黃碧瑩，劉潔，鐘鳴，，王珺婷，王小玢，康媛媛，孫妍，喬雪

（中國醫(yī)科大學(xué) 1. 附屬口腔醫(yī)院病理科，沈陽 110002； 2. 科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，沈陽 110122； 3. 附屬口腔醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，沈陽 110002）

成釉細(xì)胞瘤是牙源性腫瘤中最常見的上皮源性腫瘤，其術(shù)后易復(fù)發(fā)且具有局部侵襲性生長的生物學(xué)特性。成釉細(xì)胞瘤的病因及局部侵襲性表現(xiàn)的分子生物學(xué)機(jī)制尚不明確，目前的主要治療方法為手術(shù)切除，但術(shù)后易復(fù)發(fā)，且有惡變的可能，為治療帶來難度，并嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量［1］。因此，深入研究該腫瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，探索新的早期診斷和治療方法具有重要意義。

細(xì)胞自噬是真核細(xì)胞處理自身產(chǎn)生的衰老、損傷或變性的蛋白及細(xì)胞器等生物大分子的一種現(xiàn)象，能使這些來源于細(xì)胞自身的成分在溶酶體內(nèi)降解或再利用，這一過程的目的不僅僅是清除細(xì)胞自身產(chǎn)生的廢物，更是作為一種動(dòng)態(tài)循環(huán)系統(tǒng)，為細(xì)胞更新修復(fù)和維持動(dòng)態(tài)平衡提供能量［2］。在自噬體形成過程中，微管相關(guān)蛋白1輕鏈3 （microtubule-assaiated protein 1 light chain 3，LC3） 分子由水溶形式的LC3-Ⅰ轉(zhuǎn)化為脂溶形式的LC3-Ⅱ，LC3-Ⅱ可以和新形成的自噬體膜結(jié)合，并且一直結(jié)合到自噬體與溶酶體融合，因而LC3-Ⅱ常被作為細(xì)胞內(nèi)自噬的標(biāo)志物［3-4］，LC3表達(dá)水平可作為檢測腫瘤自噬水平的指標(biāo)。細(xì)胞自噬作為一種細(xì)胞的正常代謝現(xiàn)象在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中可起到抑制或促進(jìn)的雙重作用［5］，而細(xì)胞自噬在成釉細(xì)胞瘤中發(fā)揮的作用尚不明確。本研究旨在通過免疫組織化學(xué)染色方法檢測成釉細(xì)胞瘤及正?？谇火つそM織中LC3表達(dá)水平，分析LC3表達(dá)與患者臨床病理資料間的關(guān)系，研究細(xì)胞自噬在成釉細(xì)胞瘤發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本

收集中國醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院2015年至2016年手術(shù)切除的104例成釉細(xì)胞瘤石蠟標(biāo)本，均經(jīng)病理科確診。其中男60例，女44例，年齡6～88歲，平均36.96歲；原發(fā)病例94例，復(fù)發(fā)10例；實(shí)性型成釉細(xì)胞瘤83例，單囊型成釉細(xì)胞瘤12例，促結(jié)締組織增生型成釉細(xì)胞瘤3例，外周型成釉細(xì)胞瘤6例。選取20例正常口腔黏膜組織標(biāo)本作為對(duì)照，取材于中國醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔外科門診智齒拔除術(shù)帶出的牙周黏膜組織。所有標(biāo)本使用均經(jīng)患者知情同意，本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意。

1.2 主要試劑及方法

1.2.1 主要試劑：一抗為兔抗人LC3多克隆抗體，購自英國Abcam公司，二抗為羊抗兔抗體，購自中國碧云天生物有限公司。SP 超敏試劑盒 （鼠/兔） 及DAB顯色試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.2.2 免疫組織化學(xué)染色：石蠟包埋標(biāo)本常規(guī)4 μm厚切片，采用鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶法（SP三步法） 。常規(guī)脫蠟、水化、檸檬酸鹽高壓抗原修復(fù)，3% H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，一抗4 ℃過夜，LC3抗體工作濃度為1∶ 400，二抗37 ℃孵育30 min，DAB染色，蘇木精復(fù)染。陰性對(duì)照采用 0.01 mol/L PBS代替一抗。

