許雅楠，呂 峰，李燕妹

(福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002)

隨著對多糖構(gòu)-效關(guān)系研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)對天然多糖進(jìn)行分子修飾及結(jié)構(gòu)改造有助于改善其生物活性[1]。針對多糖分子的修飾主要采用包括基團(tuán)修飾(硫酸化、甲基化)、部分降解修飾等方法。天然多糖的分子量大小與其生物活性密切相關(guān)。通常，一定程度地降低多糖分子量可提高其生物活性及利用率[2-3]，并可滿足醫(yī)藥[4]、食品[5]等領(lǐng)域的應(yīng)用要求；但當(dāng)多糖分子量過低時，其活性聚合結(jié)構(gòu)無法形成[6]，生物活性反而下降[7-8]。因此本研究選擇50%為目標(biāo)降解率，既保證天然多糖分子量有效降低，又避免無價值小分子糖的大量生成。

本研究采用稀硫酸降解法，對石莼多糖進(jìn)行部分降解，以50%為目標(biāo)降解率，分別探討了硫酸溶液濃度、降解溫度、多糖濃度與降解時間對石莼多糖降解率的影響，并采用三因素三水平響應(yīng)面分析法對石莼多糖部分降解工藝進(jìn)行優(yōu)化，以期為天然石莼多糖綜合開發(fā)與深加工利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 石莼多糖制備材料與試劑

稱取一定質(zhì)量石莼干粉，加入30倍質(zhì)量蒸餾水，調(diào)節(jié)溶液pH值為4.8；按400 U/g石莼干粉添加經(jīng)活化的纖維素酶，于45℃下恒溫提取90 min，滅酶、離心，收集上清液，真空濃縮；加入4倍體積的95%乙醇，冷藏過夜，離心、收集乙醇沉淀物，加水復(fù)溶，真空濃縮，冷凍干燥，得石莼多糖粗品(多糖含量為35.62%)。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1800PC型紫外分光光度計：上海美譜達(dá)儀器有限公司；RE52-99型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；SHB-III型真空泵：鄭州長城科工貿(mào)有限公司；DL-5-B離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；JB-90-2磁力攪拌器：上海天平儀器廠。

1.3 試驗內(nèi)容與方法

1.3.1 石莼多糖部分降解工藝流程

稱取石莼多糖，加入預(yù)熱的稀硫酸溶液，恒溫酸解，冰浴冷卻，4 000 rpm離心5 min，取上清液，調(diào)pH至中性，定容，測定其總糖、還原糖含量，樣液于500 Da透析袋中流水透析48.0 h， 真空濃縮(0.95 MPa，45℃)使其體積約為原體積的5%，最后冷凍干燥，收集降解樣品。

1.3.2 評價指標(biāo)

張競男[9]論證了以“還原糖的相對含量”作為多糖降解程度考察指標(biāo)的可行性，故本試驗采用還原糖相對含量(記為降解率)為衡量指標(biāo)，計算方法如公式(1)。

(1)

式中，A：待測樣液的總糖含量；A0：待測樣液的還原糖初始含量；A1：待測樣液降解后的還原糖含量。

還原糖含量采用DNS(3，5-二硝基水楊酸)法測定；總糖含量采用硫酸-苯酚法測定。

1.3.3 單因素試驗設(shè)計

以硫酸溶液濃度(0.05、0.10、0.30、0.50、0.70 mol/L)、降解溫度(60、70、80、90、100℃)、多糖濃度(1、5、10、15、20 mg/mL)、降解時間(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h)4個因素進(jìn)行單因素試驗，研究各因素對石莼多糖降解效果的影響。

1.3.4 響應(yīng)面試驗設(shè)計

在單因素試驗基礎(chǔ)上，以硫酸溶液濃度(X1)、降解溫度(X2)、多糖濃度(X3)為自變量，石莼多糖降解率(Y1)為響應(yīng)值，采用三因素三水平響應(yīng)面分析法，對石莼多糖樣品的部分降解關(guān)鍵工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，試驗因素與水平表如表1。

