洪梅，黃夢陽，江紅，康慧聰，許峰，劉曉艷，龔權(quán)，胡琦，張存泰，朱遂強(qiáng)

帕金森病（Parkinson disease，PD）是常見的神經(jīng)變性疾病，全球發(fā)病率達(dá)0.3%左右[1]，臨床癥狀包括靜止性震顫、肌僵直、運(yùn)動遲緩和姿勢平衡障礙等[2]，病理改變主要是中腦黑質(zhì)致密部含黑色素的多巴胺能神經(jīng)元（dopaminergic neuron，DN）變性、缺失及殘存神經(jīng)元內(nèi)以α-突觸核蛋白（α-Synuclein，α-Syn）為主要成分的路易小體形成[3]。α-Syn是一種主要位于突觸前末梢的酸性蛋白，在游離狀態(tài)下其單體呈無序的未折疊結(jié)構(gòu)，與生物膜結(jié)合時則表現(xiàn)為α-螺旋結(jié)構(gòu)，當(dāng)表達(dá)增加或變異時，可轉(zhuǎn)變?yōu)榈矸劾w維樣的β-折疊結(jié)構(gòu)，形成寡聚體和多聚體[4,5]。目前認(rèn)為α-Syn寡聚體毒性是導(dǎo)致DN變性、缺失的重要原因，但具體生物學(xué)機(jī)制仍不清楚。本研究擬經(jīng)魚藤酮持續(xù)灌胃構(gòu)建PD小鼠模型，初步探討α-Syn寡聚體導(dǎo)致DN變性缺失的可能生物學(xué)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 12月齡清潔級健康雄性C57BL/6小鼠，體質(zhì)量約28 g，由武漢大學(xué)動物實驗中心提供，許可證號SCXK（鄂）2008-0004。

1.1.2 主要試劑與材料 魚藤酮購自美國Sigma公司；氯仿購自天津市化學(xué)試劑公司；羧甲基纖維素購自上海KaYon生物科技有限公司；BCA試劑盒購自Thermo Fisher Scientific公司；兔抗小鼠α-Syn、β-actin抗體均購自美國Santa Cruz公司；DAB、Mayor’s蘇木素均購自武漢博士德生物公司；兔抗小鼠酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase，TH）抗體購自美國Chemicon公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-PX）、丙二醛（maleic dialdehyde，MDA）試劑盒購自南京建成生物工程研究所。魚藤酮溶液的配制：將魚藤酮粉末溶于12.5%氯仿，配制成50 mg/mL魚藤酮溶液，20℃避光保存；灌胃時再將魚藤酮氯仿溶液與2%羧甲基纖維素溶液攪拌混勻，小鼠魚藤酮灌胃劑量為5 mg/kg，溶液體積為0.01 mL/g。同時，將氯仿、2%羧甲基纖維素按上述比例配制成空白對照溶液。

1.2 方法

1.2.1 灌胃處理 取小鼠48只，隨機(jī)分為對照組和魚藤酮組，每組各24只（實驗過程中如有小鼠死亡，則根據(jù)死亡數(shù)量補(bǔ)齊）。魚藤酮組灌注0.01 mL/g魚藤酮氯仿溶液，對照組則灌注0.01 mL/g的空白對照溶液，灌胃5 d/周，休息2 d，均連續(xù)灌胃12周。

1.2.2 Western blotting檢測α-Syn表達(dá)水平 于灌胃12周后，各組取小鼠6只，麻醉后斷頭取中腦，提取蛋白，采用BCA法測定蛋白的含量。以SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白。實驗結(jié)果以α-Syn與β-actin條帶灰度的比值表示α-Syn相對表達(dá)水平。

1.2.3 免疫組織化學(xué)染色 于灌胃前、灌胃12周后，各組取小鼠4只，麻醉后斷頭取中腦，常規(guī)法制作石蠟切片，切片脫蠟，置PBS中加熱煮沸15 min修復(fù)抗原，3%H2O2孵育10 min以耗竭內(nèi)源性過氧化物酶，1%BSA封閉30 min，去除封閉液，加入抗TH一抗抗體（1∶1 000）4℃過夜，PBS漂洗5 min×3次，加入二抗37℃孵育30 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染1～2 min，梯度酒精脫水，二甲苯透明中性樹脂封片，顯微鏡下觀察，每個標(biāo)本選5張連續(xù)切片觀察黑質(zhì)部分。每張切片先在低倍鏡下選取TH陽性細(xì)胞密集區(qū)，再在高倍鏡下隨機(jī)選取10個視野，進(jìn)行陽性細(xì)胞數(shù)，計算出平均值。