1.2.3 結(jié)果評(píng)判：LC3陽性表達(dá)見于細(xì)胞質(zhì)，為棕黃色顆粒，強(qiáng)陽性時(shí)細(xì)胞間質(zhì)和細(xì)胞核中亦可見表達(dá)。每張切片在200倍下觀察，隨機(jī)選取3個(gè)視野，對(duì)每個(gè)視野均進(jìn)行染色強(qiáng)度評(píng)分與陽性瘤細(xì)胞百分比評(píng)分。胞質(zhì)無著色記0分，淺黃色記1分，棕黃色記2分，棕褐色記3分；陽性瘤細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的0～5%記0分，＞5%～25%記1分，＞25%～50%記2分，＞50%記3分。每張切片最終評(píng)分=染色強(qiáng)度評(píng)分×陽性瘤細(xì)胞百分比評(píng)分，1～3分為陰性 （-） ，4分以上為陽性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)及Fisher確切概率法，P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LC3在成釉細(xì)胞瘤組織和正?？谇火つそM織中的表達(dá)

圖1 LC3在成釉細(xì)胞瘤中陽性表達(dá) SP×200Fig.1 Positive immunohistochemical reactivity for LC3 in ameloblastomas SP×200

LC3主要表達(dá)于成釉細(xì)胞瘤上皮細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)，陽性率高時(shí)細(xì)胞核也有著色 （圖1） ，在正?？谇火つそM織中陰性表達(dá) （圖2） 。104例成釉細(xì)胞瘤組織中LC3表達(dá)陽性率為76.92% （80/104） ，顯著高于正?？谇火つそM織 （10.00%，2/20） ，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P ＜ 0.05） 。

圖2 LC3在正?？谇火つぶ嘘幮员磉_(dá) SP×200Fig.2 Negative immunohistochemical reactivity for LC3 in normal oral mucosal tissues SP×200

2.2 LC3表達(dá)與成釉細(xì)胞瘤臨床病理資料的關(guān)系

成釉細(xì)胞瘤中LC3的表達(dá)在患者年齡、性別及是否復(fù)發(fā)方面的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P ＞ 0.05） ，在病變部位方面，發(fā)生于下頜骨的成釉細(xì)胞瘤中LC3陽性表達(dá)率高于發(fā)生于上頜骨及牙齦的成釉細(xì)胞瘤，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P ＜ 0.05） 。在病理分型方面，實(shí)性多囊型患者的LC3陽性表達(dá)率高于其他分型患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P ＜ 0.05） 。見表1。

3 討論

細(xì)胞自噬是一種細(xì)胞的分解代謝過程。在壓力條件下，如缺氧、生長因子缺乏和代謝壓力等，細(xì)胞通過降解或再利用自身產(chǎn)生的變性蛋白質(zhì)或細(xì)胞器成分而產(chǎn)生能量，以幫助細(xì)胞度過生存危機(jī)，適應(yīng)壓力環(huán)境，可起到阻止細(xì)胞衰老和死亡的作用。越來越多的研究［6］發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞自噬在口腔及全身腫瘤、神經(jīng)退行性疾病、心臟疾病、自身免疫性疾病和感染性疾病等的發(fā)生發(fā)展和治療中都發(fā)揮重要作用。

表1 LC3表達(dá)與患者臨床病理資料的聯(lián)系Tab.1 Association between LC3 expression and clinicopathological characteristics

研究表明，細(xì)胞自噬在牙發(fā)育過程中也發(fā)揮重要作用。YANG等［7］發(fā)現(xiàn)，在小鼠的牙胚發(fā)育過程中，自噬相關(guān)基因Beclin1主要定位于成釉器的細(xì)胞質(zhì)，星網(wǎng)狀層、內(nèi)外釉上皮層的細(xì)胞核中也有Beclin1的表達(dá)，Beclin1可能參與了牙發(fā)育過程中細(xì)胞自噬及凋亡的相互作用，并與牙形態(tài)形成及發(fā)育有關(guān)；還有研究［8］在鼠牙胚發(fā)育的過程中檢測到LC3，提示自噬可能與牙齒發(fā)育期間分化細(xì)胞的細(xì)胞增殖、分化和穩(wěn)態(tài)維持有關(guān)。在牙源性角化囊腫中也檢測到自噬水平增高，且自噬相關(guān)基因Beclin1和細(xì)胞增殖標(biāo)志物Ki-67的表達(dá)呈現(xiàn)明顯的相關(guān)性［9］，這種現(xiàn)象表明自噬可能與細(xì)胞增殖潛能增加有關(guān)，可能與牙源性角化囊性瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的增殖能力以及術(shù)后易復(fù)發(fā)的特點(diǎn)有關(guān)。

