史艷偉，孟麗華，江桂英，簡(jiǎn)康，時(shí)彥民

(1.濟(jì)寧市漁業(yè)監(jiān)測(cè)站； 2.濟(jì)寧市任城區(qū)水產(chǎn)局:山東 濟(jì)寧272000)

喹乙醇屬于喹噁啉類(lèi)化合物，是一種化學(xué)合成的抗菌促生長(zhǎng)劑[1]。喹乙醇曾一度在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中作為一種較好的生長(zhǎng)促進(jìn)劑添加于飼料中使用，可促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)，提高飼料轉(zhuǎn)化率和利用率[2]。喹乙醇本身不穩(wěn)定，在動(dòng)物體內(nèi)的代謝產(chǎn)物有10余種，其中3-甲基喹噁啉-2羧酸(MQCA)是主要代謝物，理化性質(zhì)相對(duì)穩(wěn)定，是監(jiān)控喹乙醇常用的目標(biāo)殘留物[3]，也是國(guó)際食品法典委員會(huì)認(rèn)定的標(biāo)示殘留物。3-甲基喹噁啉-2羧酸(MQCA)能抑制脫氧核糖核酸的合成，可導(dǎo)致染色體畸變，屬致癌物[4]，不僅對(duì)水生動(dòng)物的健康造成威脅[5]，進(jìn)入人體后也會(huì)造成人體慢性中毒、產(chǎn)生耐藥性及三致等危害[6]。因此，很多國(guó)家禁止在水產(chǎn)養(yǎng)殖中使用喹乙醇，如歐盟在EC2788/98決議中已將喹乙醇列為禁用藥[7]?！吨袊?guó)獸藥典》也明確規(guī)定，喹乙醇被禁止用于家禽及水產(chǎn)養(yǎng)殖[8]。但是，由于經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)使和科學(xué)知識(shí)的缺乏，養(yǎng)殖過(guò)程中違規(guī)使用喹乙醇作為飼料添加劑的現(xiàn)象仍然存在。有研究表明[9-10]，不能被動(dòng)物機(jī)體吸收的喹乙醇及其代謝物常以糞尿、飼料等形式排入生態(tài)環(huán)境，對(duì)土壤和水體造成污染，對(duì)生態(tài)環(huán)境構(gòu)成潛在危害。因此，檢測(cè)喹乙醇及其代謝物在水產(chǎn)品及養(yǎng)殖環(huán)境中的殘留已非常必要。

目前，涉及MQCA殘留檢測(cè)的研究集中在水產(chǎn)品[11-15]，動(dòng)物組織[16-19]和奶類(lèi)[20]等食品相關(guān)領(lǐng)域，對(duì)于MQCA在環(huán)境中的殘留檢測(cè)報(bào)道較少，僅見(jiàn)張沖[21]研究了喹乙醇及其代謝物在環(huán)境中的遷移轉(zhuǎn)化規(guī)律及分析方法，漁業(yè)用水中MQCA的殘留檢測(cè)方法未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究建立了適用于漁業(yè)用水中測(cè)定MQCA的高效液相色譜法，為喹乙醇代謝物殘留檢測(cè)提供了靈敏度高、重現(xiàn)性好的定量分析方法，為保護(hù)漁業(yè)環(huán)境、保障水產(chǎn)品質(zhì)量安全提供了有力的技術(shù)支撐。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 儀器及試劑

主要包括：Agilent 1200型液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司)；分析天平(德國(guó)賽得利斯，感量0.000 1 g)；旋渦混合器(上海醫(yī)大儀器有限公司)；玻璃離心管(天玻儀器廠，10 mL)；氮吹儀(美國(guó)Agilent公司)；固相萃取裝置(美國(guó)Agilent公司)；PAX固相萃取柱60 mg，3 mL(Agela)；甲醇、乙酸乙酯、甲酸(色譜純，科密歐化學(xué)試劑有限公司)；鹽酸(優(yōu)級(jí)純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；乙酸鈉(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；1.0%甲酸水溶液；0.05 mol/L乙酸鈉甲醇溶液；2%甲酸乙酸乙酯溶液；3-甲基喹噁啉-2-羧酸(MQCA)標(biāo)準(zhǔn)品(德國(guó)Dr. Ehrenstorfer，純度大于98.0%)。

