史達源，徐家偉，孫瑩璞

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，河南省生殖與遺傳重點實驗室，鄭州 450052)

遺傳性疾病是導(dǎo)致新生兒出生缺陷的重要原因之一，目前部分遺傳病缺乏有效的治療方法?！吨袊錾毕莘乐螆蟾?012》[1]指出，我國出生缺陷發(fā)生率約為5.6%，每年新增出生缺陷約90萬例，包括單基因病和染色體病的新生兒，給患者家庭造成了極大的負擔(dān)。近年來，植入前遺傳學(xué)檢測(preimplantation genetic testing，PGT)技術(shù)的發(fā)展逐步應(yīng)用于單基因病、染色體病等遺傳性疾病的預(yù)防，為高齡和反復(fù)流產(chǎn)的患者帶來了希望，通過對植入子宮前的胚胎進行遺傳學(xué)檢測，選擇不攜帶致病基因和異常染色體的整倍體胚胎移植，能夠提高IVF患者的妊娠率，阻斷遺傳性疾病向子代傳遞。

一、PGT技術(shù)的進展

1990年國際首例PGT試管嬰兒誕生[2]，標志著試管嬰兒技術(shù)出現(xiàn)突破性進展，遺傳病患者可以生育健康后代。早期，針對遺傳病和反復(fù)不孕患者的PGT分為兩部分：植入前遺傳學(xué)診斷(preimplantation genetic diagnosis，PGD)和植入前遺傳學(xué)篩查(preimplantation genetic screening，PGS)[3]。PGD適用于單基因病和染色體病的患者，PGS適用于女方高齡、反復(fù)流產(chǎn)、反復(fù)種植失敗和嚴重男性因素不育的患者。2017年，國際輔助生殖技術(shù)監(jiān)控委員會對PGT進行了新的分類，包括三部分：植入前胚胎單基因遺傳學(xué)檢測(PGT for monogenic/single gene defects，PGT-M)、植入前胚胎染色體結(jié)構(gòu)變異遺傳學(xué)檢測(PGT for chromosomal structural rearrangement，PGT-SR)和植入前胚胎非整倍體遺傳學(xué)篩查(PGT for aneuploidy，PGT-A)[4]。單基因病患者攜帶的致病基因遺傳給子代，會導(dǎo)致子代患病，加重家庭負擔(dān)。PGT-M可以篩選出不攜帶致病基因的胚胎用于移植，獲得健康后代。易位、倒位、重復(fù)、缺失等染色體結(jié)構(gòu)異常的患者會形成染色體核型不平衡的配子和胚胎，導(dǎo)致胚胎反復(fù)種植失敗和早期流產(chǎn)[5-6]。PGT-SR可以發(fā)現(xiàn)胚胎的拷貝數(shù)變異(CNV)，移植不攜帶缺失和重復(fù)的整倍體胚胎。非整倍體作為人類胚胎中最常見的遺傳學(xué)異常，是導(dǎo)致早期流產(chǎn)最常見的原因之一[5，7]。對于接受IVF助孕的患者，PGT-A尤其適用于女方高齡、反復(fù)流產(chǎn)、反復(fù)種植失敗和嚴重男性因素不育的患者[3]。

隨著PGT技術(shù)的發(fā)展，檢測準確性不斷提高，患者的臨床結(jié)局獲得改善。早期，通過熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)進行PGT-A，評估染色體整倍性，但由于其檢測染色體數(shù)目有限和卵裂球活檢對胚胎的影響，未能改善IVF結(jié)局[8]。定量聚合酶鏈式反應(yīng)(quantitative polymerase chain reaction，qPCR)在4 h內(nèi)快速檢測24條染色體的整倍性，可在同一周期行新鮮胚胎移植[9]。近年來，單細胞全基因組擴增技術(shù)的發(fā)展可以對24條染色體進行全部染色體篩查(comprehensive chromosome screening，CCS)。微陣列比較基因組雜交(array comparative genomic hybridization，aCGH)技術(shù)可檢測全部染色體的非整倍體和大于10 Mb的非整倍體片段[10-11]。單核苷酸多態(tài)性微陣列(single nucleotide polymorphism array，SNP array)芯片覆蓋了基因組上約300 000個SNPs位點，能檢測全部染色體的拷貝數(shù)變異、微重復(fù)微缺失、單基因病和單親二倍體[12-13]。二代測序(next generation sequencing，NGS)技術(shù)因其高通量、低成本、邊合成邊測序等優(yōu)勢被廣泛應(yīng)用，能檢測全部染色體的非整倍體、嵌合體、基因組和線粒體拷貝數(shù)變異、單基因病[14]。