表1 Design Expert試驗因素與水平表

1.3.5 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用DPS v7.05進(jìn)行方差分析，各數(shù)據(jù)間多重比較采用Duncan新復(fù)極差法，Microsoft Excel 2007軟件繪圖。顯著性界值以P>0.05為不顯著，P<0.05為顯著，P<0.01為極顯著。采用Design Expert v 8.0對優(yōu)化試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行響應(yīng)面分析，并對各因素回歸擬合。

2 結(jié)果與分析

2.1 硫酸溶液濃度對石莼多糖降解率的影響

在酸性條件下，H+與多糖分子上O原子的結(jié)合，使多糖的分子鏈變得極不穩(wěn)定，導(dǎo)致糖苷鍵斷裂，從而達(dá)到降解多糖的效果[10]。如圖1所示，在本研究所設(shè)的硫酸溶液濃度范圍內(nèi)，石莼多糖樣品的降解率均隨硫酸溶液濃度的增大而極顯著(P<0.01)提高。當(dāng)硫酸溶液濃度為0.3～0.5 mol/L時，石莼多糖的降解率范圍為(44.61±0.17)%～(57.87±0.78)%。故本研究選擇0.3～0.5 mol/L為石莼多糖部分降解的適宜硫酸溶液濃度范圍。

2.2 降解溫度對石莼多糖降解率的影響

溫度的升高加快了反應(yīng)體系中分子的運動，反應(yīng)活化能降低，反應(yīng)更易發(fā)生[11]。如圖2所示，在本研究所設(shè)的降解溫度范圍內(nèi)，石莼多糖的降解率隨降解溫度的升高而極顯著(P<0.01)提高。當(dāng)降解溫度為90～100℃時，石莼多糖的降解率范圍為(45.33±0.30)%～(61.97±0.06)%。故本研究選擇90～100℃為石莼多糖樣品部分降解的適宜降解溫度范圍。

2.3 多糖濃度對石莼多糖降解率的影響

如圖3所示，在本研究的多糖濃度范圍內(nèi)，石莼多糖降解率隨多糖濃度的增大而呈先上升后下降趨勢。多糖濃度在5 mg/mL范圍內(nèi)，石莼多糖的降解率隨多糖濃度的增大而極顯著(P<0.01)提高；當(dāng)多糖濃度為5 mg/mL時，其降解率達(dá)到最大值，為(48.02±0.76)%；而多糖濃度超過5 mg/mL后，其降解率顯著(P<0.05)下降。這是因為當(dāng)酸溶液濃度一定且多糖濃度比較低時，多糖分子不足，其O原子未能與H+充分反應(yīng)，此時降解率與多糖濃度呈正相關(guān)關(guān)系；但當(dāng)多糖濃度超過一定水平后，體系黏度提高、分子流動性下降，反而阻礙多糖分子中O原子與H+反應(yīng)，故其降解率反而下降。故本研究選擇5 mg/mL為石莼多糖部分降解的適宜溶液多糖濃度。

2.4 降解時間對石莼多糖降解率的影響

如圖4所示，在降解時間2.0 h內(nèi)，石莼多糖的降解率隨降解時間的延長而極顯著(P<0.01)提高；在超過2.0 h后，其降解率上升趨勢減緩，但仍顯著(P<0.05)提高。這是因為降解反應(yīng)初期，降解時間的延長使反應(yīng)充分，多糖降解率也隨之增大，但由于酸溶液會優(yōu)先降解表面結(jié)構(gòu)上容易水解的糖苷糖，如支鏈糖苷鍵、α-糖苷鍵、呋喃糖的糖苷鍵等[12]，而被包埋在多糖分子內(nèi)部的糖苷糖[13]不易水解，從而導(dǎo)致在降解一定時間后，多糖的降解率增加幅度變小。降解時間在1.0～1.5 h范圍內(nèi)，石莼多糖的降解率范圍為(46.85±0.98)%～(56.35±1.20)%，故本研究選擇1.0～1.5 h為石莼多糖部分降解的適宜降解時間。

