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(廣東海洋大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，廣東 湛江 524088)

當(dāng)前畜牧養(yǎng)殖向機械化、規(guī)?；l(fā)展，“全進(jìn)全出”逐漸成為養(yǎng)殖行業(yè)的生產(chǎn)模式，雖然有利于畜禽的集中管理，但環(huán)境應(yīng)激容易引起畜禽抵抗力下降，導(dǎo)致發(fā)病率增高。由于禽病治療多用抗生素[1]，造成了細(xì)菌的耐藥性增加、畜禽產(chǎn)品抗生素的殘留等負(fù)面影響，進(jìn)而制約了畜禽養(yǎng)殖業(yè)的健康安全發(fā)展，因此，抗生素替代品的開發(fā)和高效利用十分必要。

微生態(tài)制劑是由有益微生物或微生物的代謝產(chǎn)物加工而成。一些芽孢桿菌類微生物具有優(yōu)良的耐高溫性能，同時無毒副作用，能夠調(diào)節(jié)動物腸道微生態(tài)平衡，促進(jìn)動物生長發(fā)育。研究表明，適宜劑量的枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)有利于動物生長發(fā)育、增強機體免疫功能，同時可激活體內(nèi)多種酶，抑制菌群繁殖，從而達(dá)到改善腸道內(nèi)環(huán)境的作用，但枯草芽孢桿菌添加劑量不同、應(yīng)用環(huán)境條件不同等因素的差異也會造成改善效果的不同[2-4]。為此，在前期研究的基礎(chǔ)上，探討不同添加劑量的枯草芽孢桿菌對高溫環(huán)境下1～42日齡愛拔益加(AA)雞的生長發(fā)育、免疫器官發(fā)育和免疫功能的影響，為枯草芽孢桿菌在肉雞養(yǎng)殖中的合理應(yīng)用提供參考。

1 材料和方法

1.1 供試菌劑

枯草芽孢桿菌制劑購于廣東雅琪生物科技有限公司(活菌總含量≥2×1010cfu/g)。

1.2 試驗設(shè)計及日糧組成

本試驗采用單因子隨機分組試驗，選用1日齡健康、體質(zhì)量鄰近且同批孵化的AA雞300只，隨機分為5組，每組5個重復(fù)，每個重復(fù)12只雞。飼養(yǎng)地點為廣東湛江，飼養(yǎng)期為6—7月，環(huán)境溫度為26～34 ℃。對照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗組飼喂分別添加了0.010%、0.015%、0.020%和0.025%枯草芽孢桿菌制劑的基礎(chǔ)飼糧?；A(chǔ)飼糧為玉米-豆粕型，根據(jù)AA雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行配制，其組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧的組成及營養(yǎng)水平Tab.1 Composition and nutrient levels of the basal diet

續(xù)表1 基礎(chǔ)飼糧的組成及營養(yǎng)水平Tab.1(Continued) Composition and nutrient levels of the basal diet

注：每千克飼糧中預(yù)混料含維生素A 9 600.00 IU，維生素D33 600.00 IU，維生素E 15.00 IU，維生素K 0.40 mg，維生素B13.50 mg，維生素B29.00 mg，維生素B65.00 mg，維生素B120.03 mg，煙酸40.00 mg，D-泛酸8.00 mg，葉酸0.50 mg，生物素0.20 mg，鐵85.00 mg，銅10.00 mg，鋅105.00 mg，錳115.00 mg，碘0.50 mg，硒0.25 mg。

Note：1 kg of premix contained VA 9 600.00 IU,VD33 600.00 IU,VE 15.00 IU,VK 0.40 mg,VB13.50 mg,VB29.00 mg,VB65.00 mg,VB120.03 mg,niacin 40.00 mg,D-pantothenic acid 8.00 mg,folic acid 0.50 mg,biotin 0.20 mg,Fe 85.00 mg,Cu 10.00 mg,Zn 105.00 mg,Mn 115.00 mg,I 0.50 mg,Se 0.25 mg.