目前廣泛使用的PGT技術(shù)存在一定局限性。單細胞全基因組擴增(whole genome amplification，WGA)由于起始DNA量少，可能引起等位基因脫扣(allele dropout，ADO)，雜合子中的一個等位基因擴增失敗，導(dǎo)致該位點被錯誤檢測為純合子，影響診斷準確性。染色體相互易位和羅氏易位是引起出生缺陷、不孕和反復(fù)流產(chǎn)的常見原因。CCS技術(shù)可以檢測全部24條染色體整倍性，但無法區(qū)分正常核型與攜帶染色體易位的整倍體胚胎。移植易位攜帶狀態(tài)的胚胎會使子代同樣遭受反復(fù)流產(chǎn)和不孕的風(fēng)險。針對以上問題，近來有新技術(shù)方法能夠減少誤診、提高診斷準確性。

二、PGT技術(shù)在單基因病阻斷中的應(yīng)用

目前已知有7 000多種單基因遺傳病，超過一半有明確的致病基因[15]。大部分單基因病會導(dǎo)致先天畸形、疾病或死亡，給患者家庭和社會醫(yī)療保健系統(tǒng)帶來沉重負擔(dān)。罕見病是一類嚴重影響人類健康的疾病，80%由于基因缺陷導(dǎo)致[16]，具有基因缺陷的罕見病患者通過PGT-M可以獲得健康后代。1990年第一例PGT-M通過擴增Y染色體特異性重復(fù)序列，移植不包含Y染色體的胚胎，避免了X連鎖隱性遺傳病患者生育患病子代[2]。自PGT-M誕生以來，經(jīng)歷了20多年的臨床應(yīng)用，成功阻斷了杜氏肌營養(yǎng)不良、苯丙酮尿癥、多囊腎、Alport綜合征等多種單基因疾病向子代傳遞。近年來，單基因病檢測技術(shù)不斷提高，能準確識別攜帶致病基因的染色體，并檢測拷貝數(shù)變異。

1.Karyomapping技術(shù)識別攜帶致病基因的染色體：WGA的局限性之一是ADO。Karyomapping技術(shù)通過對雙親、待測胚胎和患病親屬DNA進行SNP分析，能夠檢測遺傳物質(zhì)的親本來源[17-18]，有效降低了ADO導(dǎo)致的誤診。該技術(shù)首先要尋找親本中攜帶者為雜合、另一方為純合的有效SNPs，然后與患病親屬的SNPs進行比較，確定攜帶致病突變的單體型。最后，根據(jù)胚胎中SNPs，篩選出不攜帶致病突變的胚胎用于移植。

該技術(shù)的優(yōu)勢在于，能同時診斷單基因病和胚胎非整倍體，已成功應(yīng)用于多種遺傳病的植入前診斷，并獲得健康新生兒[19-20]。然而，Karyomapping技術(shù)存在一定的局限性：需要患病親屬的DNA樣本進行連鎖分析；如果突變基因附近發(fā)生染色體重組，可能會導(dǎo)致SNP位點失效；對于近親結(jié)婚的患者，需要結(jié)合傳統(tǒng)PCR技術(shù)進行驗證。

2. 非整倍體測序與連鎖分析(mutated allele revealed by sequencing with aneuploidy and lingkage analyses，MARSALA)同時檢測單基因病和胚胎非整倍體：MARSALA是Yan等[21]研發(fā)的一種基于二代測序的PGT技術(shù)，能同時檢測單基因病和染色體異常，并進行連鎖分析。該技術(shù)將囊胚滋養(yǎng)外胚層活檢細胞通過多次退火環(huán)狀循環(huán)擴增技術(shù)(MALBAC)進行全基因組擴增，然后針對基因突變區(qū)域進行特異性擴增，運用低測序深度(0.1-2X)的二代測序準確檢測染色體整倍性和單核苷酸變異。目前，MARSALA技術(shù)已成功應(yīng)用于常染色體顯性、隱性遺傳病和X連鎖遺傳病患者，并且獲得了不攜帶致病基因的健康新生兒[22]。

Wu等[23]在經(jīng)典MARSALA的基礎(chǔ)上，對多個單精子進行全基因組擴增，3X測序深度尋找有效SNP進行連鎖分析，無需特定引物和患病家庭成員的檢測。運用單精子連鎖分析，該團隊為β地中海貧血相關(guān)基因HBB均為雜合突變的夫婦移植了不攜帶突變的整倍體胚胎，獲得了臨床妊娠，并且羊水檢測證明了該技術(shù)的準確性。傳統(tǒng)的NGS技術(shù)檢測點突變需要30X測序深度。MARSALA技術(shù)使用低測序深度能同時檢測非整倍體和突變位點，測序成本低，但該技術(shù)無法檢測新發(fā)突變。

