，， ，

(河北科技大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北 石家莊 050018)

小麥?zhǔn)鞘澜缟现匾募Z食作物之一，鹽堿、干旱等環(huán)境脅迫嚴(yán)重影響其產(chǎn)量[1]。小麥在非生物脅迫條件下會(huì)啟動(dòng)一系列相應(yīng)的耐逆機(jī)制來(lái)抵御環(huán)境脅迫[2-5]。研究小麥逆境脅迫相關(guān)基因，對(duì)小麥的遺傳改良具有重要意義[6]。液泡膜H+轉(zhuǎn)運(yùn)無(wú)機(jī)焦磷酸酶(Vacuolar H+-pyrophosphatase，VP)是一種區(qū)別于H+-ATPase的H+轉(zhuǎn)運(yùn)酶，廣泛存在于植物、少數(shù)藻類、原生動(dòng)物、細(xì)菌以及原始細(xì)菌中[7]。在液泡膜上，VP能夠把無(wú)機(jī)焦磷酸水解產(chǎn)生自由能的過(guò)程和H+跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)相耦聯(lián)，在將焦磷酸水解為2個(gè)磷酸并釋放自由能的同時(shí)，幫助細(xì)胞質(zhì)中的H+經(jīng)液泡膜進(jìn)入液泡內(nèi)，與液泡膜H+-ATPase一起形成H+跨液泡膜電化學(xué)梯度，為各種溶質(zhì)(如陽(yáng)離子、陰離子、氨基酸和糖類等)分子跨液泡膜的次級(jí)主動(dòng)運(yùn)輸提供驅(qū)動(dòng)力[8]。由此促進(jìn)的Na+在液泡中的區(qū)隔化，不僅使細(xì)胞避免離子毒害，還有助于細(xì)胞的滲透調(diào)節(jié)。因此，研究VP基因?qū)τ谏钊肓私庵参锟鼓鏅C(jī)制具有重要意義。目前，已經(jīng)從大麥、煙草、水稻等植物中克隆得到VP基因[9-11]。然而關(guān)于小麥VP基因的研究報(bào)道較少。為此，從耐鹽小麥品種德抗961中克隆小麥VP基因，對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，然后構(gòu)建植物表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化擬南芥，并對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥的純合體后代進(jìn)行耐鹽性鑒定，為后續(xù)研究小麥VP基因在植物耐鹽脅迫中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

耐鹽小麥品種德抗961，由中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物研究所王道文博士惠贈(zèng)。擬南芥Columbia 生態(tài)型、植物表達(dá)載體pCAMBIA1380、大腸桿菌DH5α 菌株及根癌農(nóng)桿菌GV3101菌株均由河南科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 小麥VP基因的克隆

1.2.1.1 3′-RACE法獲得小麥VP基因3′末端序列 將小麥幼苗用Hoagland’s營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)到兩葉一心期，用150 mmol/L NaCl處理1 h取全植株，按照Trizol試劑盒(北京賽百盛基因技術(shù)有限公司)說(shuō)明書(shū)提取小麥總RNA。取1 μg總RNA，按照Promega公司反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV操作說(shuō)明書(shū)合成cDNA，反轉(zhuǎn)錄引物為RACERT：5′-AAGCAGTGGTAACAACGCAGAGTAC(T)30-3′。

根據(jù)已報(bào)道的大麥、玉米、水稻的VP基因保守區(qū)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，引物為T(mén)VP3RACE-S：5′-GCYGAYCTTGTYGGCAARGTT-3′和TVP3RACE-A：5′-GCAGTGGTAACAACGCAGAGT-3′。以獲得的小麥cDNA為模板，使用引物TVP3RACE-S和TVP3RACE-A進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為：98 ℃ 30 s;98 ℃ 10 s、50 ℃ 30 s、72 ℃ 80 s，15個(gè)循環(huán)；98 ℃ 10 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 80 s，20個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物回收后測(cè)序。

