李世梅，王黎明※，李 銘，湯 慧，李 峰，劉文聘，潘志榮

(1.空軍第九八六醫(yī)院中醫(yī)科，西安 710054； 2.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院泌尿外科，西安 710004；3.陜西九州生物醫(yī)藥科技集團(tuán)有限公司，西安 710065)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以炎癥性滑膜炎為特征的自身免疫性疾病，可引起完全的關(guān)節(jié)損傷及多種關(guān)節(jié)外癥狀和全身癥狀。如果沒(méi)有得到及時(shí)的診斷與治療，可能會(huì)導(dǎo)致患者出現(xiàn)殘疾和過(guò)早死亡[1]。有研究發(fā)現(xiàn)RA與HLA-B27基因的表達(dá)密切相關(guān)，但發(fā)病機(jī)制目前尚不明確[2]。隨著各種新型生物制劑的出現(xiàn)及治療原則和治療策略的優(yōu)化，RA的治療取得了重大進(jìn)展，患者的預(yù)后得到明顯改善[3-4]。然而，各種治療均有其局限性，如引起皮疹、發(fā)熱、過(guò)敏反應(yīng)等藥物不良反應(yīng)，且在某些患者中療效有限。因此，亟需探索新型的治療方法及其作用機(jī)制[5]。人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(umbilical cord mesenchymal stem cell，UC-MSC)因具有組織修復(fù)、抗炎和調(diào)節(jié)免疫多重作用，近年成為RA治療領(lǐng)域有前景的治療方法[6-8]。研究表明，UC-MSC可以安全、有效和持久地緩解RA的癥狀[9-10]。在治療RA方面具有非常高的安全性和有效性，且患者的耐受性良好[11]。另外，鹿瓜多肽(lugua polypeptides，LG)前期干預(yù)UC-MSC能夠顯著增加UC-MSC治療RA的有效性，但具體機(jī)制尚不清楚[12]。本研究通過(guò)體外細(xì)胞模型，旨在探索LG對(duì)UC-MSC增殖、遷移和抗炎因子分泌的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 人UC-MSC由陜西九州生物醫(yī)藥科技集團(tuán)有限公司饋贈(zèng)。LG購(gòu)自哈爾濱譽(yù)衡藥業(yè)(批號(hào)：161113)。磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)(批號(hào)：C0221A)和曲拉通X-100(批號(hào)：ST795)購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司?？篃晒獯銣绶馄瑒?批號(hào)：0100-01)購(gòu)自美國(guó)Southern Biotech公司。KeyFluor488 Click-iT EdU成像檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：KGA331-50)購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。玻片(85680-3101-12)及蓋玻片(80340-0630)購(gòu)自江蘇世泰實(shí)驗(yàn)器材有限公司。DMEM/F12(批號(hào)：10565018)培養(yǎng)基和胎牛血清(批號(hào)：10099141)購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。0.25%胰酶(批號(hào)：15050065)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(批號(hào)：13256-029)和青霉素/鏈霉素雙抗(批號(hào)：15140-122)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。細(xì)胞培養(yǎng)皿(430167)和6孔板(CLS3516-50EA)購(gòu)自美國(guó)Corning公司。Transwell小室(353097)購(gòu)自美國(guó)FALCON公司。微量移液器和全自動(dòng)酶標(biāo)儀(Multiskan MK3)購(gòu)自美國(guó)ThermoFisher公司。超凈工作臺(tái)(SW-CJ-1FD)購(gòu)自蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。CO2恒溫培養(yǎng)箱(MCO-15AC)購(gòu)自日本SANYO公司。低速離心機(jī)購(gòu)(5702R)自美國(guó)Eppendorf公司。熒光顯微鏡(IX71)及倒置顯微鏡(IX51)均購(gòu)自日本OLYMPUS公司。微型高速離心機(jī)(C2500-R-230V)購(gòu)自美國(guó)Labnet公司。肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hepatocyte growth factor，HGF)(批號(hào)：H181)和前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)(批號(hào)：H099)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，腫瘤壞死因子-α誘導(dǎo)蛋白6(tumor necrosis factor-α inducible protein 6，TSG6)(批號(hào)：LS-F12868-1)ELISA試劑盒購(gòu)自美國(guó)LifeSpan公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 人UC-MSC培養(yǎng)于含10 ng/mL堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、10% 胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基中。細(xì)胞培養(yǎng)箱的孵育條件設(shè)置為37.0 ℃、5% CO2和95%濕度。