3.qPCR特異性檢測突變位點：TaqMan qPCR為基礎(chǔ)的PGT技術(shù)，成本低，可以廣泛應(yīng)用，且其可同時檢測單基因病和非整倍體，能夠在4～6 h內(nèi)完成檢測，因此患者可以在子宮內(nèi)膜容受性移植窗內(nèi)進行新鮮胚胎移植。該技術(shù)具有極低的ADO發(fā)生率和極高的結(jié)果一致性，無需進行全基因組擴增，使用TaqMan探針通過位點特異性擴增可以直接靶向檢測突變位點。

有研究運用TaqMan qPCR對43例單基因病患者的304枚胚胎進行PGT，篩選出39枚不攜帶致病基因的整倍體胚胎進行移植，最終有27位患者成功分娩[24]。然而，脆性X綜合征和亨廷頓舞蹈病等疾病存在三核苷酸重復(fù)，無法通過qPCR基因型探針直接檢測突變，需要對患者家系突變基因附近的SNPs進行連鎖分析。對于TaqMan qPCR可以直接檢測的突變，連鎖分析可以避免ADO造成的誤診。

4.長讀長測序(long read sequencing)在長片段結(jié)構(gòu)變異的單基因病中的應(yīng)用：目前，通常使用全外顯子組測序(WES)或全基因組測序(WGS)檢測單基因遺傳病的突變位點，但由于模板DNA捕獲效率不足、測序覆蓋偏倚等問題，某些結(jié)構(gòu)變異未被發(fā)現(xiàn)。Miao等[25]通過Nanopore全基因組長讀長測序技術(shù)，發(fā)現(xiàn)了WES短讀測序未能捕獲到的G6PC等位基因上的7.1 kb雜合缺失，結(jié)合WES檢測到的另一個等位基因上的點突變，鑒定出患者家系常染色體隱性遺傳方式的糖原貯積病Ia型的發(fā)病原因和致病基因來源。聯(lián)合定量PCR和微衛(wèi)星連鎖分析，篩選出僅攜帶母源點突變的胚胎進行移植，成功分娩了一個健康女嬰。

長讀長測序技術(shù)，具有超長讀長、極低GC偏好性等優(yōu)勢，可以精確檢測結(jié)構(gòu)變異、串聯(lián)重復(fù)序列，彌補了短讀測序的不足[26-27]。雖然長讀長測序技術(shù)檢測時間長、成本高，但對于人類基因復(fù)雜序列拼接和致病性的人類基因組結(jié)構(gòu)變異檢測有巨大潛力，可有效阻斷單基因病和復(fù)雜結(jié)構(gòu)變異向子代傳遞，在未來PGT中有重要發(fā)展前景。

三、PGT技術(shù)在染色體平衡易位胚胎識別中的應(yīng)用

染色體平衡易位在人群中的發(fā)生率約為0.2%，絕大部分因染色體組成未改變而表型正常，少部分易位染色體的斷裂破壞了基因功能，導(dǎo)致不孕、疾病綜合征和先天畸形。減數(shù)分裂時期，易位染色體分離紊亂，產(chǎn)生約70%不平衡配子，導(dǎo)致反復(fù)流產(chǎn)或新生兒染色體異常。運用斷裂區(qū)域DNA探針的FISH技術(shù)和短串聯(lián)重復(fù)序列(short tandem repeats，STR)單體型分析可以鑒別易位攜帶者，但無法進行全部染色體篩查[28]。對于反復(fù)流產(chǎn)和希望生育染色體核型正常后代的患者，尤其需要能區(qū)分易位攜帶狀態(tài)和正常胚胎的PGT技術(shù)。

1. 顯微切割和二代測序(MicroSeq)準確檢測染色體易位斷裂點：Hu等[29]使用激光顯微切割技術(shù)識別易位斷裂點及其連鎖的SNPs位點，建立了一種能夠精準定位染色體平衡易位斷裂點的方法，篩選出正常胚胎并成功應(yīng)用于PGT。該技術(shù)能夠?qū)σ孜桓浇闹嘏湃旧w進行顯微切割和二代測序，通過靶向PCR和Sanger測序精準檢測斷裂點及附近SNPs，利用有效SNPs進行連鎖分析，篩選出不攜帶染色體易位的正常胚胎。然而，該技術(shù)需要高度特異性的設(shè)備和復(fù)雜的樣本制備程序，難以應(yīng)用于高通量的臨床檢測。

2. 等位基因映射識別技術(shù)(mapping allele with resolved carrier status，MaReCs)在染色體平衡易位胚胎識別中的應(yīng)用：MaReCs是一種以NGS為基礎(chǔ)的方法，運用連鎖分析識別與易位相關(guān)的等位基因，能夠鑒別易位攜帶狀態(tài)的胚胎[30]。該技術(shù)運用MALBAC和NGS對活檢細胞進行全基因組擴增和測序，通過拷貝數(shù)變異識別染色體非平衡胚胎中發(fā)生易位的斷裂點，在斷裂點附近1 Mb區(qū)域的SNPs用于分析胚胎是否攜帶染色體易位，并篩選出正常胚胎用于移植。