1.2.1.2 5′-RACE法獲得小麥VP基因5′末端序列 以小麥cDNA為模板，使用上游外側(cè)特異性引物GSP1：TVP-5-OUT(5′-GCTTCTTCAGAGCAGGTTCA-3′)和5′RACE外側(cè)引物(5′-CATGGCTACATGCTGACAGCCTA-3′)進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為：98 ℃ 30 s;98 ℃ 10 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。將第一輪PCR產(chǎn)物進(jìn)行50倍稀釋，再使用上游內(nèi)側(cè)引物GSP2：TVP-5-IN(5′-GCAAAGAGCGTGGTGAGCAA-3′)和5′RACE內(nèi)側(cè)引物(5′-CGCGGATCCACAGCCTACTGATGATCAGTCGATG-3′)進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為:98 ℃ 30 s；98 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物回收后測(cè)序。

1.2.1.3 小麥VP基因全長(zhǎng)序列的獲得 對(duì)獲得的3′和5′端小麥VP基因序列進(jìn)行分析，利用DNAMAN 5.2.2軟件拼接小麥VP基因的全長(zhǎng)cDNA序列，然后設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增VP基因全長(zhǎng)cDNA。引物序列為T(mén)VPQC-S：5′-CGGGATCCATGGCGATCCTCGGGGAG-3′和TVPQC-A：5′-CCCAAGCTTCTAGATGTACCTGAACAGCACGC-3′。以小麥cDNA為模板，利用SuperStar高保真DNA聚合酶(GenStar公司)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系如下：10×反應(yīng)緩沖液 2.5 μL，10 mmol/L dNTPs 0.5 μL，2.5 U/μLTaq酶 0.3 μL，模板1.0 μL，正、反向引物(10 μmol/L)各0.5 μL，加去離子無(wú)菌水至總體積25 μL。PCR反應(yīng)條件為：98 ℃ 30 s；98 ℃ 10 s、68 ℃ 30 s、72 ℃ 100 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物回收后測(cè)序，測(cè)序正確后連接到T-EASY載體，得到小麥VP基因克隆。

1.2.2 數(shù)據(jù)分析 使用ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/) 分析小麥VP蛋白理化性質(zhì)；通過(guò)ProtScale 軟件，采用默認(rèn)算法，對(duì)小麥VP蛋白進(jìn)行親水性/疏水性分析；通過(guò)SignalP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預(yù)測(cè)肽鏈N 端的切割位點(diǎn)，來(lái)預(yù)測(cè)小麥VP蛋白的信號(hào)肽；利用TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/) 對(duì)小麥VP蛋白進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)域分析；通過(guò)https://www.genscript.com/wolf-psort.html 在線預(yù)測(cè)小麥VP蛋白的亞細(xì)胞定位；采用SMOPA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl) 對(duì)小麥VP蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)；采用SWISS-MODEL(https://www.swissmodel.expasy.org/interactive) 對(duì)小麥VP蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.2.3 小麥VP基因表達(dá)載體的構(gòu)建 PCR擴(kuò)增pCAMBIA1380的35S啟動(dòng)子，所用的引物為5′-CCGAATTCCCCAACATGGTGGAGC-3′和5′-CGGGATCCGCGAAAGCTCGAGAGAG-3′，擴(kuò)增出的35S啟動(dòng)子長(zhǎng)度為0.8 kb。將該片段用EcoRⅠ和BamHⅠ酶切后插入到pCAMBIA1380載體的EcoR Ⅰ 和BamHⅠ酶切位點(diǎn)之間得到重組載體pCAMBIA1380-35S。將克隆載體T-VP用BamHⅠ和HindⅢ雙酶切后，回收VP片段，將其以正向方式插入載體pCAMBIA1380-35S的BamHⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn)之間，得到重組載體pCAMBIA1380-35S-VP。用HindⅢ和BglⅡ切割已經(jīng)構(gòu)建的GFP-T載體，將切下的GFP片段連接到pCAMBIA1380-35S-VP上，最終構(gòu)建成pCAMBIA1380-35S-VP-GFP載體。

