陳錦豪，鄭錦濱，王攀攀，李天驕，毛 勇，2*，蘇永全，王 軍

(1.廈門大學(xué)海洋與地球?qū)W院，福建 廈門 361102； 2.廈門大學(xué)近海海洋環(huán)境科學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 361102)

凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)，亦稱南美白對(duì)蝦、太平洋白對(duì)蝦，原產(chǎn)于中、南美的秘魯北部至墨西哥太平洋沿岸，但在厄瓜多爾沿岸分布尤為集中[1]。凡納濱對(duì)蝦是一種熱帶蝦，具有生長(zhǎng)快、抗病力強(qiáng)、適應(yīng)性強(qiáng)、殼薄肉嫩，味道鮮美等特點(diǎn)，在對(duì)蝦業(yè)養(yǎng)殖中占有重要地位，在我國(guó)南北方沿海地區(qū)廣泛養(yǎng)殖[2]。但近年來(lái)，一方面養(yǎng)殖環(huán)境不斷惡化，對(duì)蝦病害頻繁暴發(fā)；另一方面隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大，對(duì)蝦親本來(lái)源選擇過(guò)于盲目，甚至從養(yǎng)殖池里直接選用，造成對(duì)蝦群體遺傳多樣性降低、近交衰退等，導(dǎo)致對(duì)蝦生產(chǎn)降低，嚴(yán)重影響今后對(duì)蝦優(yōu)良種質(zhì)的保護(hù)和利用以及生產(chǎn)的發(fā)展[3-6]。

微衛(wèi)星(Microsatellite)，亦稱簡(jiǎn)單序列重復(fù)(Simple sequence repeat，SSR)、短串聯(lián)重復(fù)(Short tandem repeat，STR)，是指以1～6個(gè)堿基為重復(fù)核心的串聯(lián)重復(fù)DNA序列，分布于生物體的整個(gè)基因組[7-8]。作為迅速發(fā)展的DNA分子標(biāo)記技術(shù)之一，微衛(wèi)星具有數(shù)量多、多態(tài)性豐富、重復(fù)性好、易操作、呈共顯性遺傳、在真核生物基因組中分布的隨機(jī)性等特點(diǎn)，故其已被廣泛應(yīng)用于對(duì)蝦群體遺傳學(xué)方面的研究[9-13]。

廈門對(duì)蝦種苗產(chǎn)業(yè)鏈因獨(dú)特的地理位置、便捷的交通、對(duì)臺(tái)合作的先天優(yōu)勢(shì)而聚集了技術(shù)、資金和市場(chǎng)等要素。據(jù)數(shù)據(jù)資料顯示，2014年廈門海洋經(jīng)濟(jì)占據(jù)了全市GDP總值的1/8，總產(chǎn)值2045.9億元，同比增長(zhǎng)10.2%，其中，廈門市對(duì)蝦種苗產(chǎn)業(yè)在廈門乃至福建省的海洋產(chǎn)業(yè)中占據(jù)重要的地位，特別是廈門市凡納濱對(duì)蝦種苗產(chǎn)業(yè)。作為我國(guó)蝦苗的集約地，廈門市翔安區(qū)擁有數(shù)百個(gè)對(duì)蝦種苗場(chǎng)，出產(chǎn)著全國(guó)近40%的蝦苗，也曾一度占據(jù)我國(guó)對(duì)蝦年育苗量的60%以上，至今依然在全國(guó)對(duì)蝦產(chǎn)業(yè)鏈的種苗環(huán)節(jié)中占據(jù)著不可替代的重要地位。