1.3 飼養(yǎng)管理

飼養(yǎng)期間控制好溫度和濕度，雛雞階段進(jìn)行24 h光照。脫溫后AA雞在自然環(huán)境狀態(tài)下養(yǎng)殖，環(huán)境溫度為26～34 ℃。保證雞只自由采食、飲水，雞糞每天清理1次，每天換水并保持雞只飲水清潔，注意觀察雞群精神情況和采食狀況，如有死亡雞只，隨時記錄。此外，按照AA雞常規(guī)免疫程序進(jìn)行免疫。

1.4 測定項目及方法

1.4.1 AA雞生長性能測定 以每個重復(fù)為單位記錄AA雞初始體質(zhì)量，在AA雞21日齡和42日齡時分別于8:00對空腹雞只進(jìn)行體質(zhì)量測量，在整個試驗過程中詳細(xì)記錄各階段耗料量，計算AA雞各生長階段的平均日增體質(zhì)量(Average daily gain,ADG)、平均日采食量(Average daily feed intake,ADFI)和料重比(Feed weight ratio,F/G)。計算公式分別為ADG=(末體質(zhì)量-初體質(zhì)量)/(天數(shù)×雞只數(shù))；ADFI=耗料量/(天數(shù)×雞只數(shù))；F/G=平均日采食量/平均日增體質(zhì)量。

1.4.2 AA雞免疫器官指數(shù)測定 分別在AA雞21日齡和42日齡時進(jìn)行屠宰試驗，采用頸靜脈處死法，剝離AA雞的胸腺、脾臟和法氏囊，稱質(zhì)量計算器官指數(shù)。計算公式分別為胸腺指數(shù)=胸腺質(zhì)量/體質(zhì)量；脾臟指數(shù)=脾臟質(zhì)量/體質(zhì)量；法氏囊指數(shù)=法氏囊質(zhì)量/體質(zhì)量。

1.4.3 AA雞免疫指標(biāo)測定 分別在AA雞21日齡和42日齡時進(jìn)行翅下采血，將采集血液放入采血管中3 000 r/min離心10 min，取1.5 mL血清于離心管中冷凍保存，以備進(jìn)行新城疫抗體效價(NDV-Ab)、溶菌酶活性(Lysozyme activity，LZM)、免疫球蛋白(IgG)含量檢測。其中NDV-Ab采用血球凝聚法測定，LZM采用比濁法測定，IgG采用ELASA試劑盒測定。試驗所用試劑盒均購于南京建成生物工程研究所。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2010處理，用SPSS 22.0中ANOVA進(jìn)行分析，Duncan’s法進(jìn)行多重比較，結(jié)果以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 枯草芽孢桿菌對AA雞生長性能的影響

由表2可以看出，飼糧中添加枯草芽孢桿菌可以一定程度上提高AA雞生長各階段以及全期ADG。AA雞生長各階段及全期ADG隨著枯草芽孢桿菌添加劑量的增加而增加，以0.020%枯草芽孢桿菌添加組ADG最高，兩者顯著高于對照組，但各添加組之間ADG差異不顯著。1—42日齡添加枯草芽孢桿菌制劑的試驗組AA雞的ADG分別較對照組提高1.92%(P>0.05)、7.95%(P>0.05)、9.67%(P<0.05)、8.49%(P>0.05)。F/G在AA雞不同生長階段及全期都有一定程度降低，1—42日齡AA雞各試驗組F/G分別降低2.63%(P>0.05)、5.26%(P>0.05)、5.79%(P<0.05)和4.74%(P>0.05)。

表2 枯草芽孢桿菌對AA雞生長性能的影響

注：表中同行數(shù)據(jù)肩上標(biāo)注的不同字母表示差異性顯著(P<0.05)，下同。

Note：Different letters marked on the shoulder of data in the same peer in the table indicate significant difference(P<0.05),the same below.