實(shí)驗(yàn)用水符合GB/T 6682—2008中一級(jí)水的規(guī)定。所用試劑除另有指定外，均為分析純。

1.2 樣品預(yù)處理

依次用3 mL甲醇、3 mL水活化PAX固相萃取柱，然后準(zhǔn)確量取60 mL經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾后的漁業(yè)用水(采自山東省濟(jì)寧市水產(chǎn)良種繁育場(chǎng))，轉(zhuǎn)移至PAX固相萃取柱中，控制過(guò)柱流速小于1 mL/min，用6 mL乙酸鈉-甲醇溶液淋洗固相萃取柱，抽干，最后用10 mL含2%甲酸的乙酸乙酯溶液洗脫。洗脫液在40 ℃條件下用氮?dú)獯蹈桑蹈珊蟮臍埩粑镉?.00 mL流動(dòng)相溶液溶解，超聲1 min，渦旋混合1 min，過(guò)0.22 μm濾膜，待測(cè)。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)系列測(cè)定

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配置

100 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：準(zhǔn)確稱(chēng)取MQCA標(biāo)準(zhǔn)品0.010 0 g，用甲醇溶解并定容于100 mL棕色容量瓶中，-18 ℃冰箱中避光保存，有效期為3個(gè)月。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)使用液配置

10 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)使用溶液：準(zhǔn)確移取100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液10.0 mL，定容至100 mL，0～4 ℃避光保存，有效期為1周。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

準(zhǔn)確量取MQCA標(biāo)準(zhǔn)使用液，用流動(dòng)相溶液(甲醇-1.0%甲酸水溶液,體積比為4∶6)分別稀釋成質(zhì)量濃度為0.01、0.05、0.25、0.50和1.00 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。各取50 μL進(jìn)樣，以MQCA標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度作為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)峰面積作為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4 色譜條件

色譜柱為Agilent Zorbax XDB-C18柱，250.0 mm×4.6 mm(i.d.)，5.0 μm(或性能相當(dāng)者)。流動(dòng)相為甲醇-1.0%甲酸水溶液(4∶6，V/V)，等度洗脫。流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)320 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量50 μL。

1.5 結(jié)果計(jì)算

試樣中MQCA殘留量按公式(1)計(jì)算，計(jì)算結(jié)果需扣除空白值，結(jié)果保留3位有效數(shù)字。

(1)

式(1)中：X為樣品中MQCA殘留量(mg/L)；C為樣品溶液中MQCA的測(cè)量濃度(μg/mL)；V為樣品溶液最終定容體積(mL)；V0為樣品溶液量取體積(mL)。

2 結(jié)果與討論

2.1 固相萃取柱的選擇

本實(shí)驗(yàn)選擇PAX-SPE(60 mg/3 mL)柱作為固相萃取柱。本研究比較了HLB(60 mg/3 mL)，PAX-SPE(60 mg/3 mL)以及C18(100 mg/1 mL)3種不同的固相萃取柱對(duì)凈化效果的影響(n=6)，結(jié)果表明，MQCA在3種固相萃取柱中回收率的大小為：PAX-SPE>HLB>C18(圖1)。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇利用回收率最高的PAX-SPE(60 mg/3 mL)柱。固相萃取是一種利用選擇性吸附與選擇性洗脫的液相色譜分離原理的前處理方法，主要依靠固相萃取柱來(lái)進(jìn)行，根據(jù)不同目標(biāo)化合物的性質(zhì)選擇不同的固相萃取柱，其填料的類(lèi)型決定了吸附能力的大小以及回收率的高低。PAX-SPE是以陽(yáng)離子交換混合機(jī)理水可浸潤(rùn)型聚合物為基質(zhì)的萃取小柱，更有利于MQCA的吸附，因此試驗(yàn)過(guò)程損失少，回收率高。

圖1 不同類(lèi)型固相萃取柱對(duì)MQCA回收率的影響(n=6)MD(%)表示開(kāi)均差。下同。Fig.1Eeffect of SPE column type on MQCArecovery rate(n=6)MD(%)shows mean deviation.The same below.

