韋 曉，茅曉東，徐一嬌，陳國芳，劉 超

(南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院內(nèi)分泌科 江蘇省中醫(yī)藥研究院癭病證治重點(diǎn)研究室，南京 210028)

地球上的生命受晝夜交替所造成的明暗循環(huán)支配，包括從原核生物到人類的幾乎所有生物體中，均進(jìn)化出了一套晝夜節(jié)律系統(tǒng)[1]。晝夜節(jié)律調(diào)控了生物體的許多生理活動(dòng)，如體溫、進(jìn)食、睡眠和激素變化等，這些生理變化遵循一個(gè)約24 h的內(nèi)在周期，生物體可以通過晝夜節(jié)律系統(tǒng)更好地適應(yīng)生存環(huán)境[2]。晝夜節(jié)律系統(tǒng)的穩(wěn)定對(duì)健康和壽命非常重要，節(jié)律的紊亂會(huì)導(dǎo)致失眠、抑郁、冠心病、代謝綜合征、神經(jīng)退行性疾病和腫瘤的發(fā)生，這些疾病的發(fā)生發(fā)展誘導(dǎo)了機(jī)體老化，加速了衰老性疾病的進(jìn)程[3]。因此，闡明晝夜節(jié)律的分子機(jī)制，尋找改善節(jié)律紊亂的治療靶點(diǎn)，對(duì)預(yù)防和治療衰老性疾病具有巨大的應(yīng)用價(jià)值。乙酰化和去乙?；{(diào)節(jié)是調(diào)控晝夜節(jié)律的重要分子機(jī)制，而沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silent information regulator 1，SIRT1)是一種去乙?；?，它可以通過去乙?；瘯円构?jié)律相關(guān)蛋白影響晝夜節(jié)律。研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)SIRT1的表達(dá)可以緩解多種衰老性疾病，如心血管疾病、神經(jīng)退行性疾病、代謝性疾病和腫瘤等，SIRT1可能通過調(diào)控晝夜節(jié)律發(fā)揮以上作用[4]?，F(xiàn)就SIRT1調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律的研究進(jìn)展予以綜述。

1 晝夜節(jié)律的生理基礎(chǔ)

哺乳動(dòng)物體內(nèi)控制晝夜節(jié)律的器官為下丘腦的視交叉上核，視交叉上核中約包含15 000個(gè)神經(jīng)元，它們可以感受周圍環(huán)境中的光照變化，通過光照的周期性改變調(diào)節(jié)生物的晝夜節(jié)律性[5]。除光照因素外，視交叉上核還受松果體、下丘腦、血管活性腸肽和激素(皮質(zhì)醇激素和褪黑素等)的影響，這些因素均會(huì)影響生物的晝夜節(jié)律性[6]。晝夜節(jié)律性不只體現(xiàn)在視交叉上核，外周組織也具有自身的晝夜節(jié)律性，如肝臟和白色脂肪組織，晝夜節(jié)律是一個(gè)遍布全身的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)[7]。晝夜節(jié)律的紊亂會(huì)加速衰老，許多衰老性疾病的發(fā)生均與晝夜節(jié)律的紊亂相關(guān)[2]。有觀點(diǎn)認(rèn)為，晝夜節(jié)律失衡是衰老的關(guān)鍵因素[7]。

2 晝夜節(jié)律的分子基礎(chǔ)

在分子水平上，晝夜節(jié)律受到一組節(jié)律相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，這些蛋白影響了10%～15%的基因并以晝夜節(jié)律的方式轉(zhuǎn)錄，節(jié)律相關(guān)蛋白的周期循環(huán)表達(dá)對(duì)晝夜節(jié)律的形成至關(guān)重要[8]。