1.2.4 轉(zhuǎn)VP基因擬南芥植株VP基因表達(dá)分析 將Columbia生態(tài)型擬南芥種子春化3 d后消毒鋪種，之后放入光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2～4片真葉時(shí)移栽，待其主薹抽薹至10～15 cm時(shí)可作為農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的受體材料。將pCAMBIA1380-35S-VP-GFP轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌株GV3101，然后采用浸花法轉(zhuǎn)化擬南芥。待成熟后收獲種子，對(duì)后代進(jìn)行純合體篩選。挑選6個(gè)純合體轉(zhuǎn)基因株系和野生型擬南芥，正常培養(yǎng)。按照Trizol試劑盒(北京賽百盛基因技術(shù)有限公司)說(shuō)明書(shū)提取葉片總RNA，取2 μg總RNA，按照Promega公司反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV操作說(shuō)明書(shū)合成cDNA。以獲得的野生型擬南芥和轉(zhuǎn)VP基因擬南芥純合體植株的cDNA為模板，進(jìn)行半定量PCR擴(kuò)增。

以已報(bào)道的擬南芥ACTIN基因?yàn)閮?nèi)參，設(shè)計(jì)其PCR擴(kuò)增引物，正向引物為ACTIN-S：5′-AGGCACCTCTTAACCCTAAAGC-3′，反向引物為ACTIN-A：5′-GGACAACGGAATCTCTCAGC-3′。PCR反應(yīng)體系如下：10×反應(yīng)緩沖液 2.5 μL，10 mmol/LdNTPs 0.5 μL，2.5 U/μLTaq酶0.3 μL，模板1.0 μL，正、反向引物(10 μmol/L)各 0.5 μL，加去離子無(wú)菌水至總體積25 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果調(diào)節(jié)cDNA模板濃度，使野生型擬南芥和轉(zhuǎn)基因擬南芥擴(kuò)增片段亮度一致。設(shè)計(jì)小麥VP基因擴(kuò)增引物，正向引物為BDL-S：5′-GAGCCACAGAATCCGTGAGA-3′，反向引物為BDL-A：5′-CACCAGCCAGAACACCAGA-3′。PCR反應(yīng)體系如下：10×反應(yīng)緩沖液 2.5 μL，10 mmol/L dNTPs 0.5 μL，2.5 U/μLTaq酶 0.3 μL，模板 1.0 μL，正、反向引物(10 μmol/L)各0.5 μL，加去離子無(wú)菌水至總體積25 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，28個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。

1.2.5 轉(zhuǎn)VP基因擬南芥鹽脅迫處理試驗(yàn) 將野生型和經(jīng)過(guò)表達(dá)鑒定的6個(gè)轉(zhuǎn)VP基因擬南芥純合體株系(9、14、15、16、20、24)的種子，消毒后播種于含有不同濃度NaCl(125、150、175 mmol/L)的MS培養(yǎng)基上，每皿不少于50粒，3個(gè)重復(fù)。4 d后統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率，6 d后統(tǒng)計(jì)綠苗率。

同時(shí)，將在不含NaCl的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)10 d的野生型和經(jīng)過(guò)表達(dá)鑒定的6個(gè)轉(zhuǎn)VP基因擬南芥純合體株系(9、14、15、16、20、24)的幼苗移植到裝有定量營(yíng)養(yǎng)土的營(yíng)養(yǎng)缽中，每個(gè)株系3缽，每缽移植4株，在室溫下緩苗7 d，用300 mmol/L NaCl 溶液澆灌，溫室中繼續(xù)培養(yǎng)5 d，觀察轉(zhuǎn)VP基因擬南芥植株的表型變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥VP基因的克隆

采用3′-RACE法擴(kuò)增小麥cDNA,得到約1 800 bp的片段(圖1 A)，將該產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，按照測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)引物，然后采用5′-RACE法進(jìn)行擴(kuò)增，得到1 053 bp的片段(圖1 B)。根據(jù)2次擴(kuò)增測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)引物進(jìn)行小麥VP基因全長(zhǎng)序列擴(kuò)增，得到的產(chǎn)物為2 286 bp(圖1 C)。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物連接到T-EASY載體，進(jìn)行菌液PCR鑒定(圖1 D)和酶切鑒定(圖1 E )，結(jié)果表明成功克隆小麥VP基因。

將VP基因編碼的氨基酸序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性搜索，結(jié)果表明，小麥VP基因編碼蛋白質(zhì)與大麥中2個(gè)VP蛋白的氨基酸序列同源性分別達(dá)86%(AB032839.1)和98%(D13472.2)；與水稻中4個(gè)VP蛋白的氨基酸序列同源性分別達(dá)85%(D45384.1)、92%(D45384.1)、89%(AB126350.1)和87%(AB126351.1)；與小麥已知VP基因編碼蛋白質(zhì)(EU255237.1)的氨基酸序列同源性達(dá)85%。因此，推斷本研究克隆的小麥VP基因是1個(gè)新的未曾報(bào)道過(guò)的VP基因。對(duì)小麥VP基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，自氨基端第248位至258位為VP的保守區(qū)，推測(cè)該蛋白質(zhì)可能具有水解焦磷酸的活性。

2.2 小麥VP蛋白的生物信息學(xué)分析

2.2.1 小麥VP蛋白理化性質(zhì)分析 使用ProtParam分析發(fā)現(xiàn)，小麥VP蛋白共有761個(gè)氨基酸殘基，分子式為C3 618H5 673N885O1 041S36，分子質(zhì)量為79 379.31 u，理論等電點(diǎn)為5.17，在761 個(gè)氨基酸殘基中Asp 和Glu 總數(shù)為58個(gè)，Arg 和Lys 總數(shù)為47個(gè)，原子總數(shù)為11 253個(gè)，不穩(wěn)定系數(shù)為24.41，屬于穩(wěn)定蛋白。

A:3′-RACE擴(kuò)增產(chǎn)物; B:5′-RACE擴(kuò)增產(chǎn)物; C：VP基因全長(zhǎng)序列擴(kuò)增產(chǎn)物; D：菌液PCR鑒定; E：酶切鑒定。M:Marker; S:小麥樣品; S1:VP基因陽(yáng)性克隆質(zhì)粒； P:空載體質(zhì)粒; 1—4:4個(gè)不同的克隆

2.2.2 小麥VP蛋白的親水性/疏水性預(yù)測(cè) 根據(jù)氨基酸分值越低親水性越強(qiáng)、分值越高疏水性越強(qiáng)的規(guī)律，通過(guò)ProtScale 軟件，采用默認(rèn)算法，對(duì)小麥VP蛋白進(jìn)行親水性/疏水性分析。如圖2所示，分值介于-0.5～0.5的主要為兩性氨基酸，在整條多肽鏈中，大多數(shù)氨基酸分值在0～3，分布均勻。對(duì)761個(gè)氨基酸進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，VP蛋白平均親水性值為0.621，為疏水性蛋白。

圖2 小麥VP蛋白親水性/疏水性分析Fig.2 Analysis of hydrophilicity/hydrophobicity of wheat VP protein

2.2.3 小麥VP 蛋白信號(hào)肽、跨膜結(jié)構(gòu)及亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè) 本研究通過(guò)SignalP預(yù)測(cè)肽鏈N 端的切割位點(diǎn)來(lái)預(yù)測(cè)信號(hào)肽，因此，該程序只分析整個(gè)蛋白質(zhì)序列的前70 個(gè)氨基酸。由圖3可知，最大C、Y、S 值分別為0.127、0.160、0.305，由此得知小麥VP蛋白無(wú)信號(hào)肽。

