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(河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院，河南 鄭州 450046)

沙門菌(Salmonella)是人畜共患病原菌，獸醫(yī)臨床常選用喹諾酮類藥物作為治療沙門菌感染的常規(guī)用藥之一。恩諾沙星是化學(xué)合成的第3代喹諾酮類動(dòng)物專用抗菌藥，在獸醫(yī)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。但由于臨床的不合理使用，沙門菌對(duì)恩諾沙星的耐藥現(xiàn)象在國(guó)內(nèi)外頻頻被報(bào)道，且耐藥率和耐藥程度呈逐漸上升趨勢(shì)[1-3]。

喹諾酮類藥物主要是通過(guò)選擇性抑制細(xì)菌的DNA螺旋酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ來(lái)發(fā)揮抗菌作用，其中DNA螺旋酶是喹諾酮類藥物作用的首要靶位，包括A亞單位和B亞單位，分別由gyrA基因和gyrB基因編碼。研究發(fā)現(xiàn)，這些基因的突變可導(dǎo)致細(xì)菌DNA螺旋酶結(jié)構(gòu)改變，從而使喹諾酮類藥物失去原來(lái)的作用靶點(diǎn)。有報(bào)道稱，gyrA基因的第67—106位氨基酸突變決定著沙門菌的耐藥性[4-6]，但突變位點(diǎn)在不同研究結(jié)果中不盡相同[7-8]，因此，進(jìn)一步探索和證實(shí)沙門菌gyrA和gyrB基因中影響喹諾酮類藥物耐藥性的具體突變位點(diǎn)，對(duì)于研究沙門菌對(duì)喹諾酮類藥物的耐藥機(jī)制是十分必要的。本研究從2016—2017年獸醫(yī)臨床分離的18株沙門菌中檢測(cè)耐恩諾沙星的菌株，一方面調(diào)查目前獸醫(yī)臨床沙門菌對(duì)恩諾沙星的耐藥程度，另一方面分析耐藥菌gyrA和gryB基因的分子特征，以進(jìn)一步闡明沙門菌對(duì)喹諾酮類藥物的耐藥機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 菌種復(fù)蘇

18株沙門菌于2016—2017年分離自河南省不同地區(qū)畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)，其中10株為雞源沙門菌，8株為豬源沙門菌。取保存菌種，按1∶100比例無(wú)菌接種于LB肉湯中，37 ℃振蕩培養(yǎng)12～18 h，用接種環(huán)無(wú)菌挑取菌液劃線接種于LB瓊脂平板上，37 ℃溫箱倒置培養(yǎng)12～18 h，后挑選單個(gè)菌落接種于LB肉湯，37 ℃振蕩培養(yǎng)12 h后，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑和藥品

LB肉湯、MH肉湯、SS瓊脂培養(yǎng)基均購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；DNA聚合酶(2×TaqPCR MasterMix)、EB核酸染料、DL2000 DNA Marker均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；瓊脂糖和TAE緩沖液均購(gòu)自天根生物科技有限公司；恩諾沙星為河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存的科研專用原料藥，均在使用有效期內(nèi)。

1.3 恩諾沙星對(duì)耐藥菌株最小抑菌濃度(MIC)的測(cè)定

采用美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所(CLSI)推薦的微量肉湯稀釋法[9]測(cè)定恩諾沙星對(duì)18株獸醫(yī)臨床分離沙門菌的MIC，選擇大腸桿菌ATCC?25922作為質(zhì)控菌。

1.4 恩諾沙星耐藥菌株gyrA和gyrB基因的擴(kuò)增

1.4.1 菌株基因組DNA提取及PCR引物序列 選擇對(duì)恩諾沙星耐藥的菌株，采用煮沸法提取耐藥菌株的基因組DNA。PCR引物序列及擴(kuò)增片段長(zhǎng)度見(jiàn)表1，引物序列由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 恩諾沙星耐藥菌株gyrA和gyrB基因擴(kuò)增引物

