魯靜，牛曉靜，段曉穎*

1.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 藥學(xué)部，河南 鄭州 450000；2.中藥臨床評價技術(shù)河南省工程實驗室，河南 鄭州 450000

淫羊藿為小檗科植物淫羊藿EpimediumbrevicornuMaxim.、箭葉淫羊藿Epimediumsagittatum(Sieb.et Zucc.)Maxim.、柔毛淫羊藿EpimediumpubescensMaxim.或朝鮮淫羊藿EpimediumkoreanumNakai的干燥葉，味辛、甘，性溫，歸肝、腎經(jīng)，具有補腎陽、強筋骨、祛風(fēng)濕的作用，用于腎陽虛衰、陽痿遺精、筋骨痿軟等[1]。淫羊藿多糖為淫羊藿中有效活性成分之一，具有抗腫瘤、抗衰老、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫、抗病毒等功能[2-6]。

目前，已有多種方法可以分離提純淫羊藿多糖，包括煎煮法、浸提法、超聲法、微波輔助提取法、酶提取法、超高壓提取法等[7-12]。但煎煮法能耗較高，超聲處理會影響多糖的結(jié)構(gòu)和活性[13]；而酶法提取對酶促反應(yīng)條件要求嚴(yán)格。此外，微波法、超聲法和酶提取法在工業(yè)化生產(chǎn)中尚未廣泛應(yīng)用。本實驗采用均勻設(shè)計法，優(yōu)選淫羊藿多糖的熱水浸提工藝，為其有效開發(fā)、利用提供保障。

1 儀器與試藥

Thermo Evolution 201紫外可見光分光光度計(美國賽默飛世爾科技公司)；BSA224S-CW電子天平(德國賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；HH-S4電子恒溫水浴鍋(北京科偉永興儀器有限公司)；LXJ-IIB離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠)。

無水葡萄糖對照品(批號：110833-200503，中國食品藥品檢定研究院)；蒽酮、無水乙醇、濃硫酸為分析純。

淫羊藿藥材購自河南中一醫(yī)藥經(jīng)營有限公司，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部陳天朝主任藥師鑒定，符合《中華人民共和國藥典》2015年版一部淫羊藿項下相關(guān)要求。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備

取干燥至恒重的無水葡萄糖對照品適量，精密稱定，加水制成每1 mL含0.107 mg的葡萄糖對照品溶液，即得。

2.2 供試品溶液的制備

取淫羊藿藥材10 g，精密稱定，按照設(shè)定的條件提取，過濾，取濾液適量，加入無水乙醇(4倍體積)，搖勻，4 ℃放置12 h，4000 r·min-1離心20 min，棄去上清液，沉淀用水溶解，轉(zhuǎn)移并定容至100 mL，搖勻，即得。

2.3 最大吸收波長的確定

精密吸取葡萄糖對照品溶液0.2 mL，置于10 mL具塞刻度試管，加水至2 mL，搖勻，迅速精密加入0.1%蒽酮硫酸溶液6 mL，混勻，于沸水浴中加熱15 min，取出，立即置冰水浴中冷卻15 min，取出，以蒸餾水為空白，進行同樣的顯色操作，采用紫外-可見分光光度計進行掃描，掃描波長范圍為400～800 nm。另取供試品溶液2 mL，同法操作。結(jié)果顯示，葡萄糖對照品及淫羊藿多糖顯色后均在625 nm處有最大吸收峰，見圖1～2。

圖1 葡萄糖對照品顯色后400～800nm全波長掃描圖

圖2 淫羊藿多糖顯色后400～800nm全波長掃描圖

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密吸取葡萄糖對照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，按2.3項下方法顯色，在625 nm處測定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=11.279X+0.020 6(r=0.999 5)，結(jié)果表明，葡萄糖在0.010 7～0.064 2 mg·mL-1與吸光度線性關(guān)系良好。

2.5 精密度試驗

精密吸取供試品溶液2 mL，按2.3項下方法顯色并測定吸光度，重復(fù)測定6次，記錄吸光度，RSD為0.37%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

精密吸取供試品溶液2 mL，按2.3項下方法顯色，每5 min測定1次吸光度，30 min內(nèi)RSD為0.72%，表明供試品溶液在30 min內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 加樣回收率試驗

稱取淫羊藿藥材5 g，精密稱定，共6份，分別加入葡萄糖對照品適量，按2.2項下制成供試品溶液，再按2.3項下方法顯色并測定吸光度，平均回收率為99.7%，RSD為2.31%，表明方法回收率良好。

2.8 樣品含量測定

精密吸取供試品溶液2 mL，按2.3項下方法顯色并測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算供試品溶液中多糖含量。

2.9 均勻試驗設(shè)計

多糖收率(%)=供試品溶液中多糖濃度×
供試品溶液總體積×濾液總體積/
濾液量取量/藥材質(zhì)量×100%

(1)

表因素水平表

表2 均勻設(shè)計試驗及結(jié)果

表3 均勻設(shè)計試驗對各回歸系數(shù)的檢驗結(jié)果

對回歸方程進行規(guī)劃求解，得到淫羊藿多糖最佳熱水浸提條件為液料比25 mL·g-1、提取溫度90 ℃、提取時間140 min、提取次數(shù)3次，此時多糖收率為1.13%。

2.10 工藝驗證

取淫羊藿藥材100 g，共3份，按所得到的最佳提取工藝條件進行驗證試驗，按2.2項下制成供試品溶液，按2.8項下含量測定法進行測定，得到淫羊藿多糖收率分別為1.08%、1.09%和1.11%，與預(yù)測值接近，說明回歸方程預(yù)測基本準(zhǔn)確，優(yōu)化后的實驗條件可靠，結(jié)果重復(fù)性好。

3 討論

目前對多糖的定量主要采用經(jīng)典的紫外掃描方法，最常用的為硫酸-蒽酮法和苯酚-硫酸法。苯酚-硫酸法需要使用重蒸酚[14]，硫酸-蒽酮法試劑需要現(xiàn)配，且反應(yīng)及冷卻時間應(yīng)嚴(yán)格控制[15]，本實驗選用硫酸-蒽酮法測定多糖含量。

實驗中考察了醇沉濃度(含醇量50%～90%)對淫羊藿多糖提取率的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，含醇量為80%時，多糖提取率最高，故選擇醇沉濃度為含醇量80%?？疾炝舜汲?xí)r間(6～24 h)對多糖提取率的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，醇沉?xí)r間大于12 h時，多糖提取率趨于穩(wěn)定，故選擇醇沉?xí)r間為12 h。

均勻設(shè)計法只考慮試驗點在試驗范圍內(nèi)均勻分布，每個因素僅需用一次，與正交試驗相比，大幅減少了次數(shù)，不僅節(jié)省時間，而且節(jié)約資源，適合用來優(yōu)化工藝條件。本實驗采用均勻設(shè)計法對熱水浸提淫羊藿多糖的工藝條件進行優(yōu)化，結(jié)果表明，液料比、提取溫度、提取時間之間存在交互作用，驗證試驗得到的淫羊藿多糖的提取率與預(yù)測值相符。所建立的熱水浸提工藝穩(wěn)定、可行，為淫羊藿多糖進一步的研究和開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。