然而，隨著對(duì)蝦市場(chǎng)需求量的增大，種苗培育技術(shù)也隨之變化。一方面，高溫、高密度、高抗生素的“三高”養(yǎng)殖模式成為普遍形式，這就導(dǎo)致蝦苗繁育過(guò)程中經(jīng)常出現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)不均衡、養(yǎng)殖環(huán)境惡化、病害暴發(fā)頻繁等問(wèn)題；另一方面，在集約化苗種培育技術(shù)已達(dá)峰值的背景下，有些育苗場(chǎng)為了進(jìn)一步降低成本，對(duì)種蝦不經(jīng)選育，長(zhǎng)期近交。近交衰退的潛在風(fēng)險(xiǎn)導(dǎo)致蝦苗出現(xiàn)生長(zhǎng)緩慢、參差不齊、抵抗力差等現(xiàn)象，直接影響了種苗質(zhì)量和健康。為了解析廈門市凡納濱對(duì)蝦“土苗”(大多經(jīng)養(yǎng)殖的商品成蝦、經(jīng)篩選以備作親本所產(chǎn)生的子一代苗種)親蝦群體的遺傳背景，了解“土苗”種質(zhì)資源現(xiàn)狀，明確近交程度，本研究運(yùn)用微衛(wèi)星技術(shù)，選用8對(duì)多態(tài)性較好的微衛(wèi)星引物，分別對(duì)從廈門市5個(gè)對(duì)蝦育苗場(chǎng)選取5個(gè)來(lái)源的凡納濱對(duì)蝦“土苗”親蝦群體的遺傳多樣性進(jìn)行分析比較，從分子水平上了解其遺傳背景，為該地區(qū)凡納濱對(duì)蝦種質(zhì)資源的提純、保優(yōu)、復(fù)壯及遺傳選育提供背景資料和建議。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究考察了廈門市凡納濱對(duì)蝦傳統(tǒng)育苗模式下的親本來(lái)源，所選定的5個(gè)凡納濱對(duì)蝦的親本分別來(lái)自于詔安、海南、漳浦、東山等地的對(duì)蝦養(yǎng)殖池。由于這些傳統(tǒng)育苗場(chǎng)沒(méi)有規(guī)范的苗種生產(chǎn)記錄，也無(wú)明晰的選育技術(shù)路線，親本來(lái)源普遍存在種源不明、種質(zhì)混雜等情況，本文通過(guò)調(diào)查走訪了解到育苗場(chǎng)親蝦的采集地、親本來(lái)源等信息(表1)。5個(gè)凡納濱對(duì)蝦親蝦群體樣品分別于2016年11月—2017年3月期間采自福建廈門翔安區(qū)不同育苗場(chǎng)，每個(gè)群體30尾[體重(122.05±13.70)mm、體長(zhǎng)(21.8±8.62)g]，編號(hào)ZhaoAn1、HaiNan、ZhaoAn2、ZhangPu、DongShan(ZA1、HN、ZA2、ZP、DS)。樣品運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室后，用剪刀取對(duì)蝦背部肌肉置于無(wú)水乙醇中，-20℃保存待用。

表1 凡納濱對(duì)蝦親蝦采集地及親本來(lái)源

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA的提取

實(shí)驗(yàn)采用異硫氰酸胍法提取凡納濱對(duì)蝦基因組DNA[14]，使用1%的瓊脂糖凝膠電泳與Q5000超微量紫外分光光度計(jì)(美國(guó)Quawell)進(jìn)行基因組DNA質(zhì)量及濃度的檢測(cè)。

1.2.2 微衛(wèi)星引物篩選

選用8對(duì)多態(tài)性較高、特異性強(qiáng)且重復(fù)性好的微衛(wèi)星引物[15-16](表2)進(jìn)行等位基因的擴(kuò)增，在引物5’末端設(shè)計(jì)添加不同類型的特異性熒光標(biāo)記(FAM或ROX)，熒光標(biāo)記引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

表2 凡納濱對(duì)蝦8對(duì)微衛(wèi)星引物信息

1.2.3 PCR反應(yīng)體系

PCR反應(yīng)體系包括：10×PCR緩沖液2.5 μL、dNTPs(2.5 μM)1.6 μL、正向引物(10 μM)0.5 μL、反向引物(10 μM)0.5 μL、模板DNA(100～120 ng/μL)1 μL、TaqDNA聚合酶(5 U/μL)0.3 μL、滅菌的去離子水(ddH2O)18.6 μL。反應(yīng)條件：94℃ 4 min，94℃ 30 s，(57±6)℃ 30 s，72℃ 45 s，循環(huán) 30次，72℃ 10 min，16℃ 90 min。使用1.0%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，將片段大小與預(yù)測(cè)相一致的PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行簡(jiǎn)單重復(fù)序列(SSR)分型分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、觀測(cè)雜合度(Ho)、期望雜合度(He)由PopGene3.2軟件計(jì)算完成。根據(jù)等位基因的頻率，運(yùn)用PIC_CALC0.6軟件計(jì)算各群體各位點(diǎn)的多態(tài)信息含量(PIC)。利用Arlequin3.5進(jìn)行近交系數(shù)(Fis)、Harde-Weinberg(H-W)平衡檢驗(yàn)(P值)、分子變異分析(AMOVA)、遺傳分化指數(shù)(Fst)以及基于Fst的Slatkin’s遺傳距離的計(jì)算。運(yùn)用MEGA4.0軟件，根據(jù)5個(gè)凡納濱對(duì)蝦群體間的遺傳距離，構(gòu)建UPGMA聚類圖。