1.4.2 恩諾沙星耐藥菌株gyrA和gyrB基因的PCR擴(kuò)增 以基因組DNA為模板，用上述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。采用25.0 μL的PCR反應(yīng)體系：基因組DNA 2.0 μL，上、下游引物各0.5 μL，DNA聚合酶12.5 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性1 min，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共循環(huán)30次；最后72 ℃延伸20 min，于16 ℃保存20 min。將擴(kuò)增產(chǎn)物置于1.0%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，在紫外凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果。

1.4.3 PCR產(chǎn)物測(cè)序及序列分析 將擴(kuò)增所得gyrA和gyrB基因的PCR產(chǎn)物送至深圳華大基因股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，利用DNAMAN軟件將測(cè)序結(jié)果與NCBI上公布的沙門菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(LT2株)的gyrA和gyrB基因序列進(jìn)行比對(duì)，分析耐藥菌株gyrA和gyrB基因突變情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 恩諾沙星對(duì)耐藥菌株MIC測(cè)定結(jié)果

根據(jù)CLSI推薦的標(biāo)準(zhǔn)，把MIC≤0.500 μg/mL和MIC≥4.000 μg/mL分別作為判斷菌株對(duì)喹諾酮類藥物敏感和耐藥的依據(jù)。MIC的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2，18株獸醫(yī)臨床分離的沙門菌中有11株為敏感菌株，MIC≤0.500 μg/mL；耐藥菌為4株(菌株編號(hào)分別為2891、1815、9660、SH40)，MIC≥4.000 μg/mL，耐藥率為22.2%；另有3株處于中介狀態(tài)，MIC在0.500～4.000 μg/mL。由此可見(jiàn)，沙門菌已產(chǎn)生了普遍且較強(qiáng)的恩諾沙星抗性，高度耐藥菌2891株的恩諾沙星MIC達(dá)到敏感菌株的128倍以上。

表2 恩諾沙星對(duì)18株沙門菌株的MIC值

注：MIC≤0.500 μg/mL為敏感(S)；0.500≤MIC≤4.000 μg/mL為中介(I)；MIC≥4.000 μg/mL為耐藥(R)。

Note：MIC≤0.500 μg/mL is sensitive(S);0.500≤MIC≤4.000 μg/mL is intermediary(I);MIC≥4.000 μg/mL is resistant(R).

2.2 恩諾沙星耐藥菌株gyrA和gyrB基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

對(duì)4株恩諾沙星耐藥菌株(2891、1815、9660、SH40)進(jìn)行g(shù)yrA和gyrB基因擴(kuò)增，均得到625 bp和498 bp的目的條帶，與預(yù)期大小一致，如圖1所示。

2.3 恩諾沙星耐藥菌株gyrA和gyrB基因的序列分析結(jié)果

將4株恩諾沙星耐藥菌株(2891、1815、9660、SH40)的gyrA和gyrB基因編碼的氨基酸序列與標(biāo)準(zhǔn)野生型菌株(LT2)進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)，gyrB基因沒(méi)有發(fā)生突變，而gyrA基因存在位點(diǎn)突變。如表3所示，在gyrA基因的喹諾酮耐藥區(qū)(QRDR)內(nèi)(第67—106個(gè)氨基酸)存在2個(gè)位點(diǎn)突變，分別是Ser83→Phe或Leu，突變率達(dá)100%；Asp87→Asn，突變率75%。在非QDRD存在1個(gè)突變位點(diǎn)，Asn200→Asp，突變率為25%。分析不同菌株的突變情況，發(fā)現(xiàn)恩諾沙星MIC≥16.000 μg/mL的3株菌均是在83、87位出現(xiàn)雙突變(Ser83→Phe、Asp87→Asn)，而恩諾沙星MIC為4.000 μg/mL的1株菌則是在83、200位出現(xiàn)雙突變(Ser83→Leu、Asn200→Asp)。

M：DL2000 DNA Marker； 1：陽(yáng)性對(duì)照； 2—5：耐藥菌株2891、1815、9660、SH40； 6：陰性對(duì)照

菌株StrainsgyrA基因突變位點(diǎn)gyrA gene mutation sitegyrB基因突變位點(diǎn)gyrB gene mutation siteMIC/(μg/mL)LT2NoneNone0.0042891Ser83→Phe、Asp87→AsnNone64.0001815Ser83→Phe、Asp87→AsnNone16.0009660Ser83→Phe、Asp87→AsnNone16.000SH40Ser83→Leu、Asn200→AspNone4.000

注：None表示未檢測(cè)出突變位點(diǎn)。

Note：None indicates that no mutation site was detected.