2.5 石莼多糖部分降解關(guān)鍵工藝優(yōu)化

2.5.1 方程回歸及方差分析

采用Design Expert.v 8.0數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對表2的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，分別建立石莼多糖降解率(Y1)與硫酸溶液濃度(X1)、降解溫度(X2)、多糖濃度(X3)的數(shù)學(xué)回歸方程，刪除方程中P>0.05的不顯著系數(shù)項，得到簡化的數(shù)學(xué)回歸方程式(2)：

式中自變量取各代碼值，因變量取計算值，由回歸方程(2)可分別計算出石莼多糖降解率(Y1)值。表3回歸方程的方差分析數(shù)據(jù)顯示，方程回歸極顯著(P<0.01)，失擬項不顯著(P>0.05)，相關(guān)系數(shù)R2大于0.990 0，表明回歸方程有意義且擬合度良好。數(shù)據(jù)還顯示，X1X2(硫酸溶液濃度與降解溫度)、X1X3(硫酸溶液濃度與多糖濃度)、X2X3(降解溫度與多糖濃度)的交互作用均極顯著(P<0.01)影響石莼多糖降解率(Y1)。

表3 方差分析表

注：*、**分別表示在α為0.05、0.01水平顯著。

Notes：*was significant difference，**was extremely significant difference.

2.5.2 因素間的交互效應(yīng)分析

根據(jù)回歸方程(2)，分別得到硫酸溶液濃度(X1)、降解溫度(X2)、多糖濃度(X3)對石莼多糖降解率(Y1)影響的響應(yīng)面圖和等高線圖，如圖5～7所示。

由圖5可知，當(dāng)降解液的多糖濃度(X3)固定于0水平(5 mg/mL)時，在本試驗范圍內(nèi)，X1X2(硫酸溶液濃度與降解溫度)的交互作用與石莼多糖降解率(Y1)呈顯著(P<0.05)正相關(guān)關(guān)系；當(dāng)硫酸溶液濃度(X1)與降解溫度(X2)均為1.0水平(0.50 mol/L、100℃)時，石莼多糖降解率(Y1)達(dá)到最大值。

由單因素試驗2.1、2.2結(jié)果分析可知，硫酸溶液濃度的提高可促進(jìn)H+與多糖分子上O原子結(jié)合，從而促進(jìn)多糖的降解，與此同時，溫度的升高增大了酸解液體系中的分子動能，H+與多糖分子碰撞機(jī)率增大，因此當(dāng)硫酸溶液濃度與降解溫度均提高時，二者的協(xié)同作用使石莼多糖降解率顯著提高。

由圖6可知，當(dāng)降解溫度(X2)固定于0水平(90℃)時，硫酸溶液濃度(X1)在1.0水平(0.50 mol/L)、多糖濃度(X3)在0水平(5 mg/mL)范圍內(nèi)，二者的交互作用與石莼多糖粗品的降解率(Y1)呈顯著(P<0.05)正相關(guān)關(guān)系；當(dāng)硫酸溶液濃度(X1)在1.0水平(0.50 mol/L)、多糖濃度(X3)在0水平(5 mg/mL)時，石莼多糖粗品降解率(Y1)達(dá)到最大值；而當(dāng)硫酸溶液濃度(X1)大于1.0水平(0.50 mol/L)、多糖濃度(X3)大于0水平(5 mg/mL)后，二者的交互作用與石莼多糖粗品降解率(Y1)呈顯著(P<0.05)負(fù)相關(guān)關(guān)系。

由單因素試驗2.1、2.3結(jié)果分析可知，硫酸溶液濃度與多糖濃度的適當(dāng)提高均可促進(jìn)H+與多糖分子上O原子結(jié)合，從而促進(jìn)多糖的降解，二者協(xié)同作用使石莼多糖粗品降解率顯著提高；而當(dāng)多糖濃度過高時，酸解液體系黏度增大、分子流動性下降，H+與多糖分子上O原子結(jié)合受阻，故二者的交互作用與石莼多糖粗品降解率呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。