1.2.1細(xì)胞復(fù)蘇 將UC-MSC從液氮取出后，于37 ℃水浴鍋中迅速解凍。轉(zhuǎn)移溶解后的細(xì)胞至含有5 mL無(wú)血清培養(yǎng)基的離心管中，室溫300×g離心5 min，棄上清液。使用完全培養(yǎng)基(含10% 胎牛血清)重新懸浮細(xì)胞，然后將重懸后的細(xì)胞接種至培養(yǎng)皿，輕柔吹打以混合混勻，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2細(xì)胞傳代 當(dāng)細(xì)胞密度約為80%時(shí)，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代。PBS洗3次后，使用0.25%胰酶消化細(xì)胞，完全培養(yǎng)基終止消化后收集細(xì)胞于10 mL離心管中，室溫300×g離心5 min，棄上清液。加入完全培養(yǎng)基，輕柔吹打細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，按1∶3 的比例傳代。

1.3實(shí)驗(yàn)方法 待細(xì)胞呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)且狀態(tài)良好時(shí)，以每孔2×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中，共種4個(gè)孔，培養(yǎng)過(guò)夜。棄盡舊培養(yǎng)基，分別加入不含(對(duì)照組)或含4、8和12 μg/mL LG的完全培養(yǎng)基，設(shè)為對(duì)照組、4 μg/mL LG組、8 μg/mL LG組和12 μg/mL LG組。

1.3.1EdU細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞分組后，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。在6孔板中取出爬片，PBS洗3次，每次3 min。4%多聚甲醛固定15 min后PBS洗3次，每次3 min。棄去固定液，使用含3%牛血清白蛋白的PBS洗3次后每孔加入1 mL含0.5%曲拉通X-100的PBS，室溫孵育20 min。棄盡每孔中的液體，使用含3%牛血清白蛋白的PBS洗3次后每孔加入0.05 mL Click-iT反應(yīng)混合物，室溫避光孵育30 min。去除反應(yīng)液，使用含3%牛血清白蛋白的PBS洗3次后PBS洗1次，棄盡洗滌液。每張爬片滴加100 μL 1×Hoechst 33342反應(yīng)液(5 μg/mL)，避光，室溫孵育15 min后，PBS洗3次，每次3 min。吸水紙吸干爬片上的液體，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，然后置于熒光顯微鏡下。在低倍視野下找到細(xì)胞后，換至400×，在藍(lán)色激發(fā)光下拍攝EdU綠色熒光，在紫外激發(fā)光下拍照Hoechst綠色熒光，通過(guò)photoshop CS5軟件將這兩張圖片融合并計(jì)數(shù)。每張爬片隨機(jī)挑取5個(gè)視野拍攝圖片。

1.3.2Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞分組后，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。消化離心后，使用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至3×105/mL，每個(gè)Transwell小室內(nèi)加入200 μL制備好的細(xì)胞懸液，每種處理種3個(gè)小室。Transwell小室的下室加入800 μL含10% 胎牛血清的完全培養(yǎng)基。置入細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，取出Transwell，用PBS小心地清洗小室1次，70%冰乙醇溶液固定細(xì)胞1 h。0.5%結(jié)晶紫染液室溫下染色20 min后棄盡染液，PBS洗3次，用干凈的棉簽將上室一側(cè)未遷移的細(xì)胞擦干凈，將小室倒置于載玻片上，于正置顯微鏡下觀察。在低倍視野下找到細(xì)胞后，換至100×并拍照。每個(gè)小室隨機(jī)挑取5個(gè)視野拍攝圖片。

