LOQ)為1.5 μg/L，方法回收率為82.3%～109.9%，6次平行測定結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小于6.9%，方法符合線性特征，其線性回歸方程為Y=-0.006 424+0.000 391 7X，相關(guān)系數(shù)r為0.993 6，LOQ添加水平的信噪比S/N為10.95。方法回收率和LOQ與前言中的國內(nèi)外研究進(jìn)展相比，LOQ僅次于趙東豪等(0.05 μg/L)和柯常亮等(0.2 μg/L)的純凈水和暫養(yǎng)水的檢測方法，方法回收率與二者相當(dāng)[22-23]。

圖3 添加5.0 μg·L-1的內(nèi)標(biāo)物對(duì)二苯基苯的運(yùn)輸水樣品基質(zhì)的的三重四級(jí)桿氣質(zhì)抽取離子圖：tR=5.77為丁香酚(A)，tR=9.27為內(nèi)標(biāo)物對(duì)二苯基苯(B)Fig.3Extracted ion chromatograms of eugenol and diphenyl benzene in spiked transport water sample with 5.0 μg·L-1internal standard using GC-MS. tR=5.77 is the peak of eugenol (A), tR=9.27 is the peak of diphenyl benzene (B)

表2 運(yùn)輸水樣品基質(zhì)中丁香酚內(nèi)標(biāo)法添加實(shí)驗(yàn)回收率和相對(duì)偏差Tab.2 Recoveries and relative standard deviationsof eugenol from spiked transport water samples on sixlevels using internal standard method

n=6

2.3 穩(wěn)定性和重現(xiàn)性

樣品經(jīng)前處理后，再分別添加5.0 μg/L丁香酚與內(nèi)標(biāo)物，于室溫下靜置0、12和24 h后，藥物濃度變化小，平均RSD<12%(n=6)。相同運(yùn)輸水樣基質(zhì)的10個(gè)5.0 μg/L丁香酚及內(nèi)標(biāo)物添加平行樣品同時(shí)檢測結(jié)果顯示，實(shí)測質(zhì)量濃度為(4.9±0.2)μg/L，RSD<6%。該結(jié)果說明，本方法處理的丁香酚樣品在24 h之內(nèi)進(jìn)樣是穩(wěn)定可靠的，基質(zhì)影響波動(dòng)幅度小，適合于大批量樣品前處理和進(jìn)樣檢測分析，這與焦亞琴等[18]對(duì)鯉血液中丁香酚含量檢測結(jié)果基本相同，但其鯉血液最低添加水平為0.041 4 mg/L，高于本研究中運(yùn)輸和暫養(yǎng)水的最低添加水平1.5 μg/L[20]。

2.4 方法特點(diǎn)

由于鮮活水產(chǎn)品的暫養(yǎng)水樣中干擾物相對(duì)較少，基質(zhì)比血液樣品和乳制品簡單，多數(shù)情況下暫養(yǎng)水樣中相對(duì)懸浮物和顆粒物少，顯得澄清透明；而運(yùn)輸水樣多因魚體分泌黏液含有蛋白質(zhì)、糖分和氨氮排泄物而致顏色昏黃，通常渾濁且呈現(xiàn)膠體狀，甚至伴有惡臭等異味，但經(jīng)過抽濾靜置后也能逐步恢復(fù)澄清(但仍保持膠體狀態(tài))。這使得養(yǎng)殖水樣前處理過程中，若單靠簡單的液液萃取法，會(huì)將多余的蛋白質(zhì)、多糖和胺類物質(zhì)中的脂溶性成分一同被富集在萃取有機(jī)相中，基質(zhì)干擾嚴(yán)重[22-23]。本方法針對(duì)此類情況預(yù)先對(duì)有限的水樣品進(jìn)行簡單的絮凝沉淀凈水，凈化的水樣再用PSA去除色素、糖和有機(jī)酸，用鹽析的方式破除乳化并促進(jìn)丁香酚富集于有機(jī)相中，是一種簡單有效的MSPD前處理方法。

