潘 南，劉智禹

(1.福建省水產(chǎn)研究所，福建省海洋生物增養(yǎng)殖與高值化利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門(mén) 361013； 2.福建省海洋生物資源開(kāi)發(fā)利用協(xié)同創(chuàng)新中心，福建 廈門(mén) 361013)

新藥研究開(kāi)發(fā)核心之一是將基礎(chǔ)化學(xué)、生物分子和疾病聯(lián)系起來(lái)，完成高通量篩選、合成優(yōu)化、藥理、毒理等臨床前試驗(yàn)，主要由政府提供資金的科研院校、研究機(jī)構(gòu)完成；其二是臨床研究、注冊(cè)上市和售后監(jiān)督等，耗資大、耗時(shí)長(zhǎng)、參與人數(shù)多，一般由制藥企業(yè)和委托研究機(jī)構(gòu)(Contract research organization，CRO)完成。市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)的加劇促使制藥企業(yè)加快產(chǎn)品管線的更新?lián)Q代，因此制藥產(chǎn)業(yè)界從本質(zhì)上對(duì)藥效突出、技術(shù)前沿、開(kāi)發(fā)前景好的基礎(chǔ)科研項(xiàng)目趨之若鶩。海洋動(dòng)物經(jīng)歷數(shù)百萬(wàn)年的進(jìn)化微調(diào)而演化出極高的靶向親和效力和穩(wěn)定性的代謝產(chǎn)物[1]，這使得它們成為制藥業(yè)藥品開(kāi)發(fā)管線的靈感源泉之一。本文對(duì)海洋動(dòng)物蛋白藥物及其研究現(xiàn)狀進(jìn)行了梳理，總結(jié)了海兔毒素、芋螺毒素、海鞘毒素、海綿活性多肽、?？钚远嚯募捌浣Y(jié)構(gòu)類(lèi)似物、衍生物的來(lái)源、結(jié)構(gòu)、藥理、分子靶標(biāo)、臨床試驗(yàn)研究現(xiàn)狀和發(fā)展瓶頸。

1 海兔毒素及其衍生物

1.1 海兔毒素Dolastatins

Pettit課題組于1987年首次報(bào)道了印度洋無(wú)殼軟體動(dòng)物截尾海兔(Dolabellaauricularia)消化腺毒素dolastatins的分離、鑒定[2]。Dolastatins是一種線性五肽，包含dolavaline(Dov)、valine(Val)、dolaisoleuine(Dil)、dolaproine(Dap)和dolaphemine(Doe)五個(gè)子單元[3]。其中dolastatin 10和dolastatin 15在體外實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出極強(qiáng)的抑制細(xì)胞增殖、抗腫瘤活性，其通過(guò)與β微管蛋白結(jié)合，迫使細(xì)胞分裂停滯，進(jìn)而凋亡。由于天然存在的dolastatins含量非常低，Pettit和合作者被迫開(kāi)發(fā)了全新的化學(xué)合成方法，以便獲得足夠的材料進(jìn)行基本的細(xì)胞生物學(xué)研究，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步合成出一系列dolastatin衍生物auristatin PE(又稱(chēng)Soblidotin；TZT-1027；YHI-501)、tasidotin(又稱(chēng)Synthadotin；BSF 223651；ILX 651；LU 223651；SYN-D)和Cemadotin(又稱(chēng)LU-103793；NSC D 669356)。然而由于藥物細(xì)胞毒性和/或缺乏功效，海兔毒素dolastatin 10、15衍生物均沒(méi)有進(jìn)行超過(guò)臨床二期的研究(表1)[4]。

表1 經(jīng)藥品監(jiān)督管理機(jī)構(gòu)審批進(jìn)入臨床的海兔毒素dolastatin 10、15衍生物[4]

1.2 海兔毒素衍生物Auristatins

為了提高作用效力，Pettit課題組對(duì)dolastatin 10的C 端或N 端進(jìn)行修飾，合成了auristatins 系列藥物(auristatin E、auristatin PHE 、auristatin PYE、auristatin-2-AQ、auristatin-6-AQ)[5]，增強(qiáng)了藥物水溶性的同時(shí)仍然保持了顯著體外抗腫瘤效力(10～100 pM，取決于所用的細(xì)胞株系)。然而體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果仍然不盡理想。

1.3 經(jīng)批準(zhǔn)上市的auristatins 抗體-藥物偶合物(Adcetris?)