1.3.3ELISA實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞分組后，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。取細(xì)胞培養(yǎng)上清液，(500～1 000)×g離心20 min后開始檢測(cè)。設(shè)3組孔：空白孔、標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣品孔?？瞻卓撞患訕?，只加入顯色劑A、顯色劑B和終止液，用作調(diào)零；每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品孔中加入50 μL稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品，其中0濃度孔加入50 μL標(biāo)準(zhǔn)品/樣品稀釋液，之后加入50 μL生物素抗原工作液；每個(gè)樣品孔中加入50 μL樣品，之后加入50 μL生物素抗原工作液。輕輕搖晃混勻各孔中的溶液，封上封板膜，置于37 ℃恒溫箱中孵育60 min。孵育完后，謹(jǐn)慎揭開封板膜，棄盡每孔中的液體，向每孔中加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，重復(fù)此操作5次，然后棄盡每孔中的液體。向每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣品孔加入50 μL親和素-辣根過(guò)氧化物酶，操作方法同上。先向每孔加入50 μL顯色劑A，然后加入50 μL顯色劑B，輕柔震蕩混合均勻，在37 ℃下避光反應(yīng) 10 min。之后向每孔中加入50 μL終止液以終止反應(yīng)。將ELISA孔板置入多功能酶標(biāo)儀中，使用空白孔調(diào)零，然后在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)量各孔的吸光度值。使用標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和相應(yīng)吸光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后采用此標(biāo)準(zhǔn)曲線根據(jù)各指標(biāo)(HGF、PGE2和TSG6)的吸光度值計(jì)算得出相應(yīng)的濃度。

2 結(jié) 果

2.1各組EdU細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果 在EdU細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中，LG處理UC-MSC后，對(duì)照組、4 μg/mL LG組、8 μg/mL LG組和12 μg/mL LG組中EdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分別為(12.35±3.67)個(gè)細(xì)胞/400×視野、(24.23±7.12)個(gè)細(xì)胞/400×視野、(39.61±7.98)個(gè)細(xì)胞/400×視野和(64.44±15.32)個(gè)細(xì)胞/400×視野，各組EdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=43.590,P<0.001)；與對(duì)照組比較，各處理組的EdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增加(P<0.05)。見圖1。

2.2各組Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果 在Transwell 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)中，LG處理UC-MSC后，對(duì)照組、4 μg/mL LG組、8 μg/mL LG組和12 μg/mL LG組中遷移細(xì)胞數(shù)分別為(20.00±2.00)個(gè)細(xì)胞/100×視野、(32.33±2.52)個(gè)細(xì)胞/100×視野、(50.33±2.52)個(gè)細(xì)胞/100×視野和(71±3.61)個(gè)細(xì)胞/100×視野，各組遷移細(xì)胞數(shù)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=199.500，P<0.001)；與對(duì)照組相比，各處理組的遷移細(xì)胞數(shù)增加(P<0.05)。見圖2。

1a：對(duì)照組；1b：4 μg/mL LG組；1c：8 μg/mL LG組；1d：12 μg/mL LG組

圖1 各組EdU細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果(熒光染色，400×)

2a：對(duì)照組；2b：4 μg/mL LG組；2c：8 μg/mL LG組；2d：12 μg/mL LG組

圖2各組Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果(0.5%結(jié)晶紫染液染色，100×)

2.3各組ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果 在ELISA實(shí)驗(yàn)中，LG處理UC-MSC后，各組HGF、HGE2、TSG6比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，與對(duì)照組相比，4 μg/mL LG組、8 μg/mL LG組和12 μg/mL LG組HGF、PGE2和TSG6的分泌量顯著增加(P<0.05)。見表1。

