何效平,王柏強,曾芝蘭,羅飛,羅巧林
川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 藥劑科,四川 南充 637000
玫瑰花為薔薇科薔薇屬多年生灌木玫瑰的干燥花蕾,是一種藥食同源的花卉,具有良好的食用價值與保健功能。玫瑰花中含有多種生物活性物質(zhì),黃酮類化合物就是其中之一。黃酮類化合物具有抗氧化、抗菌、降糖、抗病毒、抗抑郁等生物活性。國內(nèi)對玫瑰花總黃酮的提取進(jìn)行了大量研究,常見提取方法主要有水提取法、有機溶劑提取法、超聲波提取法、微波提取法等[1-4]。但國內(nèi)采用超聲波聯(lián)合纖維素酶提取玫瑰花總黃酮的研究尚未見報道,本文以總黃酮提取率作為評價指標(biāo),采用超聲波聯(lián)合纖維素酶提取玫瑰花總黃酮,在單因素考察的基礎(chǔ)上,采用正交試驗設(shè)計優(yōu)化提取工藝條件,為進(jìn)一步開發(fā)玫瑰深加工產(chǎn)品提供參考。
760CRT雙光束紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限公司);PHS-SB型pH計(成都瑞馳分析控制儀器有限公司);TP-114電子分析天平(德國賽多利斯股份有限公司);SB-25-12DT型超聲波提取器(寧波新芝生物科技股份有限公司);HH-2 數(shù)顯恒溫水浴鍋(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)。
玫瑰花由重慶源邦醫(yī)藥公司提供,經(jīng)川北醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院李生茂老師鑒定為薔薇科植物玫瑰RosarugosaThunb.的干燥花蕾。
蘆丁對照品(中國食品藥品檢定研究院,批號:0080-200707);纖維素酶(活性單位≥15 U·mg-1,上海伯奧生物科技有限公司);其他試劑均為分析純。
將玫瑰花篩選去除雜質(zhì)后剪碎,置于烘箱中40 ℃下干燥至恒重,粉碎后過20目篩,備用。
2.2.1 蘆丁對照品溶液的制備 將蘆丁對照品于105 ℃下干燥至恒重,精密稱取20 mg,轉(zhuǎn)移至50 mL棕色量瓶中,60%乙醇溶解并定容,得到質(zhì)量濃度為0.4 mg·mL-1的蘆丁對照品溶液。
2.2.2 測定波長的選擇 精密量取對照品溶液1.0 mL置于25 mL容量瓶中,按順序依次加入5%亞硝酸鈉溶液1 mL,混勻,靜置6 min;加10%硝酸鋁溶液1 mL,混勻,靜置6 min;10%氫氧化鈉溶液10 mL,60%乙醇定容至刻度,靜置15 min。同法配制空白溶液[5-8]。用紫外-可見分光光度計在400~800 nm波長范圍內(nèi)掃描,結(jié)果顯示,最大吸收波長為510 nm。見圖1。
圖1 蘆丁對照品顯色后掃描圖
2.2.3 方法學(xué)考察 線性關(guān)系考察[8]:精密量取上述蘆丁對照品溶液0、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0 mL,轉(zhuǎn)移至6支25 mL量瓶中,按2.2.2項下顯色方法依法操作。用添加0.0 mL對照品溶液的試管做空白對照,在510 nm波長處測定不同濃度溶液的吸光度,對不同蘆丁質(zhì)量濃度和對應(yīng)吸光度作圖,線性回歸得到蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線:Y=2.838 4X-0.026 1,r=0.999 8,蘆丁濃度在0.2~2.4 mg線性關(guān)系良好。
精密度試驗:精密量取對照品溶液1 mL,置于25 mL容量瓶中,采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色法,在510 nm波長處重復(fù)測定6次,吸光度值的RSD值為0.6%。
穩(wěn)定性試驗:精密量取藥材提取液1 mL,置于25 mL容量瓶中,采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色法,于靜置15 min后0、1、2、4、6、8 h依法測定,結(jié)果吸光度值的RSD值為1.2%。
重復(fù)性試驗:精密量取藥材提取液1 mL,置于25 mL容量瓶中,同法操作6份。采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色法顯色后依法測定,結(jié)果顯示吸光度值的RSD值為0.9%。