2.2 上樣體積對(duì)回收率的影響

以過(guò)濾后的漁業(yè)養(yǎng)殖用水為基底，加入MQCA標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別考察10、20、30、40、50、60、70和80 mL上樣體積(n=6)對(duì)回收率的影響。如圖2所示，回收率隨上樣體積增加而增大，至60 mL時(shí)達(dá)最大值，之后有下降趨勢(shì)，這可能是由于上樣量少時(shí)，損失的目標(biāo)物相對(duì)于上樣量較大，而上樣體積過(guò)大時(shí)，固相萃取柱不能及時(shí)吸附目標(biāo)物，導(dǎo)致目標(biāo)物損失，影響回收率。因此最終上樣體積選擇60 mL。

2.3 洗脫液用量對(duì)回收率的影響

用含2%甲酸的乙酸乙酯溶液作為洗脫液，分別考察3、6、9、12及15 mL洗脫液用量(n=6)對(duì)回收率的影響，結(jié)果如圖3所示。隨著洗脫液用量的增大，樣品加標(biāo)回收率逐漸升高，至9 mL時(shí)達(dá)峰值，后隨著洗脫液用量的繼續(xù)增大，樣品加標(biāo)回收率逐漸趨于平穩(wěn)并略有下降，可能原因是隨著洗脫液用量的增大，被洗脫下來(lái)的目標(biāo)物逐漸增多，因此回收率逐漸增大。當(dāng)洗脫液用量達(dá)到9 mL后，增大洗脫液用量對(duì)增加目標(biāo)物的洗脫量不明顯。另由于洗脫液用量增大，在氮吹步驟會(huì)增大目標(biāo)物的損失，導(dǎo)致回收率會(huì)略有下降趨勢(shì)。因此試驗(yàn)選擇洗脫液用量為10 mL。

圖2 上樣體積對(duì)MQCA回收率的影響(n=6)Fig.2Effect of sample volume on MQCA recovery rate(n=6)

圖3 洗脫溶劑用量對(duì)MQCA回收率的影響(n=6)Fig.3Effect of elution solvent dosage on MQCA recovery rate(n=6)

2.4 流動(dòng)相對(duì)分離效果的影響

經(jīng)查閱文獻(xiàn)[6,22-23]，發(fā)現(xiàn)HPLC測(cè)定MQCA含量時(shí)常用的流動(dòng)相為1%甲酸水溶液-甲醇(6∶4，V/V)，通常以甲醇、水和乙酸-乙酸鈉緩沖液組成梯度洗脫或以0.1%甲酸水-乙腈進(jìn)行梯度洗脫。經(jīng)試驗(yàn)比較，流動(dòng)相在紫外波長(zhǎng)為320 nm的條件下，以上所提及流動(dòng)相都能分離目標(biāo)物。但本研究以1%甲酸水溶液-甲醇(60∶40，V/V)作為流動(dòng)相時(shí)峰形和靈敏度最好，所以采用1%甲酸水溶液-甲醇(60∶40，V/V)作為流動(dòng)相。

2.5色譜柱對(duì)分離效果的影響

不同的色譜柱對(duì)分離效果的影響見(jiàn)圖4，使用ZORBAX SB-CN(250.0 mm×4.6 mm，5.0 μm)、XDB-C18柱(250.0 mm×4.6 mm，5.0 μm)、ZORBAX SB-C18柱(250.0 mm×4.6 mm，5.0 μm)分別進(jìn)行色譜分離試驗(yàn)，ZORBAX SB-C18柱和ZORBAX SB-CN柱均出峰較早，但不能將目標(biāo)物和雜質(zhì)峰完全分離，并且響應(yīng)值較低。XDB-C18柱出峰較晚，但能夠?qū)⒛繕?biāo)峰與雜質(zhì)峰完全分離，且峰型很好，因此選擇XDB-C18柱作為液相色譜分離柱。

圖4 不同色譜柱對(duì)分離效果的影響(A)ZORBAX SB-CN柱；(B)XDB-C18柱；(C)ZORBAX SB-C18柱。Fig.4Effect of different chromatographic column on separation effect(A)ZORBAX SB-CN column；(B)XDB-C18 column；(C)ZORBAX SB-C18 column.

