任國(guó)慶，鄒曉峰，韓亞男，竇德強(qiáng)*

1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 大連 116600；2.遼寧萬(wàn)嘉醫(yī)藥科技有限公司，遼寧 本溪 117000

人參應(yīng)用歷史悠久，功能作用廣泛，早在西漢時(shí)期，就在治療和防御疾病等方面被廣泛應(yīng)用。人參始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，書中描述其“味甘，微寒。主補(bǔ)五臟，安精神，定魂魄，止驚悸，除邪氣，明目，開(kāi)心益智”?，F(xiàn)代藥理研究表明，人參具有益智[1]、免疫調(diào)節(jié)[2-3]、改善心血管系統(tǒng)[4-5]、抗衰老[6]和抗腫瘤[7]等多種藥理作用。自古野生人參資源稀少，園參的栽種雖解決了人參藥用資源不足的問(wèn)題，但園參的毀林種植方式嚴(yán)重破壞了生態(tài)資源。近年來(lái)，林下山參發(fā)展迅速。林下山參是人為地把人參種子撒播到山林野生狀態(tài)下，任其自然生長(zhǎng)而長(zhǎng)成，因林下山參的生態(tài)環(huán)境與野山參相似，其品質(zhì)及藥用價(jià)值又接近野山參的水平，且能保護(hù)生態(tài)平衡。2008年國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)委頒布的《野山參鑒定及分等質(zhì)量》中，將林下山參納入野山參的范疇?，F(xiàn)如今林下山參已成為高品質(zhì)商品人參的主要來(lái)源。人參根和地上部分都有較好的藥用價(jià)值，目前人參方面的研究主要是單獨(dú)對(duì)人參根或人參莖葉進(jìn)行研究，本研究擬對(duì)林下山參全草的免疫調(diào)節(jié)作用進(jìn)行研究，從細(xì)胞免疫功能、體液免疫功能、單核-巨噬細(xì)胞功能、NK細(xì)胞活性4個(gè)方面對(duì)林下山參全草在免疫功能方面的作用進(jìn)行研究，以期為林下山參全草的綜合利用奠定基礎(chǔ)，為林下山參全草調(diào)節(jié)免疫作用提供相關(guān)理論依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

林下山參全草由參仙源生物工程有限公司提供，由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)王冰教授鑒定為五加科植物人參PanaxginsengC.A.Mey.。將樣品粉碎，以林下山參根∶林下山參莖葉=1∶2的比例混合(因十五年生林下山參的干燥品根與莖葉比重約為1∶2，故以此比例混合林下山參根和莖葉粉末)。參考2015版《中華人民共和國(guó)藥典》人參日攝入量，將林下山參全草日攝入量設(shè)計(jì)為1.5 g/60 kg，以生藥粉作為受試物，蒸餾水做溶劑。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選用遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司繁殖的SPF級(jí)18～22 g雄性昆明種小鼠(SCXK 2010-0001)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，恒溫恒濕，溫度(22±1.5)℃，濕度50%±10%，人工照明12 h，黑夜12 h。

1.3 儀器與試劑

電子分析天平(上海光正醫(yī)療器械有限公司)；KC-100酶標(biāo)分析儀(深圳凱特生物醫(yī)療電子科技有限公司)；二氧化碳培養(yǎng)箱(日本三洋公司)；UV2100型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(尤尼柯上海儀器有限公司)；奧林巴斯BX51TRF顯微鏡；TD24-WS臺(tái)式低速離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司)；電熱恒溫水浴鍋(北京永光明醫(yī)療儀器有限公司)。

豚鼠血清、小牛血清(杭州四季青生物工程公司)；硝基氯化四氮唑(INT)、乳酸鋰、刀豆蛋白A(Con A)、噻唑藍(lán)(MTT)、Hank’s液(pH 7.2-7.4)(美國(guó)Sigma公司)；水楊酸緩沖液(SA緩沖液)、PBS緩沖液(pH7.2～7.4)(北京索萊寶科技有限公司)；瓊脂糖(上海耐今實(shí)業(yè)有限公司)；印度墨汁(北京篤信精細(xì)制劑廠)；Na2CO3(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；綿羊紅細(xì)胞(SRBC)、雞紅細(xì)胞、YAC-1細(xì)胞(中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù))；RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液(美國(guó)Gibco公司)；吩嗪二甲酯硫酸鹽(PMS)(Biochemika公司)；Tris base(Amresco公司)；2，4-二硝基氟苯(2，4-dinitrofluorobenzene，DNFB)(中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司)；丙酮、鹽酸、異丙醇(天津市大茂化學(xué)試劑廠)；氧化型輔酶Ⅰ(NAD)(Roche公司)。