2 結(jié)果

2.1 群體遺傳多樣性分析

本實(shí)驗(yàn)中所用的8對(duì)微衛(wèi)星引物在5個(gè)凡納濱對(duì)蝦親蝦群體中共檢測(cè)到75個(gè)等位基因，8個(gè)位點(diǎn)平均等位基因數(shù)(Na)為9.375，其中，位點(diǎn)TUMXLv7.56最多，共有25個(gè)，TUMXLv8.176最少，僅有3個(gè)(表3)；5個(gè)群體在8個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)上的平均等位基因數(shù)(Na)為3.875～7.000，其中ZA1群體最低(3.875)，HN群體和ZP群體最高(7.000)；平均有效等位基因數(shù)(Ne)為2.632～3.719，其中ZA1群體最低(2.632)，HN群體最高(3.719)(表4)。

在5個(gè)群體中，8個(gè)位點(diǎn)的PIC值在0.450～0.918之間，平均PIC值為0.639，其中最高為TUMXLv7.56(0.918)，最低為TUMXLv8.176(0.450)(表3)；在5個(gè)群體中，各群體的平均PIC值范圍在0.498～0.624，其中ZA2群體最高(0.624)，ZA1群體最低(0.498)；除位點(diǎn)TUMXLv10.312在DS群體中的PIC值低于0.250，其余位點(diǎn)的PIC值均大于0.250(0.280～0.913)(表4)。

5個(gè)群體的平均觀測(cè)雜合度(Ho)為0.410～0.562，其中ZA1群體最低(0.410)，ZA2群體最高(0.562)；平均期望雜合度(He)為0.589～0.687，其中DS群體最低(0.589)，ZA2群體最高(0.687)(表4)。平均觀測(cè)雜合度均比平均期望雜合度要小，表明各群體中普遍存在著雜合子缺失的情況。各群體的平均近交系數(shù)(Fis)均為正值(0.147～0.305)(表4)，且除位點(diǎn)TUMXLv10.255外，其余7個(gè)位點(diǎn)平均近交系數(shù)(Fis)均為正值(表3)，說(shuō)明5個(gè)凡納濱對(duì)蝦群體近交程度較高，雜合子缺失較為嚴(yán)重。

通過(guò)對(duì)5個(gè)群體8個(gè)位點(diǎn)上的H-W平衡遺傳檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)40個(gè)數(shù)據(jù)(5個(gè)群體×8個(gè)位點(diǎn))中只有14個(gè)符合H-W平衡(P>0.05)，有26個(gè)位點(diǎn)由于不同程度的雜合子缺失(Fis>0)導(dǎo)致不符合H-W平衡(P<0.05)；在5個(gè)群體中，除ZP、DS群體外，群體ZA1、HN、ZA2在多個(gè)位點(diǎn)上都顯著偏離H-W平衡(P<0.05)(表4)。

表3 8對(duì)微衛(wèi)星位點(diǎn)在5個(gè)凡納濱對(duì)蝦親本群體上的遺傳特性

表4 5個(gè)凡納濱對(duì)蝦親本群體在8對(duì)微衛(wèi)星位點(diǎn)上的遺傳特性

續(xù)表4

續(xù)表4

注：*為顯著偏離H-W平衡，P<0.05；**為極顯著偏離H-W平衡，P<0.01。

Notes：*was significant deviation from H-W balance，P<0.05；**was significantly deviated from H-W balance，P<0.01.

2.2 群體遺傳變異與聚類分析

對(duì)5個(gè)凡納濱對(duì)蝦群體間遺傳分化水平進(jìn)行檢測(cè)，各群體間的遺傳分化指數(shù)(Fst)在0.028～0.199之間(表5)。分析表明，ZA2群體和ZP群體間的Fst最小(0.028)，群體遺傳分化最弱；ZA1群體和DS群體間的Fst最大(0.199)，遺傳分化最顯著；除ZA2群體與ZP群體，HN群體與ZA2群體屬于輕度遺傳分化(0