成釉細(xì)胞瘤是牙源性腫瘤，與牙的發(fā)育密切相關(guān)，可能起源于發(fā)育中的牙釉質(zhì)器官、牙齒上皮細(xì)胞剩余部分、口腔上皮細(xì)胞的基底細(xì)胞［10］及牙源性囊腫的襯里上皮或被覆黏膜的殘留物［11］。本研究中，LC3在成釉細(xì)胞瘤組織中的陽性表達(dá)率顯著高于正?？谇火つそM織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P ＜ 0.05） ，表明成釉細(xì)胞瘤中的自噬水平高于正常口腔黏膜組織，提示細(xì)胞自噬可能參與牙源性上皮的發(fā)生發(fā)展，對(duì)成釉細(xì)胞瘤的形成有一定影響。

研究［12］表明，細(xì)胞自噬可通過調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞中的活性氧水平起到促進(jìn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移作用，并且腫瘤壞死因子α可以通過抑制自噬來抑制上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。另有研究［13］發(fā)現(xiàn)，間質(zhì)標(biāo)志物波形蛋白在成釉細(xì)胞瘤的上皮細(xì)胞中亦有表達(dá)，且上皮標(biāo)志蛋白上皮鈣黏蛋白在成釉細(xì)胞瘤上皮細(xì)胞中表達(dá)下降，提示成釉細(xì)胞瘤中存在上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化現(xiàn)象，與成釉細(xì)胞瘤的局部侵襲性密切相關(guān)。結(jié)合本研究結(jié)果，成釉細(xì)胞瘤中的自噬現(xiàn)象可能影響上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，對(duì)腫瘤的生物學(xué)行為產(chǎn)生一定影響。

本研究結(jié)果顯示，LC3在發(fā)生于下頜骨的成釉細(xì)胞瘤中的陽性表達(dá)率顯著高于發(fā)生于上頜骨及牙齦的成釉細(xì)胞瘤，但由于成釉細(xì)胞瘤發(fā)生于下頜骨者所占比例顯著高于發(fā)生于上頜骨及牙齦等部位［14］，且目前尚無對(duì)成釉細(xì)胞瘤發(fā)病部位與腫瘤生物學(xué)行為的相關(guān)性報(bào)道，推測可能由于下頜骨與上頜骨相比，血供較為單一，且骨質(zhì)較致密，腫瘤細(xì)胞在下頜骨中的增殖更易發(fā)生缺氧或能量不足，需要細(xì)胞自噬為腫瘤細(xì)胞增殖提供能量。本研究中發(fā)生于上頜骨及牙齦者例數(shù)較少，LC3陽性表達(dá)率在發(fā)病部位上的差異仍需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本研究。由于復(fù)發(fā)例數(shù)較少，在復(fù)發(fā)病例與原發(fā)病例之間，LC3陽性表達(dá)率的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但在實(shí)性/多囊型成釉細(xì)胞瘤中LC3的陽性表達(dá)率顯著高于其他分型，有研究［15］發(fā)現(xiàn)實(shí)性/多囊型成釉細(xì)胞瘤的復(fù)發(fā)率高于其他分型，提示實(shí)性/多囊型成釉細(xì)胞瘤中自噬水平升高可能與腫瘤復(fù)發(fā)有關(guān)。

綜上所述，自噬標(biāo)志蛋白LC3在成釉細(xì)胞瘤中的陽性表達(dá)率高于正?？谇火つそM織，且與病理分型和發(fā)病部位有關(guān)，提示成釉細(xì)胞瘤中存在細(xì)胞自噬現(xiàn)象，自噬現(xiàn)象與成釉細(xì)胞瘤的發(fā)生發(fā)展及其局部侵襲的生物學(xué)特性的關(guān)系有待進(jìn)一步研究。