2 方法

2.1 細(xì)胞免疫功能實(shí)驗(yàn)

2.1.1 Con A誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)

2.1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥 雄性昆明種小鼠40只，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，隨機(jī)分為4組，分別為溶劑對(duì)照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組，每組10只小鼠。分別給予林下山參全草生藥粉低劑量(0.25 g·kg-1)、中劑量(0.50 g·kg-1)、高劑量(0.75 g·kg-1)(相當(dāng)于人體日攝入量的10倍、20倍、30倍)，溶劑對(duì)照組給予等量的蒸餾水。每天灌胃1次，連續(xù)30 d，按體重調(diào)整灌胃量(灌胃量按20 mL·kg-1計(jì)算)。

2.1.1.2 脾細(xì)胞懸液制備 末次給藥12 h后，取脾放入盛有Hank’s液的平皿中，將脾磨碎制成單細(xì)胞懸液，1000 r·min-1離心10 min，用Hank’s液洗2遍，最后將細(xì)胞懸浮于完全培養(yǎng)液中，計(jì)數(shù)活細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞濃度。

2.1.1.3 淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)與測(cè)定 參照文獻(xiàn)[8]進(jìn)行測(cè)定。將細(xì)胞懸液分兩孔加入24孔培養(yǎng)板中，每孔1 mL，一孔加75 μL Con A液，另一孔作為對(duì)照，置5%CO2、37 ℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。培養(yǎng)結(jié)束前4 h，每孔吸去上清液0.7 mL，加入0.7 mL不含小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，同時(shí)加入MTT50 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入1 mL酸性異丙醇，混勻使結(jié)晶完全溶解。使用分光光度計(jì)在570 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。

2.1.2 二硝基氟苯(DNFB)誘導(dǎo)小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)(DTH)實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥同2.1.1.1。

2.1.2.1 致敏 給藥24 d后，大鼠腹部脫毛，用DNFB溶液50 μL均勻涂抹進(jìn)行致敏處理。

2.1.2.2 DTH的產(chǎn)生與測(cè)定 5 d后，用DNFB溶液10 μL均勻涂抹于小鼠右耳。于涂抹后24 h處死小鼠，剪下左右耳殼。用打孔器取下耳片，稱重。

2.2 體液免疫功能實(shí)驗(yàn)

2.2.1 抗體生成細(xì)胞檢測(cè) 參照文獻(xiàn)[9]進(jìn)行測(cè)定，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥同2.1.1.1。

2.2.1.1 SRBC免疫 取新鮮綿羊血，用0.9%氯化鈉溶液洗滌3次，每次離心(2000 r·min-1)10 min，將壓積SRBC用0.9%氯化鈉溶液配成2%(v/v)的細(xì)胞懸液，在第24天給藥結(jié)束后，每只鼠腹腔注射0.2 mL。

2.2.1.2 制備補(bǔ)體 將1 mL壓積SRBC加入到5 mL豚鼠血清中，4 ℃冰箱放置30 min，經(jīng)常振蕩，離心取上清，分裝，-70 ℃保存。用時(shí)以SA液按1∶8稀釋。

2.2.1.3 片架的制作 取潔凈的載玻片，粘兩條透明膠帶，中間留有約15 mm的間隔，在膠帶上薄涂一層凡士林。

2.2.1.4 脾細(xì)胞懸液制備 將SRBC免疫5 d后的小鼠處死，取脾臟，放入盛有Hank’s液的平皿內(nèi)，將脾磨碎制成細(xì)胞懸液，1000 r·min-1離心10 min，用Hank’s液洗2遍，將細(xì)胞懸浮在RPMI1640培養(yǎng)液中，計(jì)數(shù)細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞濃度。