1.2.4 電鏡觀察 灌胃12周后，各組取小鼠2只，灌注固定后取黑質(zhì)約0.5 mm3，2.5%戊二醛、1%鋨酸鉛雙重固定，脫水，Epon812包埋，LKB-Ⅲ切片機(jī)超薄切片，醋酸鈾硝酸鉛雙重染色，IEM-1200EX透射電鏡觀察。

1.2.5 氧化應(yīng)激水平的測定 灌胃前及灌胃12周后，各組取小鼠4只，麻醉后斷頭取中腦，勻漿，采用BCA法測定蛋白的含量，SOD的測定采用水溶性四唑鹽（WST-1）法，GSH-PX的測定采用比色法，MDA測定采用硫代巴比妥酸（TBA）法，具體操作按南京建成生物工程研究所試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 17.0軟件處理數(shù)據(jù)。符合正態(tài)分布以及方差齊性的計量資料以（±s）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本均數(shù)t檢驗；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 中腦黑質(zhì)α-Syn表達(dá)水平比較

Western blotting檢測結(jié)果顯示，灌胃12周后，魚藤酮組中腦黑質(zhì)處α-Syn單體和α-Syn寡聚體的表達(dá)量均較對照組明顯增多（P＜0.05及P＜0.01），見圖1。

2.2 中腦黑質(zhì)TH陽性細(xì)胞數(shù)比較

灌胃前，魚藤酮組和對照組小鼠中腦黑質(zhì)處TH陽性細(xì)胞數(shù)分別為（25.15±1.63）個和（24.70±1.69）個，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.397）。灌胃12周后，魚藤酮組和對照組小鼠中腦黑質(zhì)處TH陽性細(xì)胞數(shù)分別為（20.90±1.62）和（22.9±2.17），魚藤酮組較對照組明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.002），見圖2。

2.3 電鏡結(jié)果

灌胃12周后，對照組黑質(zhì)部胞內(nèi)細(xì)胞器未見明顯腫脹，而魚藤酮組小鼠黑質(zhì)部胞內(nèi)線粒體、高爾基體均可見明顯不規(guī)則腫脹，見圖3。

注：灌胃12周后，魚藤酮組小鼠中腦黑質(zhì)α-Syn單體及寡聚體的表達(dá)較對照組增多。Rot：魚藤酮組；Veh：對照組；Aggregates：寡聚體；Monomer：單體；④P＜0.05，④P＜0.01

圖2 中腦黑質(zhì)TH陽性細(xì)胞數(shù)比較（免疫組化，×40）

圖3 灌胃12周2組小鼠中腦黑質(zhì)超微病理（×5000）

2.4 氧化應(yīng)激水平

灌胃前，2組雙側(cè)黑質(zhì)SOD、MDA、GSH-PX水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。灌胃12周后，魚藤酮組雙側(cè)黑質(zhì)SOD、GSH-PX水平低于對照組（P＜0.05），MDA水平高于對照組（P＜0.05），見表1。

表1 2組小鼠中腦SOD、MDA、GSH-PX表達(dá)水平比較（x±s）

3 討論

PD的經(jīng)典病理改變?yōu)橹心XDN變性缺失，目前認(rèn)為α-Syn異常聚集的寡聚體具有細(xì)胞毒性，是導(dǎo)致DN變性缺失的主要原因[4,5]，但具體生物學(xué)機(jī)制仍不清楚。

既往缺乏理想的PD動物模型用于研究α-Syn寡聚體的毒性作用機(jī)制。如經(jīng)皮下注射6-羥基多巴[6]構(gòu)造的PD大鼠模型雖有行為學(xué)改變，但不能在體內(nèi)形成α-Syn寡聚體。皮下或腦內(nèi)注射魚藤酮[7]雖可形成α-Syn寡聚體，但魚藤酮本身也可直接損傷系統(tǒng)性線粒體復(fù)合酶I、誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡等，導(dǎo)致在此模型體內(nèi)難以區(qū)分α-Syn寡聚體與魚藤酮的細(xì)胞毒性作用。近年采用低劑量魚藤酮持續(xù)灌胃老年小鼠的方法制備出慢性PD模型，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元缺失、α-Syn寡聚體沉積等病理改變由胃腸道神經(jīng)叢逐漸散播至中腦黑質(zhì)。模型小鼠腦和血液內(nèi)魚藤酮滴度、線粒體復(fù)合酶I活性未發(fā)現(xiàn)顯著性改變[8]。而截斷連接腦干和胃腸道的迷走神經(jīng)干后，再對小鼠采取魚藤酮持續(xù)灌胃處理，則小鼠中腦內(nèi)未再出現(xiàn)上述病理改變[9]。該模型的生物學(xué)機(jī)制很可能是腸壁神經(jīng)叢內(nèi)形成的α-Syn寡聚體經(jīng)類朊蛋白途徑沿神經(jīng)傳導(dǎo)通路緩慢播散至中腦所致[10]，而非魚藤酮直接損傷DN。因此，此模型是研究α-Syn寡聚體細(xì)胞毒性機(jī)制的理想動物模型。