美國(guó)西雅圖遺傳學(xué)公司(Seattle Genetics)于2003年首次發(fā)表了其在auristatins 抗體-藥物偶合物的研究進(jìn)展，其在單甲基auristatin E(MMAE)的N端通過(guò)對(duì)氨基芐氧羰基(PABC)間隔體鍵合纈氨酸-瓜氨酸(vc)連接體以偶合cAC10(CD30 抗體)，形成特異性腫瘤靶向抗體-藥物偶合物Brentuximab vedotin(又稱(chēng)cAC10-vcMMAE；SGN-35)(表2)[6]。通過(guò)cAC10 靶向識(shí)別腫瘤細(xì)胞膜上的CD30蛋白， Brentuximab vedotin與 CD30蛋白結(jié)合后經(jīng)細(xì)胞網(wǎng)格蛋白的調(diào)節(jié)被內(nèi)吞入細(xì)胞，在溶酶體中被蛋白酶水解釋放出MMAE，進(jìn)一步抑制微管蛋白聚合，使細(xì)胞停留在G2-M期，促使細(xì)胞凋亡[7]。經(jīng)歷一系列臨床研究，美國(guó)食品藥品管理局(FDA)于2011年、歐洲醫(yī)藥管理局(EMA)于2012年批準(zhǔn)Brentuximab vedotin以商品名Adcetris?(圖1-A)上市，用于治療CD30表達(dá)的霍奇金淋巴瘤和系統(tǒng)性間變性大細(xì)胞淋巴瘤[8]。美國(guó)西雅圖遺傳學(xué)公司與日本武田公司(Millenium，Takeda)合作，該藥物于2014年在日本獲得衛(wèi)生、勞動(dòng)和福利部(MHLW)批準(zhǔn)上市[9]。

表2 經(jīng)藥品監(jiān)督管理機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)上市的海洋動(dòng)物蛋白藥物[6，8-11]

1.4 經(jīng)審批進(jìn)入臨床試驗(yàn)的auristatins抗體-藥物偶合物

隨著腫瘤細(xì)胞靶點(diǎn)單克隆抗體研究和連接體技術(shù)的高速發(fā)展，為尋求更好的臨床試驗(yàn)結(jié)果，高效、高活性的海洋動(dòng)物細(xì)胞毒性蛋白受到單克隆抗體藥物研究者的青睞。以海兔毒素dolastatin 10為母體化合物合成的auristatins系列被廣泛應(yīng)用于抗體-藥物偶合物臨床試驗(yàn)中。表3總結(jié)了目前經(jīng)審批進(jìn)入臨床試驗(yàn)的auristatins抗體-藥物偶合物，但必須指出的是，這份表格不是“完整的”，原因一是表格內(nèi)容采用已公開(kāi)的科學(xué)研究報(bào)道(論文、專(zhuān)利)[12-34]和公共數(shù)據(jù)庫(kù)(NIH ClinicalTrial.gov數(shù)據(jù)庫(kù)、NIH PubChem公共化學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)、Adis Insight Springer數(shù)據(jù)庫(kù))資料[35-37]，臨床試驗(yàn)藥物的靶點(diǎn)、連接體技術(shù)、細(xì)胞毒性藥物的公開(kāi)與否由投資者、合作者決定，因而無(wú)法掌握臨床試驗(yàn)藥物的全部細(xì)節(jié)；原因二是與臨床試驗(yàn)現(xiàn)狀不一定相符，藥物效力、患者招募、投資決策等風(fēng)險(xiǎn)因素時(shí)刻影響臨床試驗(yàn)階段的變化，企業(yè)不一定及時(shí)將產(chǎn)品管線臨床研究的信息更新。從目前整理的信息來(lái)看，共有32種auristatins抗體-藥物偶合物經(jīng)藥品監(jiān)督管理機(jī)構(gòu)審批進(jìn)入臨床/臨床前試驗(yàn)階段，其中：2種auristatins抗體-藥物偶合物進(jìn)入臨床三期階段；11種auristatins抗體-藥物偶合物進(jìn)入臨床二期階段；19種auristatins抗體-藥物偶合物進(jìn)入臨床一期階段。