晝夜節(jié)律運(yùn)動(dòng)輸出周期故障(circadian locomotor output cycles kaput，CLOCK)是晝夜節(jié)律的核心調(diào)控蛋白，它由clock基因編碼，在各個(gè)器官與組織中表達(dá)，人的clock基因位于第4號(hào)染色體長臂(4q12)[9]。CLOCK的C端與組蛋白乙?；妇哂型葱裕艽呋M蛋白H3和腦和肌肉組織芳香烴受體核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的類似蛋白1(brain and muscle ARNT-like protein 1,BMALl)的乙?；?，且BMAL1的乙?；仨氂蠧LOCK存在[10]。CLOCK和BMAL1同屬于堿性螺旋-環(huán)-螺旋家族蛋白，它們具有保守的堿性螺旋-環(huán)-螺旋和周期蛋白-芳香烴受體核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-類泛素蛋白相互作用基序結(jié)構(gòu)域。CLOCK和BMAL1會(huì)形成含有堿性螺旋-環(huán)-螺旋-周期蛋白-芳香烴受體核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-類泛素蛋白相互作用基序結(jié)構(gòu)域的異二聚體復(fù)合物，CLOCK/BMAL1復(fù)合物可以與調(diào)控基因上的E-box元件結(jié)合，激活下游基因的表達(dá)[11]。

除CLOCK和BMAL1外，哺乳動(dòng)物體內(nèi)還發(fā)現(xiàn)多種晝夜節(jié)律相關(guān)蛋白，如周期蛋白、隱花色素和核受體亞家族1D組成員1等[12]。其中，周期蛋白蛋白分為周期蛋白1、周期蛋白2、周期蛋白3三種類型，隱花色素蛋白分為隱花色素1和隱花色素2兩種類型，這些蛋白的周期性變化產(chǎn)生了晝夜節(jié)律性振蕩。

3 晝夜節(jié)律的分子機(jī)制

晝夜節(jié)律相關(guān)基因的表達(dá)受乙?；c去乙?；傅恼{(diào)控，并存在負(fù)反饋環(huán)路調(diào)節(jié)[13]。CLOCK/BMAL1復(fù)合物與待表達(dá)基因上的E-box順式作用元件結(jié)合后，CLOCK發(fā)揮乙?；饔?，乙?；疊MAL1、組蛋白H3和組蛋白H4，啟動(dòng)周期蛋白、隱花色素、核受體亞家族1D組成員1等蛋白的合成，合成后的周期蛋白和隱花色素形成異二聚體，受乙?；疊MAL1的招募轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，反饋性抑制CLOCK/BMAL1復(fù)合物的作用。此時(shí)，去乙?；赴l(fā)揮作用，其將周期蛋白、BMAL1、組蛋白H3和H4的乙?；稽c(diǎn)去乙酰化，從而終止目的基因轉(zhuǎn)錄[14]。同時(shí)，核受體亞家族1D組成員1會(huì)與下游基因的受體酪氨酸激酶樣單受體應(yīng)答元件結(jié)合，抑制基因的轉(zhuǎn)錄。

CLOCK/BMAL1異二聚體調(diào)控鐘控基因的轉(zhuǎn)錄，而鐘控基因又反過來影響CLOCK/BMAL1復(fù)合物乙?；恼袷帣C(jī)制，這種內(nèi)在的分子機(jī)制調(diào)控的基因存在一個(gè)24 h的表達(dá)周期，它在宏觀上調(diào)控了進(jìn)食、激素、體溫和代謝等多種生理功能[15]。

參與晝夜節(jié)律的去乙?；笧镾IRT1，它是一種依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+)的組蛋白去乙?；福渥饔门cCLOCK相反，可以去乙酰化組蛋白H3的賴氨酸-9和賴氨酸-14[16]。SIRT1除可以去乙?；M蛋白外，還可以去乙?；喾N胞質(zhì)蛋白，如p53蛋白、叉頭框蛋白O1和低氧誘導(dǎo)因子1α等，它是細(xì)胞代謝的重要調(diào)控蛋白，具有抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、延長壽命的作用[17]。