加樣回收試驗:精密吸取適量藥材提取液置于25 mL量瓶中,分別加入對照品溶液(質(zhì)量濃度為0.4 mg·mL-1)5.0、2.0、0.5 mL,然后采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色法測定吸光度值,計算回收率。結(jié)果平均回收率為99.41%,RSD=1.5%。
2.2.4 樣品總黃酮含量測定 精密吸取待測玫瑰花總黃酮粗提液1 mL置于25 mL容量瓶中,采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色法,在510 nm波長處測得粗提液的吸光度,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出粗提液中總黃酮的質(zhì)量濃度。然后,按照公式(1)計算玫瑰花中總黃酮的提取率。
(1)
2.3.1 酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)對玫瑰花總黃酮提取的影響 稱取5 g干燥至恒重的玫瑰花粉末,按固液比1∶20的比例加入到60%乙醇溶液中,浸泡15 min后分別加占玫瑰花質(zhì)量0、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的纖維素酶溶解,調(diào)節(jié)溶液pH為5,在40 ℃恒溫水浴鍋中酶解90 min,30 min攪拌一次。待酶解完成后再置于超聲波提取器中60 ℃超聲提取30 min,抽濾,濾液定容,取樣測總黃酮含量,然后計算總黃酮提取率。結(jié)果見圖2。
圖2 酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)對玫瑰花總黃酮提取的影響
由圖可知,隨著纖維素酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)的提高,總黃酮提取率逐漸增大,當(dāng)纖維素酶用量占玫瑰花質(zhì)量的0.4%時,酶解反應(yīng)效率和總黃酮提取率最高;超過0.4%后總黃酮提取量反而有所下降,故適宜的纖維素酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%~0.5%。
2.3.2 酶解溫度對玫瑰花總黃酮提取的影響 稱取5 g干燥至恒重的玫瑰花粉末,按1∶20的固液比加入到60%乙醇溶液中,浸泡15 min后加占玫瑰花質(zhì)量0.4%的纖維素酶溶解,調(diào)節(jié)溶液pH為5,分別在20、30、40、50、60 ℃恒溫水浴鍋中酶解90 min,每30 min攪拌一次。酶解完成后再置于超聲波提取器60 ℃超聲提取30 min,抽濾,濾液定容,取樣測總黃酮含量,然后計算總黃酮提取率。結(jié)果見圖3。
圖3 酶解溫度對紫蘇葉總黃酮提取效果的影響
由圖可知,在20~50 ℃,隨著酶解溫度的提高,玫瑰花總黃酮提取率逐漸增加,達(dá)到50 ℃后繼續(xù)升高溫度,總黃酮提取率反而呈下降趨勢。適宜的溫度有利于保持酶的活性,溫度過高易導(dǎo)致酶變性失活。因此,酶解溫度在40~60 ℃為宜。
2.3.3 固液比對玫瑰花總黃酮提取的影響 稱取5 g干燥至恒重的玫瑰花粉末,分別按1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30的固液比加入到60%乙醇溶液中,浸泡15 min后加占玫瑰花質(zhì)量0.4%的纖維素酶溶解,調(diào)節(jié)溶液pH為5,在50 ℃溫度恒溫水浴鍋中酶解90 min,30 min攪拌一次。酶解完成后再于超聲波提取器中60 ℃超聲提取30 min,抽濾,濾液定容,取樣測總黃酮含量,然后計算總黃酮提取率。結(jié)果見圖4。
由圖可知,隨著提取溶劑用量的增加,玫瑰花總黃酮提取率逐漸增大,當(dāng)固液比達(dá)到1∶20后再增加料液比,提取率增加不明顯??紤]到經(jīng)濟(jì)性及后處理過程,選擇固液比為1∶15~1∶25較為合理。
圖4 固液比對玫瑰花總黃酮提取效果的影響
2.3.4 乙醇濃度對玫瑰花總黃酮提取的影響 稱取5 g干燥至恒重的玫瑰花粉末,按1∶20的固液比分別加入到30%、40%、50%、60%、70%、80%乙醇溶液中,浸泡15 min后加占玫瑰花質(zhì)量0.4%的纖維素酶溶解,調(diào)節(jié)溶液pH為5,在50 ℃溫度恒溫水浴鍋中酶解90 min,30 min攪拌一次。酶解完成后再超聲波提取器中60 ℃超聲提取30 min,抽濾,濾液定容,取樣測總黃酮含量,然后計算總黃酮提取率。結(jié)果見圖5。
圖5 乙醇濃度對玫瑰花總黃酮提取效果的影響
由圖可知,隨著乙醇濃度的增大玫瑰花黃酮提取率逐漸增大,乙醇濃度為30%~60%時增加速率較快,70%以后醇溶性雜質(zhì)溶出明顯增多,同時抑制纖維素酶的活性,導(dǎo)致總黃酮提取率反而有所下降。故選擇乙醇濃度60%為宜。