表3 經(jīng)藥品監(jiān)督管理機(jī)構(gòu)審批進(jìn)入臨床研究的auristatins抗體-藥物偶合物[12-37]

續(xù)表3

續(xù)表3

2 芋螺毒素及其衍生物

Cruz課題組于1985年首次報(bào)道了食魚(yú)性地紋芋螺(Conusgeographus)毒液多肽conotoxins(CTxs)的分離、鑒定[38]。Conotoxins是一類(lèi)富含二硫鍵的神經(jīng)肽(10 - 30個(gè)氨基酸殘基)，根據(jù)與不同脊椎動(dòng)物神經(jīng)遞質(zhì)/激肽受體和離子通道的特異性靶向親和能力，其分類(lèi)為α-、δ-、κ-、μ-、ω-[39]。引人注意的是conotoxins通過(guò)翻譯后修飾(PTM)，如C-端酰胺化、N-端焦谷氨酸化和關(guān)鍵氨基酸殘基的L到D異構(gòu)化，以及廣泛的半胱氨酸交聯(lián)支撐，天然形成穩(wěn)定的分子結(jié)構(gòu)以對(duì)抗極端環(huán)境和蛋白酶水解。穩(wěn)定、效力和靶向性等特質(zhì)吸引了制藥企業(yè)和資本推動(dòng)conotoxins從研發(fā)向臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化。

2.1 經(jīng)批準(zhǔn)上市的芋螺毒素Ziconitide(Prialt?)

Ziconitide(又稱(chēng)SNX-111)是由美國(guó)Elan公司研發(fā)的太平洋幻芋螺毒液多肽ω-MVIIA 的化學(xué)合成體，其與中樞神經(jīng)系統(tǒng)N型電壓敏感性鈣離子通道高度親和，無(wú)需第二信使或G蛋白，故不會(huì)引起藥物依賴(lài)或成癮。經(jīng)歷一系列臨床研究，美國(guó)食品藥品管理局(FDA)于2004年批準(zhǔn)了Ziconitide以商品名Prialt?(圖1-B)上市，用于治療慢性疼痛(表2)[10]。盡管Prialt?具有3個(gè)二硫鍵穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，但由于中樞神經(jīng)受體的特殊性，其采用了鞘內(nèi)注射的藥物輸送方式以增強(qiáng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)靶向效力。然而與腸外或口服給藥相比，鞘內(nèi)注射具有內(nèi)在風(fēng)險(xiǎn)[40]，這使得Prialt?在患者接受度和市場(chǎng)滲透率方面受到了極大的限制。與同功效藥物對(duì)比，輝瑞公司口服活性鎮(zhèn)痛/抗癲癇藥物Neurontin?在2003年達(dá)到27億美元的銷(xiāo)售高峰[41]，而Prialt?在2009財(cái)政年度的最終用戶銷(xiāo)售額僅為2 000萬(wàn)美元，Azur Pharma在2010年僅以1 460萬(wàn)美元收購(gòu)了Prialt?歐洲版權(quán)[1]，Prialt?在營(yíng)銷(xiāo)方面不盡理想。

2.2 經(jīng)批準(zhǔn)進(jìn)入臨床/臨床前試驗(yàn)的芋螺毒素

由于conotoxins種類(lèi)豐富，在中樞、外周神經(jīng)系統(tǒng)中靶向位點(diǎn)眾多，且不易被蛋白酶水解，天然結(jié)構(gòu)具有較強(qiáng)的藥物開(kāi)發(fā)潛質(zhì)，制藥界在臨床/臨床前研究中對(duì)其日益關(guān)注。表4總結(jié)了目前經(jīng)審批進(jìn)入臨床/臨床前試驗(yàn)的芋螺毒素，靶向位點(diǎn)包括去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、GABAB a和 nAChR、神經(jīng)降壓素受體、NMDA受體、CaV2.2通道、Shaker類(lèi)型KV 通道，適用領(lǐng)域包括術(shù)后疼痛、神經(jīng)病理性疼痛、難治性癲癇、心肌梗塞[1，35-37，42-45]。然而由于藥物缺乏功效、投資決策變更或撤資等因素影響，芋螺毒素均沒(méi)有進(jìn)行超過(guò)臨床二期的研究。由此可見(jiàn)，與其他類(lèi)型藥物相比，目前海洋動(dòng)物蛋白藥物在中樞神經(jīng)系統(tǒng)靶向開(kāi)發(fā)成功率較低。