表5 5個(gè)凡納濱對(duì)蝦親本群體間的遺傳分化指數(shù)Fst

對(duì)5個(gè)凡納濱對(duì)蝦親蝦群體的AMOVA分析顯示，只有10.65%的遺傳變異來(lái)自于群體間，而89.35%的遺傳變異來(lái)自于群體內(nèi)，表明群體內(nèi)的遺傳變異貢獻(xiàn)率要明顯大于群體間(表6)。

表6 5個(gè)凡納濱對(duì)蝦親本群體分子變異(AMOVA)分析

基于群體間遺傳分化指數(shù)計(jì)算5個(gè)凡納濱對(duì)蝦親蝦群體間的Slatkin’s遺傳距離(表7)，結(jié)果顯示各群體間的遺傳距離在0.029～0.249之間，其中，ZA2群體和ZP群體的遺傳距離最小(0.029)，ZA1群體和DS群體間的遺傳距離最大(0.249)。根據(jù)遺傳距離進(jìn)行的UPGMA聚類分析結(jié)果表明(圖1)，DS群體與其余4個(gè)群體親緣關(guān)系均較遠(yuǎn)，ZA2群體與ZP群體親緣關(guān)系最近，它們首先聚為一支，接著分別再與HN群體、ZA1群體、DS群體聚為一支。

表7 5個(gè)凡納濱對(duì)蝦親本群體Slatkin’s遺傳距離

3 討論

3.1 凡納濱對(duì)蝦群體的遺傳多樣性

多態(tài)信息含量(PIC)是表示微衛(wèi)星DNA變異程度高低的一個(gè)指標(biāo)。根據(jù)Botstein等[17]首先提出的PIC劃分規(guī)則，本實(shí)驗(yàn)中五個(gè)群體的平均PIC在0.498～0.624之間，除了位點(diǎn)TUMXLv10.312在DS群體上表現(xiàn)出低度多態(tài)性(PIC<0.25)，其余位點(diǎn)均屬中度或高度多態(tài)性(PIC>0.25)，所以僅從PIC值來(lái)看，這五個(gè)群體的遺傳多樣性較高。根據(jù)Barker[18]的報(bào)道，微衛(wèi)星位點(diǎn)含有4個(gè)或4個(gè)以上的等位基因?qū)τ谖锓N的遺傳進(jìn)化具有一定程度的貢獻(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)中8個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)上的等位基因數(shù)在3～25個(gè)，與Tassanakajon等[19]結(jié)果相似。其中有7個(gè)位點(diǎn)的等位基因數(shù)為4個(gè)或4個(gè)以上，表明用這幾個(gè)位點(diǎn)對(duì)凡納濱對(duì)蝦進(jìn)行微衛(wèi)星標(biāo)記遺傳多樣性分析效果較好。但各位點(diǎn)有效等位基因數(shù)在2.034～13.010之間，除位點(diǎn)TUMXLv7.56有效等位基因數(shù)最高外(13.010)，其余位點(diǎn)有效等位基因數(shù)均小于5，可能是由于部分位點(diǎn)存在較多的無(wú)效等位基因從而高估了PIC值，造成群體遺傳多樣性水平虛高。

H-W平衡檢驗(yàn)結(jié)果表明，除了ZP群體與DS群體有5個(gè)位點(diǎn)符合H-W遺傳平衡外，其余幾個(gè)群體都有至少6個(gè)位點(diǎn)顯著偏離平衡(P<0.05)，在總共40個(gè)數(shù)據(jù)中(5個(gè)群體×8個(gè)位點(diǎn))，共有26個(gè)偏離了H-W遺傳平衡，說(shuō)明絕大部分群體都存在著不同程度雜合子缺失的情況。可能是由于無(wú)效等位基因的存在[20]以及凡納濱對(duì)蝦親本選擇過(guò)于盲目，并且后代長(zhǎng)期近交，從而導(dǎo)致個(gè)體間近親交配率逐漸提高，造成群體雜合子缺失嚴(yán)重，群體遺傳結(jié)構(gòu)已經(jīng)較為脆弱。