2.2.1.5 空斑的測(cè)定 將表層培養(yǎng)基(1 g瓊脂糖加雙蒸水至100 mL)加熱溶解后，放45 ℃水浴保溫，與等量pH7.4、2倍濃度的Hank’s液混合，分裝小試管，每管0.5 mL，再向管內(nèi)加50 μL 10%SRBC(v/v，用SA液配制)，20 μL脾細(xì)胞懸液，迅速混勻，傾倒于已刷瓊脂糖薄層的20 mm×20 mm蓋玻片上，待瓊脂凝固后，將蓋玻片水平扣放在自制片架上，用鑷子尾端將蓋玻片壓平貼牢。放入二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育1.5 h。用凡士林將蓋玻片一端封住，然后將用SA緩沖液稀釋的補(bǔ)體(1∶8)加入到凹槽內(nèi)，繼續(xù)孵育1.5 h后，觀察凹槽內(nèi)空斑，低倍鏡下檢查并計(jì)數(shù)出現(xiàn)的溶血空斑。真正的溶血空斑必須中心有一個(gè)淋巴細(xì)胞，周圍為透明區(qū)。

樣本出現(xiàn)的空斑數(shù)

(1)

2.2.2 血清溶血素的測(cè)定 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥同2.1.1.1。SRBC免疫同2.2.1.1。末次給藥12 h后，小鼠眼眶取血，制備血清，用0.9%氯化鈉溶液將血清倍比稀釋，將不同稀釋度的血清分別置于微量血凝實(shí)驗(yàn)板內(nèi)，每孔100 μL，再加入100 μL 0.5%(v/v)的SRBC懸液，混勻，裝入濕潤(rùn)的平盤內(nèi)加蓋，于37 ℃溫箱孵育3 h，觀察血球凝集程度。血球凝集程度一般分為5級(jí)(0～Ⅳ)記錄，按下式計(jì)算抗體積數(shù)。

抗體積數(shù)=(S1+2S2+3S3……nSn)

(2)

式中1、2、3……n代表對(duì)倍稀釋的指數(shù)，S代表凝集程度的級(jí)別，抗體積數(shù)越大，表示血清抗體越高。0級(jí)：紅細(xì)胞全部下沉，集中在孔底部形成致密的圓點(diǎn)狀，四周液體清晰；Ⅰ級(jí)：紅細(xì)胞大部分沉集在孔底成圓點(diǎn)狀，四周有少量凝集的紅細(xì)胞；Ⅱ級(jí)：凝集的紅細(xì)胞在孔底形成薄層，中心可以明顯見(jiàn)到一個(gè)疏松的紅點(diǎn)；Ⅲ級(jí)：凝集的紅細(xì)胞均勻地鋪散在孔底成一薄層，中心隱約可見(jiàn)一個(gè)小紅點(diǎn)；Ⅳ級(jí)：凝集的紅細(xì)胞均勻地鋪散在孔底成一薄層，凝塊有時(shí)成卷折狀。

2.3 單核-巨噬細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)

2.3.1 小鼠碳廓清實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥同2.1.1.1。末次給藥12 h后，從小鼠尾靜脈注入稀釋5倍的印度墨汁，按每10 g體質(zhì)量0.1 mL計(jì)算。待墨汁注入，立即計(jì)時(shí)。注入墨汁后2、10 min，分別從內(nèi)眥靜脈叢取血20 μL，并立即將其加到2 mL Na2CO3溶液中。以600 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度A，以Na2CO3溶液作空白對(duì)照。將小鼠處死，取肝臟和脾臟，用濾紙吸干臟器表面血污，稱重。以吞噬指數(shù)表示小鼠碳廓清的能力。按下式計(jì)算吞噬指數(shù)α。

(3)

t1：注入墨汁后第一次從內(nèi)眥靜脈叢取血的時(shí)間；t2：注入墨汁后第二次從內(nèi)眥靜脈叢取血的時(shí)間；A1：第一次取血測(cè)得的吸光度；A2：第二次取血測(cè)得的吸光度。

(4)