2.2 枯草芽孢桿菌對AA雞免疫器官指數(shù)的影響

由表3可以看出，0.020%枯草芽孢桿菌添加組21日齡AA雞的胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)分別比對照組高61.25%(P<0.05)、59.26%(P<0.05)，0.025%枯草芽孢桿菌添加組21日齡AA雞的胸腺指數(shù)分別比對照組和0.010%枯草芽孢桿菌添加組高52.50%(P<0.05)和36.31%(P<0.05)。與對照組相比，各試驗組42日齡AA雞的胸腺指數(shù)比對照組分別增加17.53%(P>0.05)、13.96%(P>0.05)、19.81%(P>0.05)、22.73%(P<0.05)，各試驗組之間差異不顯著；0.025%枯草芽孢桿菌添加組42日齡AA雞的脾臟指數(shù)分別高于對照組和其他試驗組43.43%(P<0.05)、39.21%(P>0.05)、36.54%(P>0.05)、23.48(P>0.05)。整個試驗期間AA雞的法氏囊指數(shù)有增加的趨勢，但變化不顯著。

表3 枯草芽孢桿菌對AA雞免疫器官指數(shù)的影響Tab.3 Effect of Bacillus subtilis on immune organ index of AA chickens

2.3 枯草芽孢桿菌對AA雞免疫功能的影響

由表4可以看出，各試驗組無論是21日齡還是42日齡AA雞的NDV-Ab、IgG含量和LZM都有不同程度提高，并且呈現(xiàn)劑量效應(yīng)關(guān)系。其中,0.025%枯草芽孢桿菌添加組AA雞的NDV-Ab顯著高于對照組，0.015%、0.020%和0.025%枯草芽孢桿菌添加組AA雞IgG含量顯著高于對照組，但組間差異不顯著；AA雞的LZM在2個生長階段表現(xiàn)出一定差異，0.020%、0.025%枯草芽孢桿菌添加組21日齡AA雞的LZM顯著高于對照組，0.020%枯草芽孢桿菌添加組42日齡AA雞的LZM顯著高于對照組。各試驗組42日齡AA雞的NDV-Ab分別比對照組高5.22%(P>0.05)、15.13%(P>0.05)、13.57%(P>0.05)和21.74%(P<0.05)；各試驗組42日齡AA雞的IgG含量比對照組高19.41%(P>0.05)、33.53%(P<0.05)、22.94%(P<0.05)和32.94%(P<0.05)，除此之外，0.020%、0.025%枯草芽孢桿菌添加組42日齡AA雞的IgG含量比0.010%枯草芽孢桿菌添加組分別升高2.95%(P<0.05)、11.33%(P<0.05)；各試驗組42日齡AA雞的LZM均大于對照組，其中0.020%枯草芽孢桿菌添加組提高最多，為10.36%(P<0.05)。

表4 枯草芽孢桿菌對AA雞部分免疫指標(biāo)的影響Tab.4 Effect of Bacillus subtilis on partial immune indexe of AA chickens

3 結(jié)論與討論

飼糧添加枯草芽孢桿菌可在一定程度上提高動物的生長發(fā)育和免疫器官指數(shù)，同時提高血清NDV-Ab、IgG含量和LZM。因此，以生長性能、免疫器官和免疫指標(biāo)為綜合指標(biāo)進(jìn)行評價后，得出枯草芽孢桿菌的適宜添加劑量為0.020%。

3.1 高溫環(huán)境下飼糧添加枯草芽孢桿菌對AA雞生長性能的影響

芽孢桿菌在動物生產(chǎn)中常用來調(diào)節(jié)腸道菌群內(nèi)環(huán)境平衡、提高飼料利用效率、增強機體免疫功能、產(chǎn)生生物活性物質(zhì)促進(jìn)機體健康[5-7]。唐志剛等[8]研究表明，日糧添加0.01%的益生菌可促進(jìn)AA雞快速生長和免疫器官發(fā)育，也可提高機體抗病力和蛋白質(zhì)利用率。研究發(fā)現(xiàn)，日糧添加枯草芽孢桿菌制劑可提高肉雞日增體質(zhì)量和飼料利用率，刺激機體分泌腸道酶和其他酶，促進(jìn)飼料消化吸收[9-12]。但不同的研究結(jié)果間也有差異。余東游等[13]發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加1×105cfu/g的枯草芽孢桿菌對308羅斯肉雞前期生長不明顯，但后期效果優(yōu)于前期，且全期料重比降低，飼料轉(zhuǎn)化率增大。本研究結(jié)果表明，0.020%和0.025%枯草芽孢桿菌添加組1—21日齡、22—42日齡以及飼養(yǎng)全期AA雞的ADG均高于對照組。這與陳彩文等[14]、譚榮炳等[15]和鄭春芳等[16]研究結(jié)果一致，但與齊博等[17]研究結(jié)果不一致，推測可能與雞品種、菌群種類及活菌數(shù)、添加劑量和飼養(yǎng)環(huán)境有關(guān)。在飼糧中添加0.020%和0.025%枯草芽孢桿菌有利于促進(jìn)AA雞的生長發(fā)育，并提高飼料利用率。分析其相關(guān)作用機制，可能與枯草芽孢桿菌能夠增加腸道有益菌群數(shù)量和比例，補充內(nèi)源酶的不足并提高了營養(yǎng)物質(zhì)的利用率有關(guān)[18]。