本課題組使用C57老年小鼠持續(xù)魚藤酮灌胃構(gòu)造上述模型，灌胃12周后免疫組化染色結(jié)果顯示中腦DN明顯減少，行為學(xué)檢測也有顯著性改變，證實該P(yáng)D小鼠模型構(gòu)造成功[11]。Western blotting結(jié)果顯示中腦α-Syn寡聚體顯著性增加，而寡聚體是α-Syn異常聚集體中的主要毒性成分[12,13]。本研究還發(fā)現(xiàn)中腦內(nèi)SOD、GSH-PX濃度顯著降低，MDA顯著增多，提示細(xì)胞內(nèi)活性氧物質(zhì)增加，超氧陰離子自由基的清除能力明顯下降，透射電鏡也發(fā)現(xiàn)黑質(zhì)部線粒體、高爾基體等均出現(xiàn)不規(guī)則腫脹，以上結(jié)果提示α-Syn寡聚體有可能通過氧化應(yīng)激途徑導(dǎo)致DN的損傷。Parihar等[14]將從大鼠神經(jīng)元內(nèi)先分離出來的線粒體孵育在含有α-Syn寡聚體的溶液中30 min，再采用免疫熒光顯像發(fā)現(xiàn)α-Syn寡聚體可進(jìn)入線粒體內(nèi)，并導(dǎo)致胞內(nèi)活性氧物質(zhì)含量和蛋白質(zhì)酪氨酸硝化水平升高。而Devi等[15]采用蛋白質(zhì)印跡技術(shù)發(fā)現(xiàn)PD患者黑質(zhì)紋狀體神經(jīng)元內(nèi)線粒體內(nèi)存在明顯α-Syn沉積，且使線粒體復(fù)合酶I亞基活性顯著降低。因此，α-Syn寡聚體可能通過抑制線粒體復(fù)合酶I活性而導(dǎo)致線粒體功能障礙、活性氧物質(zhì)產(chǎn)生增加，經(jīng)氧化應(yīng)激途徑導(dǎo)致DN損傷。

研究還發(fā)現(xiàn)α-Syn寡聚體可通過其他途徑對神經(jīng)元產(chǎn)生毒性作用。首先，α-Syn多聚體可通過TLR4受體活化神經(jīng)元周圍的膠質(zhì)細(xì)胞[16]，活化的膠質(zhì)細(xì)胞上調(diào)胞內(nèi)NADPH氧化酶和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶的表達(dá)，釋放過氧化物、一氧化氮至胞外，進(jìn)而加重DN損傷[17]。其次，α-Syn聚集物還可結(jié)合Tau蛋白，促進(jìn)Tau蛋白聚集，抑制微管蛋白合成，改變細(xì)胞骨架從而導(dǎo)致神經(jīng)元損傷[18]。再次，α-Syn寡聚體還可在細(xì)胞膜上形成跨膜小孔，破壞細(xì)胞膜的完整而發(fā)揮其毒性作用[19]。最后，α-Syn寡聚體可損傷泛素-蛋白酶體系統(tǒng)或/和自噬-溶酶體途徑，致使清除異常蛋白作用下降，進(jìn)一步加重α-Syn異常聚集，最后導(dǎo)致神經(jīng)元死亡[20]。

綜上所述，經(jīng)低劑量魚藤酮持續(xù)灌胃老年小鼠可導(dǎo)致中腦內(nèi)出現(xiàn)α-Syn增多及DN減少缺失，α-Syn寡聚體有可能通過氧化應(yīng)激途徑對DN產(chǎn)生細(xì)胞毒性，但詳細(xì)的生物學(xué)機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究。