田景，金華，申國安*，郭寶林*，姜志海，李礫，楊相波

1.中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 藥用植物研究所，北京 100193； 2.國藥集團同濟堂(貴州)制藥有限公司，貴州 貴陽 550009

擬巫山淫羊藿EpimediumpseudowushanenseB.L.Guo為小檗科淫羊藿屬多年生草本植物，是國內(nèi)首個實現(xiàn)栽培化的淫羊藿屬藥用植物品種，其化學成分構成以朝藿定C含量高為特點(1.5%以上)，優(yōu)于巫山淫羊藿，本課題組一直致力于開展淫羊藿的種植技術研究和規(guī)范化栽培，制定了擬巫山淫羊藿的種子質(zhì)量標準[1]，并調(diào)查了其生長的土壤條件[2]。植物生長調(diào)節(jié)劑在藥用植物栽培生產(chǎn)中用于促進生根，提高成活率等已有較多研究[3-6]，本文則進行了植物生長調(diào)節(jié)劑促進擬巫山淫羊藿芽數(shù)目進而改善其栽培狀況的研究。

擬巫山淫羊藿和大多數(shù)淫羊藿屬植物一樣，是地面芽植物，地上部分的花莖和基生葉從根芽萌發(fā)生長，而根芽是在上一年度秋冬季形成。淫羊藿的藥用部位是葉片，因此通過促進冬季根芽形成可以提高第二年產(chǎn)量。

本課題組此前的研究發(fā)現(xiàn)6-BA及6-BA與尿素的綜合處理具有顯著的促進擬巫山淫羊藿采收后再萌發(fā)的作用[7]，考慮到促進冬芽形成和促進采收后再萌發(fā)的作用對象都是腋芽，作用原理都是主要通過打破頂端優(yōu)勢以促進腋芽膨大生長或萌發(fā)成枝，具有一致性。因此本論文繼續(xù)研究了6-BA及尿素對秋冬根芽形成的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗材料選用二年生擬巫山淫羊藿EpimediumpseudowushanenseB.L.Guo實生苗，由中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所郭寶林研究員鑒定。

1.2 儀器與試劑

儀器：珀金埃爾默HPLC儀器(Flexar PDA LC Detector，Totalchrom色譜工作站)，KQ-500DE 數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，GZX-9070 MBE數(shù)顯鼓風干燥箱(上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠)，十萬分之一電子天平(瑞士MettlerToledo公司)，萬分之一天平(上海精密科學儀器有限公司)，0.22 μm微孔濾膜(上海新亞凈化器件廠)。

試劑：無水乙醇(AR，北京化工廠)，乙腈(HPLC，F(xiàn)isher)，娃哈哈純凈水，鹽酸(AR，北京化工廠)。尿素(AR，99%)，6-BA(AR，99%)，均購自上海源葉生物科技有限公司。對照品朝藿定A，朝藿定B，朝藿定C及淫羊藿苷均為實驗室自制，純度大于99%。

1.3 實驗設計

噴葉處理方式及灌根處理方式各一次實驗，均采用隨機區(qū)組設計。

噴葉處理實驗：于2016—2017年在貴州省雷山縣擬巫山淫羊藿栽培實驗地(N 26°21′，E 108°1′，海拔1300 m)進行。土壤全氮3.48 g·kg-1，有機質(zhì)48.7 g·kg-1，堿解氮222 mg·kg-1，有效磷63.1 mg·kg-1，速效鉀84.2 mg·kg-1，pH 4.40。設三個區(qū)組，6個處理，每個處理3個重復(詳見表1)，每處理面積3×1.2 m，約60株。于2016年11月25日下午及12月1日下午共施藥兩次，每次每個處理葉面噴施1 L。實驗期間定期除草并預防和控制病蟲害。