實(shí)驗(yàn)證明，使用異丁香酚作為內(nèi)標(biāo)物檢測運(yùn)輸和暫養(yǎng)水樣中的丁香酚時(shí)，異丁香酚放置2個(gè)月以上時(shí)會(huì)出現(xiàn)轉(zhuǎn)化為丁香酚，進(jìn)而干擾待測物檢測的情況，若以對(duì)二苯基苯為內(nèi)標(biāo)物時(shí)則不存在類似現(xiàn)象。當(dāng)然，若有條件購買d3-丁香酚，推薦使用更好的同位素內(nèi)標(biāo)物代替，但檢測單位需要綜合考慮成本和訂購特殊標(biāo)準(zhǔn)品的時(shí)間消耗問題。圖3給出了水樣基質(zhì)中丁香酚與內(nèi)標(biāo)物對(duì)二苯基苯的三重四級(jí)桿的氣質(zhì)抽取離子圖，可以看出丁香酚與內(nèi)標(biāo)物分離較好，干擾少，易于定性定量分析。

另外，本實(shí)驗(yàn)先加入二氯甲烷沉于水相底部做第一輪萃取后，再加入正己烷形成覆蓋層并靜置3 min二次萃取，然后渦旋混合三相體系，使二氯甲烷層與正己烷層合并為一相，即變?yōu)樗嗪陀袡C(jī)相的兩項(xiàng)體系，收集有機(jī)相可有效提取水樣品基質(zhì)中的揮發(fā)性物質(zhì)[18]，從而提升萃取效率[21]。

2.5 方法的實(shí)際應(yīng)用

自2013年摸底排查滬浙閩地區(qū)水產(chǎn)品和運(yùn)輸環(huán)節(jié)的麻醉劑及方法開發(fā)以來，本方法被成功應(yīng)用于2014年7月排查的滬浙閩地區(qū)18個(gè)運(yùn)輸和26個(gè)暫養(yǎng)水樣，檢測結(jié)果如表3所示。結(jié)果顯示，運(yùn)輸水樣中7個(gè)樣品陽性檢出，檢出率為38.89%，而暫養(yǎng)水樣中6個(gè)樣品陽性檢出，檢出率為23.08%。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，中高檔鮮活魚類(如大菱鲆、石斑魚、真鯛、大黃魚)，4種魚中除大黃魚外，其他3種使用含丁香酚水體?；畹默F(xiàn)象更加突出，同時(shí)發(fā)現(xiàn)個(gè)別的鱸和石斑魚運(yùn)輸和暫養(yǎng)水樣的陽性丁香酚殘留具有相關(guān)性[22]。

表3 2014年滬、浙、閩售水產(chǎn)品的運(yùn)輸水和暫養(yǎng)水水樣中的丁香酚殘留量Tab.3 Residue of eugenol in transport water and temporary water samples from Shanghai,Zhejiang and Fujian Provinces in 2014 μg·L-1，n=3

注：“—”代表未采集到樣品；“ND”代表沒有檢測出丁香酚。

3 小結(jié)

滬浙閩地區(qū)水產(chǎn)品運(yùn)輸環(huán)節(jié)會(huì)使用丁香酚麻醉運(yùn)輸和暫養(yǎng)?；?，其對(duì)應(yīng)的運(yùn)輸和暫養(yǎng)水樣經(jīng)簡單的MSPD凈化后，再經(jīng)二氯甲烷和正己烷萃取富集，簡單離心后直接濃縮至干，定容后采用氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜，以對(duì)二苯基苯為內(nèi)標(biāo)定量檢測。經(jīng)實(shí)踐證明，該方法在針對(duì)水產(chǎn)品運(yùn)輸水和暫養(yǎng)水等復(fù)雜基質(zhì)檢測時(shí)，檢出限為0.5 μg/L，定量限為1.5 μg/L，在1.5～50.0 μg/L線性范圍內(nèi)，回收率為82.3%-109.9%,在18個(gè)運(yùn)輸水樣和26個(gè)暫養(yǎng)水樣的檢測中，陽性檢出率大于20%，方法RSD<6.9%,平行進(jìn)樣RSD<6%，檢出限低、穩(wěn)定性好，是現(xiàn)有漁業(yè)運(yùn)輸水樣檢測方法的有效補(bǔ)充和優(yōu)化改良。預(yù)期在解決丁香酚環(huán)境水樣檢驗(yàn)檢測可依據(jù)的文獻(xiàn)和標(biāo)準(zhǔn)較少的情況下，能夠產(chǎn)生一定的社會(huì)應(yīng)用和參考價(jià)值，為水產(chǎn)品流通領(lǐng)域的安全監(jiān)控提供技術(shù)支持。