統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，5個(gè)凡納濱對(duì)蝦群體的平均Ho和平均He分別在0.410～0.562和0.589～0.687之間，ZA1群體在TUMXLv7.97位點(diǎn)上的Ho為0，表明ZA1群體在該位點(diǎn)上的等位基因幾乎都為純合子，且除位點(diǎn)TUMXLv10.255外，其余位點(diǎn)觀測(cè)雜合度均小于期望雜合度，表明這5個(gè)群體普遍存在著雜合子缺失的現(xiàn)象，這與Jimenez等[21]關(guān)于太平洋凡納濱對(duì)蝦群體遺傳結(jié)構(gòu)的研究結(jié)果一致，雜合子缺失現(xiàn)象在Xu等[22]與Supungul等[23]對(duì)斑節(jié)對(duì)蝦(Penaeusmonodon)的研究中也有發(fā)現(xiàn)。楊銳等[24]研究發(fā)現(xiàn)，雜合子缺失將導(dǎo)致純合子增加，提高有害等位基因純合的幾率，近交衰退幾率升高，從而降低物種對(duì)環(huán)境變化的適應(yīng)性。本研究結(jié)果顯示，除位點(diǎn)TUMXLv10.255(Fis=-0.497)外，其余位點(diǎn)的平均Fis均為正值，這與童馨等[25]所研究的凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖群體(-0.166

3.2 凡納濱對(duì)蝦群體間的遺傳差異

遺傳分化指數(shù)(Fst)是衡量群體間遺傳分化程度的重要指標(biāo)，其劃分規(guī)則為0～0.05表示群體間分化較弱，0.05～0.15表示分化中等，0.15～0.25表示分化大，大于0.25表示分化極大[28]。本實(shí)驗(yàn)中5個(gè)凡納濱對(duì)蝦群體間的遺傳分化指數(shù)(Fst)在0.028～0.199之間。分析結(jié)果表明，除了HN群體與ZA2群體(Fst=0.047)、ZA2群體與ZP群體(Fst=0.028)間的遺傳分化較弱(0

群體間的遺傳關(guān)系一般以基于通過(guò)等位基因頻率計(jì)算而得的遺傳距離來(lái)體現(xiàn)。Crawford等[29]認(rèn)為由微衛(wèi)星計(jì)算得出的遺傳距離更能反映種群分化時(shí)間的長(zhǎng)短，能客觀地反映群體間的遺傳和分化。分析本研究中基于Fst的各群體間Slatkin’s遺傳距離，結(jié)果顯示，各群體間的遺傳距離在0.029～0.249之間，表明5個(gè)群體之間的遺傳差異較小。這提示在凡納濱對(duì)蝦苗種培育中，親本的選擇需要考慮遺傳距離這一指標(biāo)，它反映的是不同品種進(jìn)化上的關(guān)系；選擇遺傳距離大且性狀良好的群體進(jìn)行雜交育種，發(fā)揮雜種優(yōu)勢(shì)，有利于種質(zhì)的提高以及后代各種優(yōu)良性狀的產(chǎn)生與新品種的培育[30]，進(jìn)而推動(dòng)凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

4 結(jié)論

由于市場(chǎng)需求增大而導(dǎo)致的苗種培育方式的改變以及苗種培育企業(yè)普遍缺少對(duì)蝦育種技術(shù)的專業(yè)指導(dǎo)，使得廈門市凡納濱對(duì)蝦親蝦群體近親交配嚴(yán)重，近交衰退現(xiàn)象明顯。經(jīng)過(guò)多代的近親交配后，有害等位基因純合比例不斷升高，加上養(yǎng)殖過(guò)程中大量抗生素的使用，使得蝦苗普遍較為脆弱，造成對(duì)蝦種苗品質(zhì)下降，嚴(yán)重阻礙了凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。同時(shí)，由于我國(guó)的優(yōu)良親蝦基本被國(guó)外進(jìn)口的種蝦壟斷，導(dǎo)致廈門市龐大的對(duì)蝦種苗產(chǎn)業(yè)鏈因缺少穩(wěn)定的種源供應(yīng)造成無(wú)序發(fā)展亂象，而且種源混雜現(xiàn)象十分突出，國(guó)內(nèi)外的種質(zhì)、一代二代的蝦苗、優(yōu)劣種齊聚廈門，良莠不齊、摻假現(xiàn)象也時(shí)有發(fā)生。因此在生產(chǎn)中應(yīng)明確對(duì)蝦種質(zhì)來(lái)源，科學(xué)規(guī)范苗種培育流程，國(guó)內(nèi)各苗種培育企業(yè)和相關(guān)科研單位可進(jìn)行聯(lián)合雜交育種，選用性狀良好的親本個(gè)體，利用雜交優(yōu)勢(shì)，改善后代的遺傳多樣性水平，提高后代優(yōu)良經(jīng)濟(jì)性狀的比例，這對(duì)于廈門市對(duì)蝦新品種的培育乃至國(guó)內(nèi)凡納濱對(duì)蝦種苗產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要意義。