圖3 小麥VP 蛋白信號(hào)肽分析Fig.3 Signal peptide analysis of wheat VP protein

利用TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/) 對(duì)VP蛋白跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析(圖4)發(fā)現(xiàn)， VP蛋白具有14個(gè)跨膜區(qū)域，為跨膜蛋白。

圖4 小麥VP蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.4 Transmembrane structure prediction of wheat VP protein

通過(guò)https://www.genscript.com/wolf-psort.html在線預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，小麥VP 蛋白在分泌通路中存在的概率為0.48，在質(zhì)膜上存在的概率為0.36，而在其他位置的概率為0.16。因此，推測(cè)該蛋白質(zhì)為分泌蛋白。

2.2.4 小麥VP蛋白二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 采用SMOPA對(duì)VP蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)(圖5)發(fā)現(xiàn)，α 螺旋占43.10%，無(wú)規(guī)則卷曲占23.39%，β折疊占23.39%，β轉(zhuǎn)角占10.12%。

采用SWISS-MODEL預(yù)測(cè)VP蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)(圖6)發(fā)現(xiàn)，VP蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α 螺旋、無(wú)規(guī)則卷曲和延伸鏈等組成，α 螺旋在小麥VP 蛋白結(jié)構(gòu)中占主要地位。

2.3 小麥VP基因表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因擬南芥中VP基因的表達(dá)分析

小麥VP基因表達(dá)載體pCAMBIA1380-35S-VP-GFP結(jié)構(gòu)如圖7所示。該載體含有潮霉素抗性基因，小麥VP基因由35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。

由圖8可知，小麥VP基因在6個(gè)轉(zhuǎn)基因擬南芥純合體植株中均表達(dá)，且在不同株系中表達(dá)量略有不同。

2.4 轉(zhuǎn)VP基因擬南芥耐鹽性鑒定

2.4.1 萌發(fā)率和綠苗率分析 由圖9—10可知，隨著NaCl濃度增加，各轉(zhuǎn)VP基因株系的萌發(fā)率均呈下降趨勢(shì)。在低濃度NaCl脅迫下，轉(zhuǎn)VP基因擬南芥的萌發(fā)率與野生型植株相比并無(wú)明顯差別，野生型擬南芥的萌發(fā)率為84%，而轉(zhuǎn)VP基因擬南芥的萌發(fā)率介于84%～92%。隨著NaCl脅迫濃度增加，轉(zhuǎn)VP基因擬南芥與野生型擬南芥萌發(fā)率的差距增大，NaCl濃度增加到150 mmol/L時(shí)，野生型擬南芥的萌發(fā)率為68%，所有轉(zhuǎn)VP基因株系的萌發(fā)率均高于野生型植株，尤其是轉(zhuǎn)VP基因擬南芥株系9、15、20，其萌發(fā)率均超過(guò)80%;NaCl濃度增加到175 mmol/L時(shí)，野生型擬南芥的萌發(fā)率僅為42%，所有轉(zhuǎn)VP基因株系的萌發(fā)率均高于野生型植株，其中轉(zhuǎn)VP基因擬南芥株系9、14、15、20差異極顯著，尤其是株系9、20，其萌發(fā)率均超過(guò)60%。

h:α螺旋; e:β折疊; t:β轉(zhuǎn)角; c:無(wú)規(guī)卷曲

圖6 小麥VP 蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.6 Tertiary structure prediction of wheat VP protein

RB和LB分別代表T-DNA區(qū)的右邊界和左邊界，HYG是潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因， CaMV 35S為花椰菜花葉病毒啟動(dòng)子， Nos為根癌農(nóng)桿菌終止子

RB and LB represent the right and left bounds of the T-DNA region, respectively.HYGis the gene encoding hygromycin phosphotransferase.CaMV 35S is the promoter of cauliflower mosaic virus. Nos is the terminator ofAgrobacteriumtumefaciens

圖7pCAMBIA1380-35S-VP-GFP表達(dá)載體的構(gòu)建
Fig.7TheconstructionofpCAMBIA1380-35S-VP-GFPexpressionvector