灌根處理實驗：于2017—2018年在貴州省雷山縣擬巫山淫羊藿栽培試驗地(N 26°21′，E 108°5′，海拔1250 m)進行，試驗地土壤全氮2.51 g·kg-1，有機質(zhì)66.1 g·kg-1，堿解氮313 mg·kg-1，有效磷68.7 mg·kg-1，速效鉀130 mg·kg-1，pH 4.72。設3個區(qū)組，8個處理，每個處理3個重復(詳見表1)，每處理每區(qū)20株。2017年11月14、15日連續(xù)兩天施藥，每次每株灌根50 mL，將液體裝入自封袋，剪小口直接施到植株根部及附近的土壤上。實驗期間定期除草并預防和控制病蟲害。

表1 促進擬巫山淫羊藿根芽形成實驗設計

1.4 秋冬芽和萌發(fā)生長量統(tǒng)計

噴葉處理實驗：在2016年11月24日，每處理標記其中長勢中等和均勻的13株。2017年，在上一年度首批根芽萌發(fā)且葉片成熟后的6月13日和14日，按株采收標記植物的全部地上部分，帶回，晾干，然后統(tǒng)計每株的新地上部分重量(2017年新萌發(fā)部分)，老地上部分重量(2016年生長的地上部分，一般老葉留存到在2017年6月下旬才開始逐步死亡)。

灌根處理實驗：2018年，在當年秋冬季根芽形成結束并即將開始萌發(fā)的2月6日和8日，每個處理取10株，將整株挖取，洗去泥土，記錄每株芽的數(shù)目(包括一級芽、二級芽)，記算總芽數(shù)(總芽數(shù)=二級芽+一級芽)(芽長>6 mm)。因2018年早春倒春寒，多數(shù)最早萌發(fā)的幼嫩地上部分被凍死，實驗設計的剩余10株的萌發(fā)生長量無法準確統(tǒng)計。

1.5 淫羊藿苷類成分含量測定

噴葉處理實驗：2016年12月22日每處理每株1片，取20株，及2017年6月13日取當年萌發(fā)的成熟葉片20片，混合用于淫羊藿苷類成分含量測定。

灌根處理實驗：于2018年4月30日每處理取當年萌發(fā)的成熟葉片，每株2片，混合用于淫羊藿苷類成分含量測定。

淫羊藿苷類成分含量測定：葉片陰干，干燥葉片中朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C及淫羊藿苷含量的測定方法參考文獻[8]。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 22.0進行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析，Excel 2010作表及作圖。

2 結果與討論

2.1 灌根處理對芽數(shù)目的影響

擬巫山淫羊藿形成于根狀莖節(jié)上的芽為腋芽，外面鱗片包被。根據(jù)芽的著生位置不同，將直接從老根狀莖(一般是上一年度形成)上產(chǎn)生的芽定義為一級芽，一級芽隨后不斷生長，隨后此芽飽滿，生長、伸長變粗為新的根狀莖，根狀莖節(jié)上又有腋芽形成和膨大生長，形成的新芽稱之為二級芽。一級芽和二級芽中長度大于6 mm的芽一般會在第二年早春萌發(fā)，形成當年的地上部分，4月末到6月初成熟，藥材產(chǎn)量也主要據(jù)此而計算，而小于6 mm的芽則多數(shù)不在早春萌發(fā)，因此本文僅計數(shù)大于6 mm的一級芽和二級芽。

由表2可以看出僅300 mg·L-1尿素和60 mg·L-16-BA的綜合處理顯著增加了總芽數(shù)目，較對照組增加44.08%(P<0.05)，表現(xiàn)為二級芽數(shù)目顯著較高，較對照組增加60.97%(P<0.05)。

30 mg·L-1的6-BA處理顯著降低了二級芽數(shù)目，但一級芽的數(shù)目較對照組顯著增加，較對組提高59.70%(P<0.05)，總芽數(shù)與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義。