2.3.2 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥同2.1.1.1。參照文獻(xiàn)[10]進(jìn)行測(cè)定。末次給藥12 h后，每鼠腹腔注射20%雞紅細(xì)胞懸液1 mL，間隔30 min，頸椎脫臼處死動(dòng)物，將其仰位固定于鼠板上，正中剪開(kāi)腹壁皮膚，經(jīng)腹腔注入0.9%氯化鈉溶液2 mL，轉(zhuǎn)動(dòng)鼠板1 min。然后吸出腹腔洗液1 mL，平均分滴于2片載玻片上，放入墊有濕沙布的搪瓷盒內(nèi)，移置37 ℃孵箱溫育30 min。孵畢，于0.9%氯化鈉溶液中漂洗，以除去未貼片細(xì)胞。晾干，以1∶1丙酮甲醇溶液固定，4%(v/v)Giemsa-磷酸緩沖液染色3 min，再用大豆色拉油漂洗晾干。油鏡下計(jì)數(shù)巨噬細(xì)胞，每張片計(jì)數(shù)100個(gè)，以吞噬百分率表示小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬能力。按下式計(jì)算吞噬百分率。

(5)

2.4 NK細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥同2.1.1.1[10]。

2.4.1 LDH基質(zhì)液的配制 乳酸鋰5×10-2、INT 6.6×10-4、PMS 2.8×10-4、NAD 1.3×10-3mol·L-1，將上述試劑溶于0.2mol·L-1的Tris-HCl緩沖液中(pH8.2)。

2.4.2 靶細(xì)胞的傳代(YAC-1細(xì)胞) 實(shí)驗(yàn)前24 h將靶細(xì)胞(YAC-1細(xì)胞)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。應(yīng)用前以Hank’s液洗3次，用RPMI 1640憲全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為4×105個(gè)/mL。

2.4.3 脾細(xì)胞懸液的制備(效應(yīng)細(xì)胞) 末次給藥12 h后，無(wú)菌取脾，置于盛有適量無(wú)菌Hank’s液的小平皿中，用200目濾網(wǎng)將脾磨碎，制成單細(xì)胞懸液。用Hank’s液洗2次，每次離心(1000 r·min-1)10 min。棄上清將細(xì)胞漿彈起，加入0.5 mL滅菌水20 s，裂解紅細(xì)胞后再加入0.5 mL 2倍Hank’s液及8 mL Hank’s液，1000 r·min-1離心10 min，用1 mL含10%小牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)液重懸，用臺(tái)酚蘭染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)(應(yīng)在95%以上)，最后用RPMI 1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為2×107個(gè)/mL。

2.4.4 LDH活性檢測(cè) 取靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞各100 μL(效靶比50∶1)，加入U(xiǎn)型96孔培養(yǎng)板中；靶細(xì)胞自然釋放孔加靶細(xì)胞和培養(yǎng)液各100 μL，靶細(xì)胞最大釋放孔加靶細(xì)胞和2.5%Triton各100 μL；上述各項(xiàng)均設(shè)3個(gè)平行孔，于5%CO2、37 ℃CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，然后將96孔培養(yǎng)板以1500 r·min-1離心5 min，每孔吸取上清100 μL置平底96孔培養(yǎng)板中，同時(shí)加入LDH基質(zhì)液100 μL，反應(yīng)3 min，每孔加入1 mol·L-1的HC1 30 μL，在酶標(biāo)儀490 nm處測(cè)定吸光度A。按下式計(jì)算NK細(xì)胞活性。

(6)

2.5 臟器指數(shù)測(cè)定

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥同2.1.1.1。末次給藥12 h后，小鼠稱重，眼眶取血，制備血清，備用；小鼠脫頸椎處死后，取其胸腺和脾臟，稱重，計(jì)算胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)。

(7)

2.6 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

3 結(jié)果

3.1 臟器指數(shù)測(cè)定結(jié)果

由圖1知，各實(shí)驗(yàn)組胸腺及脾臟指數(shù)與樣品溶劑對(duì)照組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 小鼠臟器指數(shù)測(cè)定結(jié)果

3.2 DNFB誘導(dǎo)小鼠DTH實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由圖2知，各實(shí)驗(yàn)組的左右耳質(zhì)量差值與樣品溶劑對(duì)照組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2 DNFB誘導(dǎo)小鼠DTH實(shí)驗(yàn)左右耳質(zhì)量差測(cè)量結(jié)果