由圖7可知，當(dāng)硫酸溶液濃度(X1)固定于0水平(0.40 mol/L)時，降解溫度(X2)在1.0水平(100℃)、多糖濃度(X3)在0水平(5 mg/mL)范圍內(nèi)，二者的交互作用與石莼多糖粗品的降解率(Y1)呈極顯著(P<0.01)正相關(guān)關(guān)系；當(dāng)降解溫度(X2)與多糖濃度(X3)分別為1.0、0水平(100℃、5 mg/mL)時，石莼多糖粗品降解率(Y1)達(dá)到最大值；而當(dāng)降解溫度(X2)大于1.0水平(100℃)、多糖濃度(X3)大于0水平(5 mg/mL)后，X2X3交互作用與石莼多糖粗品降解率(Y1)呈極顯著(P<0.01)負(fù)相關(guān)關(guān)系。

由單因素2.2、2.3的結(jié)果分析可知，降解溫度的升高增大了酸解液體系中的分子動能，H+與多糖分子碰撞機(jī)率增大，促進(jìn)降解，與此同時，多糖濃度的適當(dāng)提高亦可促進(jìn)H+與多糖分子接觸，因此在一定范圍內(nèi)，降解溫度與多糖濃度均提高時，二者協(xié)同作用使石莼多糖粗品降解率顯著提高；而當(dāng)多糖濃度過高時，酸解液體系的黏度顯著增大，體系中分子流動性下降，H+與多糖分子結(jié)合受阻，該現(xiàn)象產(chǎn)生的結(jié)果超過溫度提高導(dǎo)致的分子動能增加，因此當(dāng)降解溫度與多糖濃度均過高時，二者的交互作用與石莼多糖粗品降解率呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。

2.5.3 工藝參數(shù)優(yōu)化及驗證試驗

采用Design Expert.v 8.0軟件求解回歸方程(2)，計算求得石莼多糖降解率(Y1)符合(50±1)%的優(yōu)化工藝條件組合共42組，表4中分別體現(xiàn)了其部分工藝條件組合及其對應(yīng)石莼多糖降解率的預(yù)測值。綜合考慮透析周期、生產(chǎn)成本、節(jié)能與環(huán)保問題，并基于實際操作的便利性進(jìn)行校正，確定石莼多糖部分降解的最優(yōu)工藝條件組合為硫酸溶液濃度0.30 mol/L、降解溫度95℃、多糖濃度7 mg/mL。為驗證試驗結(jié)果的客觀性，根據(jù)修正條件進(jìn)行擴(kuò)大性驗證試驗，降解時間均為1.0 h，試驗平行重復(fù)3次，測得石莼多糖的降解率平均值為50.94%，與其對應(yīng)理論預(yù)測值50.45%無顯著性差異(P>0.05)。

表4 最優(yōu)工藝條件組合及降解率預(yù)測值

3 小結(jié)

本研究采用稀硫酸降解法，對石莼多糖進(jìn)行部分降解，以50%為目標(biāo)降解率，分別探討了主要工藝因素對石莼多糖降解率的影響，并采用三因素三水平響應(yīng)分析法對石莼多糖部分降解關(guān)鍵工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。試驗結(jié)果表明：校正后，石莼多糖部分降解的最優(yōu)工藝條件組合為硫酸溶液濃度0.30 mol/L、降解溫度95℃、多糖濃度7 mg/mL，在結(jié)合降解時間1.0 h的條件下，石莼多糖的平均降解率為50.94%。

綜上所述，采用稀硫酸溶液對石莼多糖進(jìn)行部分降解，結(jié)果穩(wěn)定、周期短、工藝簡單、易實現(xiàn)工業(yè)化，具有可行性。