表4 經(jīng)藥品監(jiān)督管理機(jī)構(gòu)審批進(jìn)入臨床/臨床前研究的芋螺毒素[1，35-37，42-45]

3 海鞘毒素及其衍生物

Rinehart課題組于1981年報(bào)道了加勒比海海鞘(Trididemnumsolidum)提取物didemnins的分離、鑒定[46]。Didemnins是一類(lèi)環(huán)形縮肽，具有較高的抗腫瘤活性，其中didemnin B的功能活性最強(qiáng)，通過(guò)特異性結(jié)合真核翻譯延長(zhǎng)因子1A(eEF1A)，啟動(dòng)細(xì)胞凋亡，致使腫瘤細(xì)胞程序性死亡，成為美國(guó)第一個(gè)進(jìn)入臨床試驗(yàn)的海洋抗腫瘤天然產(chǎn)物[47]。Didemnin B(表5)已完成了針對(duì)復(fù)發(fā)性或難治性間變性星形細(xì)胞瘤或多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的二期臨床試驗(yàn)。不幸的是，該化合物由于患者中高發(fā)生率的過(guò)敏反應(yīng)而顯示出高毒性，試驗(yàn)已終止[48]。Didemnin同系物脫氫 didemnin B(又稱(chēng)Plitidepsin)(表2、5)目前已完成了針對(duì)復(fù)發(fā)/難治性多發(fā)性骨髓瘤的臨床三期試驗(yàn)[49]，并向醫(yī)藥監(jiān)管機(jī)構(gòu)申請(qǐng)了上市許可。澳大利亞藥品管理局(TGA)于2018年12月批準(zhǔn)了plitidepsin以商品名Aplidin?(圖1-C)上市，其將聯(lián)合地塞米松用于對(duì)其他療法治療失敗或有抵抗的復(fù)發(fā)性或難治性多發(fā)性骨髓瘤患者的治療[11]。

4 海綿活性多肽

Kashman課題組于1994年報(bào)道了南非海綿(Hemiasterellaminor)提取物中細(xì)胞毒性多肽hemiasterlin的分離、鑒定[50]。Hemiasterlin是一種三肽化合物，其通過(guò)與微管蛋白結(jié)合，使微管解聚，影響紡錘體形成，誘導(dǎo)有絲分裂停滯，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。為了提高作用效力，課題組合成了一系列衍生物，其中以Taltobulin(又稱(chēng)HTI-286)和E 7974細(xì)胞毒性比天然產(chǎn)物hemiasterlin更佳，繼而進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。然而HTI-286因商業(yè)決策改變，不在制藥企業(yè)管線中體現(xiàn)而終止開(kāi)發(fā)，E 7974則完成臨床一期試驗(yàn)(表5)[9]。

5 ?？钚远嚯?/h2>

Karlsson課題組于1995年報(bào)道了加勒比?？?Stichodactylahelianthus)毒液神經(jīng)肽Stichodactyla toxin(ShK)的分離、鑒定[51]。ShK由35個(gè)氨基酸殘基組成，特異性作用于電壓門(mén)控Kv1.3鉀離子通道。2015—2017年，ShK類(lèi)似物ShK-186(又稱(chēng)Dalazatide)成為美國(guó)第一個(gè)進(jìn)入臨床試驗(yàn)的自身免疫疾病Kv1.3阻斷制劑，目前已完成臨床一期試驗(yàn)(表5)[35-37]。Lazdunski課題組于2004年報(bào)道了?？?Anthopleuraelegantissima)毒液神經(jīng)肽APETx2的分離、鑒定[52]。APETx2是42個(gè)氨基酸、包含3個(gè)二硫鍵的神經(jīng)多肽，特異性抑制感覺(jué)神經(jīng)元中的酸敏感通道ASIC3。目前已進(jìn)入臨床前試驗(yàn)，適用于治療炎性疼痛(表5)[53]。