3.3 ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)

由圖3知，中、高劑量實(shí)驗(yàn)組的波光度差值顯著高于樣品溶劑對(duì)照組(P<0.01)，而低劑量實(shí)驗(yàn)組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示林下山參全草對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化有增強(qiáng)作用且與其劑量呈正相關(guān)。

注：與溶劑對(duì)照組比較，**P<0.01。

3.4 小鼠抗體生成細(xì)胞檢測(cè)和小鼠血清溶血素測(cè)定結(jié)果

由圖4(A)知，低、中劑量實(shí)驗(yàn)組中溶血空斑數(shù)顯著高于樣品溶劑對(duì)照組(P<0.01)；由圖4(B)知，低、中劑量實(shí)驗(yàn)組中血清溶血素抗體積數(shù)顯著高于樣品溶劑對(duì)照組(P<0.01)，表明林下山參全草對(duì)血清溶血素和抗體生成細(xì)胞的產(chǎn)生有增強(qiáng)作用。

注：A.抗體生成細(xì)胞檢測(cè)空斑數(shù)；B.血清溶血素實(shí)驗(yàn)抗體積數(shù)測(cè)定結(jié)果；與溶劑對(duì)照組比較，**P<0.01。

3.5 小鼠碳廓清實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由圖5知，只有低劑量實(shí)驗(yàn)組的吞噬指數(shù)α顯著高于樣品溶劑對(duì)照組(P<0.01)，表明林下山參全草對(duì)調(diào)節(jié)小鼠碳廓清能力作用較緩和。

注：與溶劑對(duì)照組比較，**P<0.01。

3.6 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由圖6知，各實(shí)驗(yàn)組的吞噬百分率與樣品溶劑對(duì)照組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明林下山參全草對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的調(diào)節(jié)作用不顯著。圖7中，藍(lán)紫色為被染色劑染為藍(lán)紫色的未吞噬的巨噬細(xì)胞，紫黑色為吞噬雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞。

注：A.未吞噬的巨噬細(xì)胞；B.吞噬雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞。

圖7 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn)吞噬細(xì)胞顯微圖片

3.7 小鼠NK細(xì)胞活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由圖8知，各實(shí)驗(yàn)組小鼠NK細(xì)胞活性與樣品溶劑對(duì)照組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明林下山參全草對(duì)NK細(xì)胞活性無(wú)顯著性調(diào)節(jié)作用。

圖8 小鼠NK細(xì)胞活性測(cè)定結(jié)果

4 討論

人參歷為大補(bǔ)元?dú)庵ニ帲菥扇胨?，其自上而下以葉補(bǔ)肺氣、根莖補(bǔ)脾胃之氣、果填補(bǔ)腎精，猶若人體之有肺、脾胃及腎三臟，渾然一體，不僅切合取象比類思維，同時(shí)“全人參”作為一個(gè)整體，入藥補(bǔ)氣亦是中醫(yī)整體觀的具體體現(xiàn)[11]。目前主要針對(duì)人參根或人參莖葉免疫作用研究，而未見(jiàn)對(duì)人參全草免疫作用相關(guān)報(bào)道，本文以林下山參全草為對(duì)象，從細(xì)胞免疫功能、體液免疫功能、單核-巨噬細(xì)胞功能和NK細(xì)胞活性4個(gè)方面，探討其對(duì)小鼠免疫功能的影響。

細(xì)胞免疫主要是由T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的一種特異性免疫反應(yīng)。正常機(jī)體的T淋巴細(xì)胞在體外培養(yǎng)過(guò)程中受到特異性抗原或有絲分裂原刺激，可轉(zhuǎn)化為淋巴母細(xì)胞。淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率降低表示細(xì)胞免疫水平低下。Con A誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，其轉(zhuǎn)化率常被用來(lái)衡量機(jī)體細(xì)胞免疫水平；T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率低，意味著在外來(lái)因子的刺激下淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)降低，機(jī)體的免疫力下降[8]。DHT是T細(xì)胞功能的測(cè)定方法，其反應(yīng)主要是由T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫損傷，DNFB是常用的誘生接觸型超敏反應(yīng)致敏原[12]。有研究表明，淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)可對(duì)DTH實(shí)驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證[13]，確保結(jié)果的準(zhǔn)確性。所以對(duì)小鼠進(jìn)行脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)和DTH實(shí)驗(yàn)，以確定林下山參全草對(duì)小鼠細(xì)胞免疫的調(diào)節(jié)作用。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，林下山參全草中、高劑量組與對(duì)照組相比均極顯著提高脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化，但林下山參全草對(duì)小鼠DTH無(wú)顯著性影響。DNFB誘導(dǎo)的遲發(fā)型超敏反應(yīng)則是反應(yīng)細(xì)胞免疫的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)，且淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果多用來(lái)佐證DTH，該結(jié)果陰性，表明林下山參全草對(duì)促進(jìn)細(xì)胞免疫功能的調(diào)節(jié)無(wú)顯著性作用，但可以調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。