表1 各組ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果

LG：鹿瓜多肽；UC-MSC：臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞；HGF：肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子；PGE2：前列腺素E2；TSG6：腫瘤壞死因子-α誘導(dǎo)蛋白6；a與對(duì)照組比較，P<0.05

3 討 論

近年來(lái)，雖然RA的臨床治療取得了突破性進(jìn)展，但仍有2個(gè)重大問(wèn)題有待解決：①約30%的患者對(duì)所有治療無(wú)應(yīng)答；②即使RA的臨床炎癥得到緩解，但仍會(huì)出現(xiàn)影像學(xué)上的關(guān)節(jié)損傷[13-16]。這提示，RA的關(guān)節(jié)損傷不僅與炎癥有關(guān)，且單純的抗感染治療可能不足以阻止RA的進(jìn)展。在RA治療領(lǐng)域，特別是對(duì)當(dāng)前治療反應(yīng)不佳的RA患者，間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell，MSC)顯示出廣闊的治療前景[17]。其主要從兩個(gè)方面對(duì)RA發(fā)揮治療作用：①細(xì)胞分化，MSC可以分化成受損的細(xì)胞(骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞)，從而直接修復(fù)受損細(xì)胞；②免疫調(diào)節(jié)，MSC可以通過(guò)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答、抑制各種固有免疫細(xì)胞的產(chǎn)生及其功能等方式起到抗炎、調(diào)節(jié)免疫和抗組織損傷等作用[18-20]。

除細(xì)胞分化外，MSC的增殖和遷移能力也與其對(duì)受損組織的修復(fù)密切相關(guān)。細(xì)胞的增殖決定了最終可分化為靶細(xì)胞的MSC數(shù)量，而細(xì)胞的遷移決定了最終能夠到達(dá)受損部位的MSC數(shù)量[21]。因此，若能促進(jìn)MSC的增殖和遷移，則可潛在地增強(qiáng)MSC的治療效果。本研究通過(guò)EdU細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)和Transwell 遷移實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，LG可顯著促進(jìn)UC-MSC的增殖和遷移，且呈濃度梯度依賴效果。然而，目前LG促進(jìn)UC-MSC增殖和遷移的具體分子機(jī)制尚不清楚。研究發(fā)現(xiàn)，多種信號(hào)通路可能參與對(duì)UC-MSC增殖和遷移的調(diào)節(jié)，包括c-Jun 氨基端激酶-p38通路[22]、黏著斑激酶/磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B通路[23]和胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶通路[24]等，而LG對(duì)UC-MSC增殖和遷移的促進(jìn)作用是否涉及這些信號(hào)通路或其他信號(hào)通路，有待進(jìn)一步研究。

為研究LG對(duì)UC-MSC免疫調(diào)節(jié)作用的影響，本研究使用ELISA實(shí)驗(yàn)對(duì)經(jīng)典抗炎因子HGF、PGE2和TSG6的分泌進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示，LG可濃度依賴性地促進(jìn)這3種抗炎因子的分泌，提示LG可通過(guò)增強(qiáng)UC-MSC的免疫調(diào)節(jié)功能，從而增強(qiáng)UC-MSC治療RA的有效性。然而，這僅為體外研究的結(jié)果，有關(guān)LG對(duì)UC-MSC免疫調(diào)節(jié)作用的影響還需進(jìn)一步的體內(nèi)研究證實(shí)。另外，相關(guān)作用的潛在分子機(jī)制尚不清楚，需要更多的研究去闡明。

綜上所述，LG可促進(jìn)UC-MSC的增殖、遷移及抗炎因子HGF、PGE2和TSG6的分泌，這可能為其增強(qiáng)UC-MSC治療RA有效性的潛在機(jī)制，從而為UC-MSC治療RA提供更多的理論基礎(chǔ)。