SIRT1是細(xì)胞內(nèi)重要的去乙酰化酶，而乙?；揎椊Y(jié)構(gòu)域存在于多種組蛋白分子中。CLOCK/BMAL1復(fù)合物與SIRT1通過乙?；c去乙?；M蛋白的方式調(diào)控染色質(zhì)異構(gòu)的變化，達(dá)成基因的節(jié)律性表達(dá)[18]。CLOCK/BMAL1復(fù)合物指導(dǎo)組蛋白H3在賴氨酸-9和賴氨酸-14的乙?；?，這種組蛋白翻譯后修飾與晝夜節(jié)律基因的表達(dá)密切相關(guān)。有研究證明，組蛋白H3的絲氨酸-10磷酸化與賴氨酸-14的乙?；哂邢嚓P(guān)性，且H3的磷酸化作用先于乙?；?，H3的磷酸化可能更有利于CLOCK/BMAL1復(fù)合物的結(jié)合[19]。此外，組蛋白甲基化對(duì)乙?；簿哂杏绊懀袑W(xué)者在基因增強(qiáng)子人類同源物2的表達(dá)中發(fā)現(xiàn)，組蛋白H3的賴氨酸-27位點(diǎn)的甲基化有助于基因表達(dá)的啟動(dòng)；在晝夜節(jié)律蛋白中發(fā)現(xiàn)，組蛋白H3的賴氨酸-27甲基化也參與per1和per2基因的表達(dá)調(diào)控[20]。

4 SIRT1與晝夜節(jié)律

自2002年起，晝夜節(jié)律調(diào)控的分子機(jī)制被逐漸闡明，CLOCK作為乙酰化酶的核心機(jī)制被不斷揭示，但去乙?；^程研究相對(duì)較少。SIRT1作為晝夜節(jié)律調(diào)控中的關(guān)鍵去乙?；感枰嗟纳钊胙芯浚綄し答佌{(diào)節(jié)中去乙?；饔玫募?xì)節(jié)和規(guī)律。

SIRT1為哺乳動(dòng)物體內(nèi)的Sir2同源蛋白，Sir2在酵母、線蟲和果蠅體內(nèi)被發(fā)現(xiàn)，它可以被熱量限制激活，延長壽命[21]。在酵母菌中，Sir2介導(dǎo)端粒的轉(zhuǎn)錄沉默并調(diào)節(jié)衰老速度，它通過去乙?；聊?xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)，調(diào)控細(xì)胞的代謝過程[22]。在哺乳動(dòng)物體內(nèi)有7種Sirtuins家族蛋白，分別被命名為SIRT1～SIRT7，其中SIRT1被研究得最為透徹，它在對(duì)抗衰老性疾病的研究中發(fā)揮重要作用，可以調(diào)節(jié)多種代謝過程[16]。SIRT1在低營養(yǎng)環(huán)境下被激活，如禁食和熱量限制，它的激活有利于動(dòng)物在這些條件下生存，故SIRT1被認(rèn)為是研究代謝與衰老關(guān)系的重要連接[23]。SIRT1的去乙酰化存在于胞核和胞質(zhì)中，在細(xì)胞核中，SIRT1可以去乙?；M蛋白H3賴氨酸-9和賴氨酸-14、H4組蛋白賴氨酸-16[24]；在細(xì)胞質(zhì)中，它可以去乙?；痯53、叉頭框蛋白O1、過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1α和肝X受體[25]。因此，SIRT1具有廣泛的調(diào)節(jié)代謝作用。