體液免疫是由B淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的特異性免疫反應(yīng)。B細(xì)胞可以識(shí)別相應(yīng)的抗原，通過(guò)抗原-抗體反應(yīng)清除病原體，維持體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[10]?？贵w生成細(xì)胞檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中每個(gè)釋放溶血性抗體的B淋巴細(xì)胞在補(bǔ)體的參與下可溶解周圍的綿羊紅細(xì)胞，在周圍形成一個(gè)可見(jiàn)的空斑。一個(gè)空斑代表一個(gè)抗體生成細(xì)胞，空斑的數(shù)量反映機(jī)體的體液免疫功能。血清溶血素的水平是機(jī)體免疫功能的主要指標(biāo)，反映了B細(xì)胞的增殖分化以及與補(bǔ)體結(jié)合后向體液中分泌溶血素的能力，用以檢測(cè)藥物對(duì)機(jī)體防御能力的影響[14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，林下山參全草低、中劑量組與對(duì)照組相比能顯著提高血清溶血素和抗體生成細(xì)胞的水平，表明林下山參全草能促進(jìn)小鼠產(chǎn)生血清溶血素和抗體生成細(xì)胞，從而增強(qiáng)B淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫反應(yīng)，并且其藥理作用有最適劑量。

固有免疫也稱為非特異性免疫，其中單核巨噬細(xì)胞的作用是在激活免疫應(yīng)答前發(fā)揮吞噬功能清除外來(lái)病原體。巨噬細(xì)胞是單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)的主要成員，它的主要作用是吞噬病原體，促進(jìn)活化T細(xì)胞和NK細(xì)胞殺傷感染的細(xì)胞[15]。評(píng)價(jià)單核巨噬細(xì)胞的吞噬功能常采用碳廓清實(shí)驗(yàn)，當(dāng)碳顆粒進(jìn)入血液后，血液中的吞噬細(xì)胞便開(kāi)始吞噬異物顆粒。NK細(xì)胞是一種對(duì)靶細(xì)胞的殺傷不具有特異性的細(xì)胞，可以直接清除感染病原的細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞，在抵抗病原感染和清除腫瘤細(xì)胞過(guò)程中發(fā)揮著非常重要的作用[16]。由于吞噬細(xì)胞強(qiáng)大的吞噬和殺傷作用，它們的功能強(qiáng)弱常用來(lái)反映了藥物對(duì)機(jī)體非特異性免疫功能調(diào)節(jié)作用的強(qiáng)弱。免疫器官可分為中樞免疫器官(胸腺、骨髓)和外周免疫器官(脾臟、淋巴結(jié)等)，是機(jī)體免疫細(xì)胞產(chǎn)生和寄宿的地方，對(duì)維持機(jī)體免疫性能起重要作用。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，各實(shí)驗(yàn)組中脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)、腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能、NK細(xì)胞活性差異不顯著，只有低劑量組的碳廓清吞噬指數(shù)α有顯著性升高。表明林下山參全草對(duì)小鼠免疫器官發(fā)育和固有免疫的作用不顯著。