M為DNA Marker DL2000； 1—6分別為轉(zhuǎn)基因株系9、14、15、16、20、24的擴(kuò)增結(jié)果

A：150 mmol/L NaCl； B：175 mmol/L NaCl。

*、**表示轉(zhuǎn)基因植株與野生型植株差異顯著(P<0.05)、極顯著(P<0.01),下同

由統(tǒng)計(jì)結(jié)果可以看出，隨著NaCl濃度的增加，各株系的綠苗率呈下降趨勢(shì)(圖11)。其中，轉(zhuǎn)VP基因株系20在3個(gè)不同濃度的NaCl脅迫下，綠苗率均極顯著高于野生型植株；轉(zhuǎn)VP基因株系14、15、16在125、150 mmol/L NaCl脅迫下，綠苗率均極顯著高于野生型植株；株系9在150、175 mmol/L NaCl脅迫下，綠苗率均極顯著高于野生型植株；株系24在不同濃度的NaCl脅迫下，綠苗率均顯著高于野生型植株。說(shuō)明VP基因的轉(zhuǎn)入提高了擬南芥在NaCl脅迫下的綠苗率。

2.4.2 盆栽表型鑒定 由圖12可以看出，野生型擬南芥在NaCl脅迫下生長(zhǎng)緩慢甚至停止生長(zhǎng)，部分植株死亡，而轉(zhuǎn)VP基因擬南芥對(duì)NaCl具有不同程度的抗性，其中14、15、20三個(gè)株系對(duì)NaCl具有較好的抗性。

圖11 不同濃度NaCl脅迫下轉(zhuǎn)VP基因和野生型擬南芥的綠苗率分析Fig.11 Green seedling rate of transgenic Arabidopsis thaliana overexpressing VP and wild Arabidopsis thaliana under different concentrations of NaCl

WT為野生型擬南芥，9、14、15、16、20、24為6個(gè)轉(zhuǎn)基因株系

3 結(jié)論與討論

大量試驗(yàn)證明，VP基因在提高植物耐鹽能力方面具有明顯的作用[12-23]。2001年，GAXIOLA等[24]研究表明，擬南芥液泡膜H+轉(zhuǎn)運(yùn)無(wú)機(jī)焦磷酸酶基因AVP1具有抗逆作用，過(guò)表達(dá)AVP1基因擬南芥的耐鹽性明顯增強(qiáng)。PARK等[25]將擬南芥的AVP1基因轉(zhuǎn)入番茄中，轉(zhuǎn)基因番茄耐鹽性增強(qiáng)。之后，研究人員從不同植物中克隆得到VP基因，轉(zhuǎn)化不同植物后發(fā)現(xiàn)受體植物的耐鹽性均得到了提高[26-33]。本研究結(jié)果表明，125、150 mmol/L NaCl脅迫下，轉(zhuǎn)VP基因擬南芥株系的萌發(fā)率與野生型擬南芥無(wú)顯著差異，隨著NaCl濃度增加(175 mmol/L NaCl)，部分轉(zhuǎn)VP基因擬南芥株系的萌發(fā)率極顯著高于野生型擬南芥?？傮w上，在不同濃度NaCl脅迫下，6個(gè)轉(zhuǎn)VP基因擬南芥株系的綠苗率均極顯著高于野生型擬南芥。盆栽表型鑒定試驗(yàn)表明，野生型擬南芥在NaCl脅迫下生長(zhǎng)緩慢甚至停止生長(zhǎng)，部分植株死亡，而轉(zhuǎn)VP基因擬南芥對(duì)NaCl呈現(xiàn)出不同程度的抗性。由此可見(jiàn)，小麥VP基因提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐鹽性。VP基因的研究可以加速優(yōu)質(zhì)抗逆作物育種的進(jìn)程，對(duì)于深入了解植物抗逆機(jī)制具有重要的意義。