Nakahata等[26]發(fā)現(xiàn)，SIRT1可以去乙酰化BMAL1，并調(diào)節(jié)其功能。SIRT1的缺乏會(huì)導(dǎo)致晝夜節(jié)律的紊亂，如果敲除sirt1基因，per基因的表達(dá)會(huì)發(fā)生變化，導(dǎo)致晝夜節(jié)律的延長，從而影響生物體的壽命。另一方面，Asher等[27]報(bào)道SIRT1在小鼠成纖維細(xì)胞和肝細(xì)胞中調(diào)控晝夜節(jié)律相關(guān)蛋白，表明SIRT1和晝夜節(jié)律蛋白具有相互作用。研究發(fā)現(xiàn)，SIRT1具有晝夜節(jié)律調(diào)控器的作用，它調(diào)節(jié)了晝夜節(jié)律蛋白的表達(dá)，尤其是對(duì)組蛋白H3乙酰化的調(diào)控[28]。而sirt1基因的敲除或抑制其表達(dá)會(huì)影響組蛋白H3和BMAL1的去乙?；痆29]。在sirt1基因敲除小鼠的肝臟細(xì)胞中，晝夜節(jié)律轉(zhuǎn)錄周期不穩(wěn)定，早期轉(zhuǎn)錄增加，后期轉(zhuǎn)錄減少[30]。此外，在sirt1基因敲除小鼠的胚胎成纖維細(xì)胞中，組蛋白H3賴氨酸-9和賴氨酸-14呈高乙?；痆31]。在特異性敲除sirt1基因的小鼠肝臟細(xì)胞中，BMAL1的乙?；黾?，證明SIRT1有助于體內(nèi)晝夜節(jié)律的調(diào)控[32]。因此，SIRT1作為晝夜節(jié)律的振蕩器，其將細(xì)胞內(nèi)的代謝信號(hào)附加晝夜節(jié)律性，這種節(jié)律性是否穩(wěn)定與衰老性疾病具有很強(qiáng)的關(guān)聯(lián)。

5 NAD+與晝夜節(jié)律

SIRT1的作用受NAD+的影響，NAD+是許多酶發(fā)揮作用均必須存在的輔酶，它由色氨酸前體、煙酸和煙酰胺合成生成，哺乳動(dòng)物NAD+的合成途徑分為從頭合成途徑和維生素B12轉(zhuǎn)化途徑[33]。在SIRT1的去乙?；^程中，煙酰胺從NAD+中釋放，SIRT1將底物的乙?；D(zhuǎn)移到NAD+上并去乙酰化，生成代謝產(chǎn)物O-胰腺-ADP核糖，煙酰胺和O-胰腺-ADP核糖在煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(nicotinamide phosphoribosyl transferase，NAMPT)的作用下重新合成NAD+[34]。

NAMPT為NAD+的合成酶[35]。有研究發(fā)現(xiàn)，小鼠體內(nèi)的NAMPT/NAD+顯示出晝夜節(jié)律性，在黑暗期開始之前，NAMPT蛋白水平降低，這與小鼠開始進(jìn)食的時(shí)間一致，提示營養(yǎng)激增或攝食行為可能對(duì)NAMPT蛋白的表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)[36]。即使小鼠持續(xù)存在于黑暗環(huán)境，NAMPT表達(dá)的振蕩性依然存在，說明NAMPT的表達(dá)存在晝夜節(jié)律性。此外，NAD+的表達(dá)水平與NAMPT的表達(dá)呈現(xiàn)相同的振蕩周期。基于這種振蕩周期，一種NAMPT/NAD晝夜調(diào)控系統(tǒng)被提出，這種調(diào)控系統(tǒng)在胰島β細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞和血管上皮細(xì)胞等中均被證實(shí)存在節(jié)律性[37]。

NAMPT分為細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外兩種形式，其中細(xì)胞外NAMPT是一種分泌蛋白，有助于NAD+的細(xì)胞外合成，所以血清中也可以檢測到NAD+的存在。NAMPT被證明在SIRT1的功能活性中發(fā)揮重要作用[38]。在小鼠體內(nèi)，增加NAMPT的表達(dá)可以增加細(xì)胞內(nèi)NAD+和SIRT1的活性[39]；在血管平滑肌細(xì)胞中，增加NAD+可以對(duì)抗衰老延長壽命[40]；在胰島β細(xì)胞中，NAMPT/NAD和SIRT1對(duì)胰島素的合成和分泌也有調(diào)控作用，NAMPT/NAD系統(tǒng)介導(dǎo)的SIRT1活性可以協(xié)調(diào)晝夜節(jié)律、細(xì)胞代謝和延緩衰老[38]。