表5 經(jīng)藥品監(jiān)督管理機(jī)構(gòu)審批進(jìn)入臨床/臨床前研究的海鞘毒素、海綿活性多肽、?？钚远嚯腫9，35～37，48-49，53]

續(xù)表5

6 結(jié)語(yǔ)與展望

本文對(duì)海洋動(dòng)物來(lái)源蛋白藥物的最新研究進(jìn)展進(jìn)行了梳理。從功效領(lǐng)域來(lái)看，海洋動(dòng)物蛋白主要?dú)w類(lèi)為細(xì)胞毒性蛋白、神經(jīng)毒素蛋白和離子通道抑制劑。從藥物開(kāi)發(fā)領(lǐng)域來(lái)看，海洋動(dòng)物細(xì)胞毒性蛋白主要應(yīng)用于抗癌和免疫藥物開(kāi)發(fā)，市場(chǎng)轉(zhuǎn)化率好且呈現(xiàn)蓬勃發(fā)展的態(tài)勢(shì)；海洋動(dòng)物神經(jīng)毒素蛋白和離子通道抑制劑主要應(yīng)用于治療慢性疼痛藥物開(kāi)發(fā)，由于藥物代謝進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)的成功率僅為1%，故海洋動(dòng)物神經(jīng)毒素蛋白和離子通道抑制劑針對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)靶標(biāo)開(kāi)發(fā)的衍生藥物成功率較低。從市場(chǎng)應(yīng)用進(jìn)展來(lái)看，目前共有3種海洋動(dòng)物蛋白藥物(商品名Prialt?、Adcetris?和Aplidin?)獲得藥品監(jiān)督管理機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)成功上市，分別用于治療慢性疼痛、霍奇金淋巴瘤、系統(tǒng)性間變大細(xì)胞淋巴瘤和復(fù)發(fā)性或難治性多發(fā)性骨髓瘤。從藥物臨床進(jìn)展最高階段來(lái)看，目前共有32種auristatins抗體-藥物偶合物、6種芋螺毒素、2種海鞘毒素、2種海綿活性多肽、2種?？钚远嚯慕?jīng)藥品監(jiān)督管理機(jī)構(gòu)審批進(jìn)入臨床/臨床前試驗(yàn)階段。其中2種auristatins抗體-藥物偶合物進(jìn)入臨床三期階段，具有較好的藥品商業(yè)轉(zhuǎn)化預(yù)期和前景；11種auristatins抗體-藥物偶合物、3種芋螺毒素、2種海鞘毒素進(jìn)入臨床二期階段；19種auristatins抗體-藥物偶合物、1種芋螺毒素、2種海綿活性多肽、1種?？钚远嚯倪M(jìn)入臨床一期階段；2種芋螺毒素、1種海葵活性多肽經(jīng)藥品監(jiān)督管理機(jī)構(gòu)審批進(jìn)入臨床前試驗(yàn)階段。

縱觀天然產(chǎn)物的藥物發(fā)展歷程，從20世紀(jì)70、80年代美國(guó)癌癥研究中心(NCI)和美國(guó)農(nóng)業(yè)部(USDA)啟動(dòng)轟轟烈烈的陸源、海源天然藥物篩選項(xiàng)目，到90年代制藥企業(yè)紛紛終止天然產(chǎn)物項(xiàng)目，再到本世紀(jì)初高通量篩選和組合化學(xué)以及近十年來(lái)發(fā)展迅猛的細(xì)胞毒性藥物-單克隆抗體聯(lián)合藥物，海洋動(dòng)物蛋白藥物完整經(jīng)歷了技術(shù)更新、資金和時(shí)間的考驗(yàn)，在惡性腫瘤、慢性疼痛等疾病治療以及神經(jīng)系統(tǒng)離子通道特異性診斷方面取得了實(shí)實(shí)在在的成果。據(jù)此，相信在未來(lái)，隨著質(zhì)譜、核磁共振波譜、轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，將有越來(lái)越多海洋動(dòng)物來(lái)源的活性蛋白被發(fā)現(xiàn)；隨著單克隆腫瘤抗體靶向技術(shù)和突破血腦屏障緩釋技術(shù)水平的提升，海洋動(dòng)物蛋白藥物的效能與給藥方式的瓶頸將得以突破。我們期待更多的藥物從自然海洋走向醫(yī)護(hù)救治。