3 結(jié)論與討論

隨著細(xì)菌對(duì)喹諾酮類藥物耐藥現(xiàn)象被頻頻報(bào)道，臨床耐藥菌株的檢測(cè)和耐藥機(jī)制的研究也不斷深入[10-12]。本研究從18株獸醫(yī)臨床分離的沙門菌中共檢測(cè)出4株恩諾沙星耐藥菌株，其中耐藥程度最強(qiáng)菌株的恩諾沙星MIC達(dá)到64.000 μg/mL，可見(jiàn)目前已出現(xiàn)對(duì)恩諾沙星高度耐藥的沙門菌，這對(duì)臨床防治沙門菌感染帶來(lái)了巨大的挑戰(zhàn)，同時(shí)也提醒獸醫(yī)工作者們要注重臨床合理用藥。

關(guān)于喹諾酮類藥物的耐藥機(jī)制，眾多研究證實(shí)，藥物作用靶位基因分子特征的改變與耐藥性的產(chǎn)生密切相關(guān)[13]。QRDR的基因突變被認(rèn)為是最主要的耐藥機(jī)制[14]，gyrA基因的點(diǎn)突變主要集中于第67—106位氨基酸[15]，然而不同種屬的細(xì)菌突變位點(diǎn)和突變情況存在差異。有研究顯示，結(jié)核分枝桿菌gyrA基因的90、91、94位點(diǎn)突變與其對(duì)喹諾酮類藥物耐藥的產(chǎn)生密切相關(guān)[16]。大腸桿菌中，有研究表明，gyrA基因的QRDR有義突變常發(fā)生在81、82、83、84、87、106位氨基酸的編碼基因，單位點(diǎn)突變以83位的Ser→Leu最常見(jiàn)，雙位點(diǎn)突變有83、87位氨基酸突變[17-18]。在銅綠假單胞菌的研究中顯示，對(duì)環(huán)丙沙星和左氧氟沙星耐藥主要是由于gyrA與gyrB基因的突變以及外排泵mexAB-OprM與mexCD-OprJ表達(dá)增加共同作用的結(jié)果[19]。本研究通過(guò)分析耐恩諾沙星沙門菌的gyrA和gyrB基因的分子特征發(fā)現(xiàn)，gyrB基因未發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)，與李珂婷[20]用5種喹諾酮類藥物誘導(dǎo)培養(yǎng)沙門菌后其gyrB、parC及parE基因均未發(fā)生突變相似，但gyrA基因在83、87、200位氨基酸出現(xiàn)了位點(diǎn)突變，其中突變頻率最高的是83位氨基酸(Ser83→Phe或Leu)，以Ser→Phe最多。4株恩諾沙星耐藥沙門菌中，耐藥程度較強(qiáng)的菌株均是在氨基酸的83位(Ser83→Phe)和87位(Asp→Asn)出現(xiàn)雙突變，而耐藥程度相對(duì)較弱的菌株是在83位(Ser83→Leu)和200位(Asn→Asp)出現(xiàn)雙突變，因此提示gyrA基因QRDR區(qū)(第67—106位氨基酸)的雙突變可使沙門菌對(duì)恩諾沙星的耐藥性增強(qiáng)，推測(cè)原因可能是Asp87的突變可能增強(qiáng)了Ser83位點(diǎn)突變所介導(dǎo)的耐藥性，而非QRDR的Asn200不能發(fā)揮增強(qiáng)耐藥性的作用，但此推斷仍需進(jìn)一步研究來(lái)證實(shí)。