內(nèi)源性NAMPT缺乏的組織可能更多的依賴外源性NAMPT，如果外源性NAMPT發(fā)生變化，會(huì)直接影響這些缺乏內(nèi)源性NAMPT組織的晝夜節(jié)律性[39]。因此推測，缺乏內(nèi)源性NAMPT的組織對(duì)晝夜節(jié)律的影響非常敏感，外周NAMPT水平降低會(huì)直接導(dǎo)致這些組織器官的SIRT1活力下降，晝夜節(jié)律性喪失。如胰島β細(xì)胞可能依賴外源性NAMPT調(diào)節(jié)SIRT1活性，有研究證明，服用煙酰胺單核苷酸可使老齡小鼠體內(nèi)葡萄糖刺激的胰島素分泌水平恢復(fù)到較高水平[38]。因此，胰島β細(xì)胞功能的損傷很可能與NAMPT/NAD系統(tǒng)調(diào)節(jié)的SIRT1相關(guān)，這種損傷直接影響了代謝系統(tǒng)的紊亂。

6 SIRT1調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律的干預(yù)手段

作為調(diào)控晝夜節(jié)律的去乙?；?，越來越多的證據(jù)證明，SIRT1是改善晝夜節(jié)律的重要作用靶點(diǎn)[41-43]。已知許多干預(yù)手段可以通過激活SIRT1調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律，如熱量限制、白藜蘆醇和褪黑素。

熱量限制為在不缺少必需營養(yǎng)物質(zhì)的情況下，減少進(jìn)食總熱量的干預(yù)手段，這種干預(yù)被證明可以延緩衰老，并在多種物種中得到證實(shí)，如酵母、果蠅、線蟲、魚、大鼠、小鼠、倉鼠、犬和猴[44]。為研究晝夜節(jié)律與衰老之間的作用關(guān)系和分子機(jī)制，Sato等[44]比較了年輕和年老小鼠的基因轉(zhuǎn)錄本，結(jié)果發(fā)現(xiàn)年老小鼠的節(jié)律性轉(zhuǎn)錄基因只有年輕小鼠的25%左右，其原因可能為細(xì)胞內(nèi)NAD+水平降低和組蛋白乙酰化異常。而限制了30%進(jìn)食的年老小鼠與年輕小鼠的轉(zhuǎn)錄本趨于一致，提示熱量限制可以重構(gòu)基因表達(dá)的節(jié)律性[45]。這些結(jié)果證實(shí)，熱量限制可以通過調(diào)控晝夜節(jié)律緩解衰老的進(jìn)程。在另一項(xiàng)研究中，Solanas等[46]探討了干細(xì)胞的晝夜節(jié)律與衰老之間的聯(lián)系。結(jié)果顯示，成體干細(xì)胞負(fù)責(zé)維持組織和器官的功能穩(wěn)定，成體干細(xì)胞的功能和數(shù)量下降是衰老的重要因素，但成體干細(xì)胞的晝夜節(jié)律失衡會(huì)誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。研究顯示，熱量限制可以降低年齡因素導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和蛋白異常積累，并提高蛋白的新陳代謝周轉(zhuǎn)率[47]。雖然熱量限制改善細(xì)胞生理活動(dòng)的分子機(jī)制尚不完全清楚，但其有益效果與SIRT1的增加和激活相關(guān)。