2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限

配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，其中MQCA質(zhì)量濃度分別為0.01、0.05、0.25、0.50和1.00 μg/mL，按照本試驗(yàn)的儀器條件上機(jī)測(cè)試，以MQCA的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到MQCA標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=64.526x-0.010，相關(guān)系數(shù)r=0.999 91。式中，x代表MQCA質(zhì)量濃度，y代表MQCA峰面積。分別在空白樣品中添加MQCA標(biāo)準(zhǔn)溶液，按信噪比大于3計(jì)算，確定該方法的檢出限為0.01 mg/L;按信噪比大于10計(jì)算,定量限為 0.02 mg/L(表1)。

表1 MQCA藥物線性范圍和檢出限Tab. 1 The linear range and detection limit of MQCA

2.7 精密度與準(zhǔn)確度

標(biāo)準(zhǔn)品、添加樣品及空白樣品色譜圖見(jiàn)圖5，實(shí)驗(yàn)條件下，基線穩(wěn)定，樣品能與雜質(zhì)有效分離，響應(yīng)值高，可滿足實(shí)驗(yàn)要求。向空白樣品中添加標(biāo)準(zhǔn)溶液，制成2倍、5倍和10倍檢出限的3組不同含量的標(biāo)準(zhǔn)添加樣品，每個(gè)含量樣品平行測(cè)定6次，計(jì)算方法回收率和精密度。結(jié)果表明，MQCA添加量為0.02～0.10 mg/L時(shí)，平均回收率79.0%～99.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%(表2)。

表2 漁業(yè)用水中MQCA藥物加標(biāo)回收率及精密度Tab.2 Recoveries and precision of MQCA infishery water n=6

圖5 MQCA液相色譜圖A: MQCA標(biāo)準(zhǔn)溶液液相色譜圖(0.5 mg·L-1MQCA)；B：水樣加標(biāo)液相色譜圖(0.02 mg·L-1MQCA)；C：水樣空白液相色譜圖。Fig.5 Liquid chromatography of MQCAA：Liquid chromatography of MQCA standard solution (0.5 mg·L-1 MQCA)；B：Liquid chromatography of water sample with MQCA(0.02 mg·L-1 MQCA)；C: Liquid chromatography of control sample.

2.8 實(shí)際樣品檢測(cè)

分析了8份采自濟(jì)寧市采煤塌陷區(qū)重點(diǎn)養(yǎng)殖區(qū)不同水域的漁業(yè)用水(表3)。結(jié)果表明，8個(gè)站位中，MQCA組分的濃度均低于檢出限。

表3 8個(gè)采樣站點(diǎn)漁業(yè)用水中MQCA的檢測(cè)結(jié)果Tab.3 Detection result of MQCA in fishery water from 8 stations mg·L-1

注：站點(diǎn)1為西故塌陷區(qū)1；站點(diǎn)2為西故塌陷區(qū)2；站點(diǎn)3為陵城鎮(zhèn)塌陷區(qū)1；站點(diǎn)4為陵城鎮(zhèn)塌陷區(qū)2；站點(diǎn)5為太白湖區(qū)塌陷區(qū)1；站點(diǎn)6為太白湖區(qū)塌陷區(qū)2；站點(diǎn)7為興隆莊塌陷區(qū)1；站點(diǎn)8為興隆莊塌陷區(qū)2。

3 結(jié)論

本研究建立了一種簡(jiǎn)單、快速檢測(cè)漁業(yè)用水中喹乙醇代謝物殘留量的分析方法。該方法MQCA的檢出限為0.01 mg/L，定量限為0.02 mg/L，平均加標(biāo)回收率為79.0%～99.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在7.38%～9.12%之間。經(jīng)對(duì)實(shí)際漁業(yè)用水樣品檢測(cè),證明該方法具有靈敏、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、快速等優(yōu)點(diǎn)，凈化效果好，精確度高，且重復(fù)性好，為漁業(yè)用水中喹乙醇代謝物殘留的檢測(cè)提供參考。