周婭紅[17]研究發(fā)現(xiàn)，人參總皂苷可提高免疫低下小鼠的臟器指數(shù)、碳廓清指數(shù)和吞噬指數(shù)；提高免疫低下小鼠血清IgM和IgG的生成；促進(jìn)免疫低下小鼠DTH。趙蕭蕭[18]從人參葉中提取水溶性多糖，并觀察其對(duì)小鼠免疫功能的影響，發(fā)現(xiàn)給予小鼠人參葉多糖，可以顯著增加小鼠脾臟、胸腺器官指數(shù)，明顯提高腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力及脾細(xì)胞增殖能力。曾祥云等[19]研究人參片對(duì)小鼠免疫功能的影響，發(fā)現(xiàn)其對(duì)小鼠脾臟、胸腺器官指數(shù)、脾細(xì)胞增殖能力、腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力及抗體生成細(xì)胞數(shù)均無(wú)顯著性影響，但顯著性提高DNFB誘導(dǎo)小鼠DTH形成能力及NK細(xì)胞活性。結(jié)合已有報(bào)道，林下山參全草與之相比對(duì)小鼠免疫調(diào)節(jié)作用的差異較大。首先免疫器官方面，胸腺和脾臟的臟器指數(shù)常作為評(píng)價(jià)藥物對(duì)機(jī)體免疫器官發(fā)育的變化的調(diào)節(jié)指標(biāo)。已有研究表明，人參及其總皂苷均能促進(jìn)免疫器官發(fā)育，這與本文結(jié)果不同，推測(cè)未能促進(jìn)免疫器官發(fā)育可能和人參地上部分的藥理作用有關(guān)聯(lián)。但人參葉多糖也具有促進(jìn)免疫器官發(fā)育的作用，所以推測(cè)可能與人參葉中非多糖成分有關(guān)，而人參葉中含有較多的人參皂苷Re和Rd，其是否對(duì)免疫器官發(fā)育有影響，有待進(jìn)一步研究。其次細(xì)胞免疫功能方面，Cho等[20]研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rb1和Re能顯著地促進(jìn)Con A誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞增殖，Rb2能強(qiáng)烈地抑制Con A、植物血凝素(PHA)和脂多糖(LPS)的誘導(dǎo)作用。本文中林下山參全草能顯著提高小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力，推測(cè)林下山參全草因含地上部分較多，故含有較多的人參皂苷Re，且人參皂苷Re的促進(jìn)作用強(qiáng)于人參皂苷Rb2抑制作用，促進(jìn)了淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。而對(duì)促進(jìn)DNFB誘導(dǎo)小鼠DTH形成能力無(wú)顯著性影響，推測(cè)可能是某單體皂苷抑制了DNFB的誘導(dǎo)作用，具體有效成分有待進(jìn)一步研究；然后體液免疫功能方面，Wang等[21]研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rh1體外對(duì)LPS誘導(dǎo)的B淋巴細(xì)胞的增殖無(wú)明顯作用。楊秀偉等[22]對(duì)近些年人參及其皂苷的藥理學(xué)作用的總結(jié)中表明，在LPS刺激的巨噬細(xì)胞模型中，Rg1能抑制轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)因子的表達(dá)且能顯著提高小鼠腫瘤模型的免疫功能。丁艷芳[23]總結(jié)近些年對(duì)人參皂苷Rh1的藥理作用，認(rèn)為其與Rg1有相似的藥理作用。本文林下山參全草能提高小鼠的抗體生成細(xì)胞數(shù)和血清抗體積數(shù)，而人參只能提高小鼠的血清抗體積數(shù)，故推測(cè)人參皂苷Rd對(duì)小鼠的體液免疫有調(diào)節(jié)作用。

綜上，林下山參全草與人參對(duì)小鼠免疫功能的影響差異主要在于細(xì)胞免疫及NK細(xì)胞活性；人參葉多糖對(duì)小鼠免疫功能的影響差異主要在于固有免疫和免疫器官；與人參總皂苷對(duì)小鼠免疫功能的影響差異主要在于細(xì)胞免疫和固有免疫。以上研究說(shuō)明對(duì)小鼠免疫調(diào)節(jié)的不同作用可能與人參皂苷的種類及其含量有關(guān)，且各組分間相互影響。林下山參全草能夠調(diào)節(jié)小鼠免疫功能，主要體現(xiàn)在體液免疫功能方面，對(duì)于其免疫調(diào)節(jié)作用機(jī)理及各單體皂苷對(duì)免疫調(diào)節(jié)的影響，還有待于進(jìn)一步研究。