不同濃度的尿素處理(Urea 300 mg·L-1、Urea 500 mg·L-1、1000 mg·L-1)對芽形成無顯著影響。

2.2 葉面噴施處理對產(chǎn)量的影響

2.2.1對處理后第二年薪萌發(fā)地上部分重量的影響 本次試驗因故未能統(tǒng)計秋冬季的芽形成數(shù)目，但擬巫山淫羊藿在秋冬季形成的芽的數(shù)目越多，第二年新形成的植株地上部分產(chǎn)量就越多，因此也可以通過評價第二年新萌發(fā)地上部分重量來評價不同處理對冬芽形成的影響。

表2 不同處理對擬巫山淫羊藿中平均每株芽數(shù)目的影響

注：同列標相同字母表示處理之間差異無統(tǒng)計學意義，標不同字母表示處理之間差異具有統(tǒng)計學意義，P<0.05。

從圖1可以看出6-BA 60 mg·L-1的處理組新萌發(fā)地上部分重量顯著高于其他組，與清水對照組相比，重量增加22.76%(P<0.05)；60 mg·L-1的6-BA與300 m·L-1的尿素綜合處理組與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義，但比60 mg·L-1的6-BA處理組的重量少21.82%(P<0.05)。

注：不同字母表示兩處理之間差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，相同字母表示兩處理之間差異無統(tǒng)計學意義。圖1 不同處理對擬巫山淫羊藿產(chǎn)量的影響

2.2.2 對老地上部分重量的影響 老地上部分為第二年6月初采收的植株中的上一年形成的部分。

實驗發(fā)現(xiàn)6-BA 60 mg·L-1的老地上部分重量最高，較清水對照組增加38.49%。增加尿素的綜合處理(U 300 mg·L-1+6-BA 60 mg·L-1)與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義，但是比6-BA 60 mg·L-1處理組重量顯著降低18.1%(P<0.05)。

2.3 不同處理對淫羊藿苷類成分含量的影響

擬巫山淫羊藿中朝藿定C的含量占總淫羊藿苷類含量(四種淫羊藿苷類成分含量之和)的85%以上，因此本文總的淫羊藿苷類含量與朝藿定C含量變化一致。

從表3可以看出，在灌根處理實驗中，各處理因素對新萌發(fā)的成熟葉片中朝藿定C和總的淫羊藿苷類黃酮成分的量無顯著影響。噴葉處理促進根芽形成實驗中，各處理組對老葉成熟葉片中朝藿定C的含量與對照組相比均差異無統(tǒng)計學意義，僅6-BA 90 mg·L-1處理組總淫羊藿苷類黃酮成分含量低于對照組，較對照組低6.8%(P<0.05)；各處理組對第二年新生成熟葉片中朝藿定C及總淫羊藿苷的含量與對照組相比均差異無統(tǒng)計學意義，僅6-BA 60 mg·L-1處理組朝藿定A、朝藿定B及淫羊藿苷的含量相對較低。

表3 不同處理對擬巫山淫羊藿中淫羊藿苷類黃酮成分含量的影響

注：同列標相同字母表示處理之間差異無統(tǒng)計學意義，標不同字母表示處理之間差異具有統(tǒng)計學意義，P<0.05。

3 擬巫山淫羊藿根芽發(fā)育及影響因素

在根芽形成初期(從8月開始)，主要形成較多的一級芽，在芽形成中后期，在一級芽的基礎上，才形成較多的二級芽，也繼續(xù)有一級芽形成。11月中旬為芽形成的中后期。灌根促進根芽形成實驗發(fā)現(xiàn)300 mg·L-1的尿素和60 mg·L-1的6-BA的綜合處理顯著促進二級芽數(shù)目進而提高總芽數(shù)目，前期實驗發(fā)現(xiàn)該綜合處理同樣也是噴根處理促進采收后再萌發(fā)的最適合處理[7]，進一步驗證了兩者作用的一致性，可能都是主要通過打破頂端優(yōu)勢促進腋芽膨大或萌發(fā)，但是具體機制有待進一步深入實驗探討。單獨的6-BA或尿素處理均沒有表現(xiàn)出顯著促進根芽數(shù)目的效果。其他研究也發(fā)現(xiàn)氮素和6-BA配合使用顯著提高了小麥分蘗節(jié)ZT含量，降低了內(nèi)源ABA、GA3含量，進而顯著增加小麥分蘗發(fā)生率，顯著提高了分蘗芽長度、鮮重[9]。