2.3.5 超聲提取時間對玫瑰花總黃酮提取的影響 稱取5 g干燥至恒重的玫瑰花粉末,按1∶20的固液比加入到60%乙醇溶液中,浸泡15 min后加占玫瑰花質(zhì)量0.4%的纖維素酶溶解,調(diào)節(jié)溶液pH為5,在50 ℃溫度恒溫水浴鍋中酶解90 min,30 min攪拌一次。待酶解完成后再于60 ℃分別超聲提取10、20、30、40、50 min,抽濾,得到濾液,定容,取樣測總黃酮含量,然后計算總黃酮提取率。結(jié)果見圖6。
圖6 超聲時間對玫瑰花總黃酮提取效果的影響
由圖可知,當(dāng)超聲時間在10~30 min時,隨著時間的延長,玫瑰花總黃酮提取率逐漸增加,超過30 min后增加效果不明顯,同時雜質(zhì)溶出量也逐漸增大。因此超聲時間控制在20~40 min為宜。
2.3.6 超聲溫度對玫瑰花總黃酮提取的影響 稱取5 g干燥至恒重的玫瑰花粉末,按1∶20的固液比加入到60%乙醇溶液中,浸泡15 min后加占玫瑰花質(zhì)量0.4%的纖維素酶溶解,調(diào)節(jié)溶液pH為5,在50 ℃溫度恒溫水浴鍋中酶解90 min,30 min攪拌一次。待酶解完成后再分別于40、50、60、70、80 ℃超聲提取30 min,抽濾,得到濾液,定容,取樣測總黃酮含量,然后計算總黃酮提取率。結(jié)果見圖7。
圖7 超聲溫度對紫蘇葉總黃酮提取效果的影響
由圖可知,隨著超聲溫度的提高,玫瑰花總黃酮提取率逐漸上升,到60 ℃后再升高溫度,總黃酮提取率變化緩慢,70 ℃后由于溫度過高,雜質(zhì)溶出量也逐漸增大,導(dǎo)致后續(xù)處理困難。因此,超聲提取溫度選擇在60 ℃比較合適。
根據(jù)以上單因素考察結(jié)果,選取影響因素較大的固液比、酶解溫度、酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)、超聲時間4個因素作為考察因素,以總黃酮提取率為評價指標(biāo),選擇L9(34)正交試驗表(見表1)設(shè)計正交試驗,并對結(jié)果進(jìn)行直觀分析(見表2)和方差分析(見表3)。
表1 因素水平表
表2 正交試驗結(jié)果
表3 方差分析
由表2直觀分析可知,各因素對超聲聯(lián)合纖維素酶法提取玫瑰花總黃酮的影響依次為固液比>酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)>超聲時間>酶解溫度;方差分析結(jié)果表明,固液比、酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)、超聲時間對提取工藝差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),酶解溫度對提取工藝差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。根據(jù)正交試驗及方差分析結(jié)果確定最佳工藝條件為A3B2C2D2,即固液比1∶25,酶解溫度50 ℃,酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.4%,超聲時間30 min。按優(yōu)選的提取工藝條件進(jìn)行5次驗證試驗:稱取5 g干燥至恒重的玫瑰花粉末,按1∶25的固液比加入到60%乙醇溶液中,浸泡15 min后加占玫瑰花質(zhì)量0.4%的纖維素酶溶解,調(diào)節(jié)溶液pH為5,在50 ℃溫度恒溫水浴鍋中酶解90 min,30 min攪拌一次。待酶解完成后再于60 ℃超聲提取30 min,抽濾,得到濾液,定容,測定指標(biāo)。結(jié)果總黃酮提取率平均值為(4.06±0.93)%,表明該提取工藝條件穩(wěn)定、可行。
本實驗在充分研究各因素對總黃酮提取率影響的基礎(chǔ)上,通過正交試驗對玫瑰花總黃酮提取的工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化,取得了較好的效果,使總黃酮提取率達(dá)到4.06%,是一種較高效的提取方法。
超聲聯(lián)合酶法可從多方面促進(jìn)藥材有效成分的提取,首先運用纖維素酶破壞細(xì)胞壁中的纖維素,以加快有效成分的釋放。其次,利用超聲波的機械效應(yīng)、空化效應(yīng)及熱效應(yīng),通過增大介質(zhì)分子的運動速度,增大介質(zhì)的穿透力以提取中藥有效成分[9]。該法提取條件溫和,提取中所采用的酶安全、價廉,同時還可減少有機溶劑的使用量,所以本工藝比傳統(tǒng)提取工藝更加經(jīng)濟(jì)、環(huán)保。