熱量限制是一種有效對(duì)抗衰老的策略，但限制的程度和時(shí)間沒用明確標(biāo)準(zhǔn)，且這種干預(yù)難以被患者堅(jiān)持，故研究熱量限制模擬劑成為研究熱點(diǎn)。其中，有些化合物可以模擬熱量限制的作用，達(dá)到改善代謝、延長壽命的效果[41]。如白藜蘆醇是研究最多的熱量限制模擬劑，它是一類植物多酚，化學(xué)名為3,4′,5-三羥基芪，主要存在于桑葚、虎杖、花生、葡萄等植物中。Sun等[48]研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇可以修復(fù)高脂飲食引起的晝夜節(jié)律紊亂。高脂飲食可以誘導(dǎo)C57BL/6小鼠的節(jié)律相關(guān)基因表達(dá)受損和脂代謝受損，而白藜蘆醇治療可以改善C57BL/6小鼠體內(nèi)的sirt1、clock、bmal1、per2基因表達(dá)，提示白藜蘆醇可通過影響晝夜節(jié)律恢復(fù)小鼠的正常脂代謝。

除白藜蘆醇被發(fā)現(xiàn)可以修復(fù)基因轉(zhuǎn)錄的晝夜節(jié)律性外，褪黑素也被證實(shí)可以改善晝夜節(jié)律性[42]。褪黑素是松果體分泌的吲哚類激素，它的合成主要受光照周期的調(diào)控。哺乳動(dòng)物體內(nèi)褪黑素的分泌存在一個(gè)24 h的節(jié)律，但隨著年齡的增長，褪黑素的分泌周期會(huì)越來越不穩(wěn)定，這表明褪黑素與衰老性疾病之間存在聯(lián)系。隨著年齡的增加，褪黑素的分泌缺失會(huì)誘導(dǎo)晝夜節(jié)律的紊亂，導(dǎo)致各種基因表達(dá)的不協(xié)調(diào)，使機(jī)體健康情況下降[49]。有學(xué)者利用衰老模型SAMP8小鼠進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，SIRT1和褪黑素存在聯(lián)系[50]。褪黑素通過激活SIRT1，去乙?；M蛋白，調(diào)控下游基因的表達(dá)，如過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1α、叉頭框蛋白O1、核因子κB和p53。雖然褪黑素和SIRT1之間的關(guān)系需要更多研究證實(shí)，但這種聯(lián)系可能成為調(diào)控晝夜節(jié)律、對(duì)抗衰老、神經(jīng)保護(hù)和癌癥治療的重要研究方向。

熱量限制、白藜蘆醇和褪黑素對(duì)衰老相關(guān)的生理功能具有廣泛影響，如調(diào)節(jié)代謝水平、調(diào)節(jié)線粒體功能、抗氧化保護(hù)，以延緩衰老相關(guān)疾病，這些保護(hù)作用與SIRT1的激活以及晝夜節(jié)律的穩(wěn)定相關(guān)，可作為治療衰老性疾病的有效手段。

7 小 結(jié)

晝夜節(jié)律與細(xì)胞和器官的功能緊密結(jié)合，調(diào)控著關(guān)鍵的代謝過程和生理途徑。因此，揭示控制晝夜節(jié)律的分子機(jī)制將成為研究細(xì)胞代謝的關(guān)鍵。乙酰化和去乙?；{(diào)節(jié)為晝夜節(jié)律調(diào)控的開關(guān)，作為此過程中的去乙?；?，SIRT1作用的規(guī)律需進(jìn)一步研究，且激活SIRT1的藥物或干預(yù)方式，如熱量限制、白藜蘆醇需要更多的臨床證據(jù)證明其有效性，以為更好地改善晝夜節(jié)律、預(yù)防和治療衰老性疾病提供臨床依據(jù)。在基礎(chǔ)研究中，已明確SIRT1可以調(diào)控晝夜節(jié)律，未來需深入探討其在晝夜節(jié)律導(dǎo)致的衰老性疾病中的分子機(jī)制。