3.2 高溫環(huán)境下飼糧添加枯草芽孢桿菌對AA雞免疫指標(biāo)的影響

飼料添加微生態(tài)制劑可提高血清中的IgG、補體(C3)和AKP[19]，降低料重比，顯著提高雞只免疫器官指數(shù)和消化器官指數(shù)[20]。劉明超等[21]發(fā)現(xiàn)，添加0.03%的枯草芽孢桿菌可明顯提高36日齡羅斯308肉雞的胸腺指數(shù)；添加0.1%的枯草芽孢桿菌制劑(一類為Pa02制劑，另一類為PAS38，活菌數(shù)均為1×106cfu/g)可明顯改善4周齡和6周齡愛維因肉雞的胸腺、脾臟和法氏囊器官發(fā)育[22]。不同微生態(tài)制劑之間的效果也有差異，利明[23]在日糧中添加枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、地衣芽孢桿菌(B.lichenlformis)和遲緩芽孢桿菌(B.lentus)，探究其對雄性AA雞免疫器官發(fā)育和免疫細(xì)胞吞噬能力，以枯草芽孢桿菌的效果最好。本研究檢測得，0.020%枯草芽孢桿菌添加組21日齡AA雞的胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)分別高于對照組61.25%(P<0.05)和59.26%(P<0.05)，0.025%枯草芽孢桿菌添加組21日齡AA雞的胸腺指數(shù)高于對照組52.50%(P<0.05)。0.025%枯草芽孢桿菌添加組42日齡AA雞的脾臟指數(shù)分別高于對照組和其他試驗組43.43%(P<0.05)、39.21%(P>0.05)、36.54%(P>0.05)、23.48%(P>0.05)。利明[23]通過研究B.subtilis、B.lichenlformis和B.lentus對雄性AA雞生產(chǎn)性能和免疫功能的影響，結(jié)果表明，法氏囊指數(shù)較對照組均有不同程度增加，但差異不顯著，與本試驗結(jié)果相似。

枯草芽孢桿菌主要通過好氧呼吸的方式進(jìn)行發(fā)酵，可作為免疫因子刺激并激活生命體免疫細(xì)胞，使免疫系統(tǒng)成熟加快。倪耀娣等[24]報道，口服活菌微生態(tài)制劑可延緩病毒免疫后新城疫抗體滴度消長速度；DUC等[25]發(fā)現(xiàn)，飼喂枯草芽孢桿菌可提高小鼠免疫球蛋白G效價水平，并能誘導(dǎo)和促進(jìn)炎細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-6生成；王雄等[26]研究發(fā)現(xiàn)，飼喂銀鯽微生態(tài)制劑后，飼喂組在第7天、第14天、第21天和第28天的LZM均高于未飼喂組。本研究中，0.020%和0.025%枯草芽孢桿菌添加組21日齡AA雞的IgG含量和LZM均高于對照組，0.015%、0.020%和0.025%枯草芽孢桿菌添加組42日齡AA雞的IgG含量均高于對照組(P<0.05)，0.020%、0.025%枯草芽孢桿菌添加組42日齡AA雞的IgG含量比0.010%枯草芽孢桿菌添加組分別升高2.95%(P<0.05)、11.33%(P<0.05)。各試驗組42日齡AA雞的LZM均大于對照組，其中，0.020%枯草芽孢桿菌添加組提高10.36%(P<0.05)。因此，飼糧中添加不同劑量的枯草芽孢桿菌可明顯提高血清NDV-Ab、IgG含量和LZM，進(jìn)而提高AA雞的免疫功能。