使用MALBAC-NGS能將斷裂點檢測的準確性提高到200 bp，將SNPs的檢測范圍縮小到斷裂點附近約1 Mb區(qū)域，降低了因染色體重組而導(dǎo)致誤診的風(fēng)險。目前該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于臨床，保證了染色體平衡易位患者胚胎的有效篩選。由于檢測需要非平衡的異常胚胎作為對照尋找斷裂位點，因此該技術(shù)具有一定局限性。

3. 植入前遺傳學(xué)單體型分析(preimplantation genetic haplotyping，PGH)在染色體平衡易位胚胎識別中的應(yīng)用：近來有團隊通過SNP基因型構(gòu)建斷裂區(qū)域單體型，從而識別不攜帶易位的正常胚胎。Wang等[31]使用Illumina Human Cyto-12芯片檢測基因組SNPs，將攜帶易位的非平衡胚胎作為參照，通過 SNP單體型分析識別出羅氏易位攜帶狀態(tài)的胚胎，移植了染色體正常的胚胎，并獲得臨床妊娠。Zhang等[32]利用SNP微陣列技術(shù)成功鑒別了平衡易位和羅氏易位攜帶狀態(tài)的胚胎。該技術(shù)的優(yōu)勢在于，能夠同時篩查染色體易位和23對染色體拷貝數(shù)變異；適用于全部染色體的相互易位和羅氏易位。由于該技術(shù)使用的芯片僅有300 000個SNPs位點，因此檢測結(jié)果不能排除染色體重組的可能性。

BasePhasing是Zhang等[33]的團隊最近報道的一項能夠有效識別染色體平衡易位的技術(shù)。該團隊使用Infinium Asian Screening Array-24 v1.0(ASA)芯片及優(yōu)化的分析流程，對兩例染色體平衡易位患者的胚胎進行了檢測，通過羊水穿刺細胞遺傳學(xué)分析證明了其技術(shù)的有效性。由于該芯片包含700 000個SNPs位點，因此斷裂區(qū)域內(nèi)的有效SNPs數(shù)目較多，可以較好的排除染色體重組的影響。

4.配對二代測序和PCR斷點分析技術(shù)有效檢測染色體易位斷裂區(qū)域：Wang等[34]使用長范圍配對測序的方法識別平衡易位斷裂區(qū)域，獲得了染色體核型正常的新生兒。該策略首先通過配對測序檢測出包含斷裂點的5 kb片段，進行巢式PCR和Sanger測序，精確檢測出兩個斷裂點及其鄰近序列。然后，對胚胎的活檢DNA進行特異性PCR，并進行Sanger測序確認是否存在斷裂點。

該方法無需參照，但存在幾點局限性：首先，盡管測序深度高(30X)，但在11個相互易位患者中有2個未檢測到斷裂點；羅氏易位的斷裂點往往位于高度重復(fù)的著絲粒區(qū)域而不易檢測。第二，位于AT富集區(qū)域的斷裂點因缺乏有效的PCR引物而無法檢測；小片段缺失、插入或重復(fù)導(dǎo)致斷點附近序列改變，使PCR引物無效。因此，明確斷裂點之間額外的序列可以增加引物設(shè)計的準確性。第三，由于起始DNA量少導(dǎo)致ADO，可能會使易位攜帶狀態(tài)的胚胎誤診為正常胚胎。為了提高準確性，可以同一斷裂點使用兩對特異性引物來降低ADO的發(fā)生率。

四、展望

PGT誕生20多年以來，在單基因病、染色體病和非整倍體檢測等方面廣泛應(yīng)用，阻斷致病基因和異常染色體向子代傳遞，篩選整倍體胚胎用于移植，改善了IVF患者的臨床結(jié)局。隨著SNP芯片技術(shù)的改進，基因組SNP檢測位點增加，診斷準確性提高[33]。全基因組范圍內(nèi)的SNP連鎖分析可以確定染色體親本來源，能夠識別攜帶致病基因或平衡易位的染色體，具有廣泛的臨床應(yīng)用價值。三代測序具有超長讀長、單分子測序的優(yōu)勢，目前已經(jīng)有成功檢測單基因病和染色體平衡易位的報道[25-26，35]。今后，在優(yōu)化檢測流程和更新測序儀器的基礎(chǔ)上，三代測序可以為單基因病和染色體平衡易位患者提供低成本、準確有效的PGT。目前，PGT仍然存在ADO、擴增偏倚、胚胎嵌合體和外源性DNA污染等問題。因此，需要更加便捷有效和能廣泛使用的技術(shù)應(yīng)用于PGT，縮短患者等待時間，降低成本，提高檢測準確性，改善臨床結(jié)局。