6-BA 60 mg·L-1的噴葉處理組淫羊藿的次年新萌發(fā)地上部分重量顯著高于其他組，該處理組老地上部分重量也顯著較對照組高，說明通過葉面噴施6-BA提高產(chǎn)量可能是6-BA處理增加光合速率，延緩衰老，使當年積累營養(yǎng)物質(zhì)較多，進而增加冬芽數(shù)目提高第二年產(chǎn)量。研究發(fā)現(xiàn)6-BA可能通過增加光合速率、抑制葉綠素降解，抑制氧自由基對植物的侵害及膜脂過氧化程度的加深，使葉片保持較高的抗氧化酶活性，從而延緩葉片衰老，例如300 mg·L-1的6-BA處理延緩牡丹葉片衰老[10]；12 g·L-1硝酸鉀和10 mg·g-16-BA 綜合處理可明顯改善假儉草Eremochloaophiuroides(Munro)Hack.的生長，抑制其葉綠素的分解[11]；氨基酸硒和6-BA處理可有效延緩葡萄葉片衰老[12]；5 mg·L-16-BA的保鮮劑能有效延長月季切花的瓶插壽命[13]；適宜濃度的6-BA處理能夠提高厚皮甜瓜坐果節(jié)位葉片光能利用效率[14]。 此外6-BA處理可顯著降低采后西蘭花的總呼吸強度，延緩西蘭花褪綠黃化[15]，延緩玉米根系的衰老及延緩葉片衰老，使成熟期綠葉面積增加，顯著增加吐絲期-成熟期植株吸氮量和植株干物質(zhì)積累量，顯著提高單株子粒產(chǎn)量[16]。同樣濃度的6-BA濃度和300 mg·L-1尿素綜合處理時，產(chǎn)量的提高并不顯著，說明通過葉面噴施處理時，尿素的存在反而削弱了6-BA的促進作用。

實驗發(fā)現(xiàn)通過噴葉處理單獨的6-BA 60 mg·L-1處理即可以增加老葉重量，進而促進新芽形成和萌發(fā)增加產(chǎn)量，而通過灌根處理時，6-BA 60 mg·L-1和尿素300 mg·L-1綜合處理更有利于芽數(shù)目的增多，說明葉片與根系對6-BA和尿素的吸收利用存在一定差異，尿素是有機態(tài)氮肥，經(jīng)過土壤中的脲酶作用，水解成碳酸銨或碳酸氫銨后，才能被作物吸收利用，葉片對尿素的吸收利用低于根系，氮素和6-BA只有在根系施用時才會發(fā)揮互作效應。但是噴葉和灌根促進芽形成進而提高產(chǎn)量的機理和效果有何不同及是否可以同時進行灌根和噴葉處理還有待進一步研究。

此外實驗發(fā)現(xiàn)葉面噴灑30 mg·L-16-BA或與300 mg·L-1尿素混合噴施，或90 mg·L-16-BA葉面噴施均能顯著提高植株的花枝數(shù)比例，這在采種田上可用來促進開花結果。其他研究發(fā)現(xiàn)1 500 mg·L-1的6-BA可以顯著促進花芽的分化，而濃度為500 mg·L-1時有抑制花芽分化的作用[17]，一定濃度6-BA 處理可以顯著提高富士蘋果幼樹短枝頂芽成花率[18]。

4 結論

300 mg·L-1的尿素和60 mg·L-1的6-BA的綜合處理灌根或6-BA 60 mg·L-1噴葉處理可顯著促進擬巫山淫羊藿根芽形成，且對成熟葉片中的朝藿定C和總淫羊藿苷類成分不產(chǎn)生顯著影響。