李青，趙海濱，張傳鑫，馬水英，李梅，吳克良

(山東大學(xué)附屬生殖醫(yī)院，濟南 250021)

人未成熟卵母細胞體外成熟(in-vitro maturation，IVM)技術(shù)是指從不孕患者體內(nèi)獲得的未成熟卵母細胞，通過模擬體內(nèi)卵母細胞的成熟環(huán)境，使卵母細胞恢復(fù)減數(shù)分裂，完成成熟并且具有受精和發(fā)育到胚胎階段潛能的技術(shù)。IVM技術(shù)雖然很早運用于臨床治療，但是體外培養(yǎng)的卵母細胞成熟水平和受精后的胚胎發(fā)育能力都低于體內(nèi)成熟的卵母細胞[1]，如何獲得較好的發(fā)育潛能是IVM領(lǐng)域研究的熱點。卵母細胞成熟包括細胞核成熟和細胞質(zhì)成熟兩個過程，只有二者都成熟的卵母細胞才能獲得較好的受精和胚胎發(fā)育能力。影響IVM的因素很多，主要包括體外培養(yǎng)時間、活性氧、O2濃度[2]、光照、溫度、pH和培養(yǎng)液成分[3-4]。活性氧的變化是影響卵母細胞胚胎發(fā)育的主要因素，適量的活性氧可以誘導(dǎo)卵母細胞成熟，但是過量的活性氧會引起氧化損傷。在哺乳動物卵母細胞內(nèi)具有一定的抗氧化機制，可以清除卵母細胞內(nèi)累積的活性氧，在卵母細胞成熟過程中，卵丘細胞、卵泡液和輸卵管液能夠保護卵母細胞免受氧化損傷。由于缺乏正常發(fā)育的條件，體外培養(yǎng)的卵母細胞存在細胞受損或停止發(fā)育的現(xiàn)象。

谷胱甘肽是一種重要的巰基還原物質(zhì)，能夠保護細胞免受氧化損傷，卵母細胞胞質(zhì)中還原型谷胱甘肽水平能有效反映卵母細胞的成熟質(zhì)量[5]。有研究表明，卵母細胞IVM培養(yǎng)時，細胞核成熟快于細胞質(zhì)成熟，并且IVM的卵母細胞內(nèi)谷胱甘肽濃度低于體內(nèi)成熟的卵母細胞[6]。卵母細胞內(nèi)高還原型谷胱甘肽水平有助于卵母細胞核、細胞質(zhì)發(fā)育的同步化。半胱胺是重要的抗氧化物質(zhì)，能夠保護卵母細胞免受氧化損傷從而明顯提高受精后的胚胎發(fā)育潛能[7]。胱氨酸是谷胱甘肽的合成底物。大量動物實驗研究表明，在卵母細胞IVM過程中添加半胱胺或(和)胱氨酸能促進細胞內(nèi)谷胱甘肽合成，進而提高胚胎的發(fā)育水平[8-9]。我們在前期山羊[10]和小鼠[11]研究中發(fā)現(xiàn)，IVM培養(yǎng)液中加入半胱胺和胱氨酸能夠明顯提高胚胎的發(fā)育潛能，且最佳濃度的半胱胺(100 μmol/L)和胱氨酸(200 μmol/L)使囊胚發(fā)育率最高。

在人卵母細胞IVM過程中，許多研究集中在向培養(yǎng)液中添加各種物質(zhì)以提高卵母細胞的IVM和胚胎發(fā)育潛能，但結(jié)果表明未成熟卵母細胞經(jīng)IVM、體外受精和胚胎培養(yǎng)后很少能發(fā)育至囊胚階段[12]。本研究首次在人卵母細胞IVM培養(yǎng)液中加入半胱胺和胱氨酸，觀察半胱胺和胱氨酸在未成熟卵母細胞體外培養(yǎng)中的作用，希望提高卵母細胞的成熟質(zhì)量，以獲得較高的胚胎發(fā)育潛能，進而優(yōu)化IVM培養(yǎng)體系，為不孕患者提供更多的妊娠機會。

資料與方法

一、研究對象

收集2017年1月至 2018年12月在山東大學(xué)附屬生殖醫(yī)院就診并行卵胞漿內(nèi)單精子注射-胚胎移植(ICSI-ET)患者的未成熟卵母細胞。納入標(biāo)準：患者無吸煙、酗酒、吸毒等不良嗜好，年齡在20～38歲；取卵數(shù)大于6枚，且未成熟卵母細胞數(shù)/獲卵數(shù)的比例小于30%；不育因素為單純男方因素或同時合并女方輸卵管因素。排除艾滋病、梅毒、乙型肝炎抗陽性患者。女方經(jīng)超促排卵HCG 36～38 h后在超聲引導(dǎo)下穿刺取卵。取卵后2～5 h 用透明質(zhì)酸酶消化去除黏液團和顆粒細胞，將未成熟的 GV 期和 MⅠ期的卵母細胞用于本研究。ICSI注射所用精子來源于供精，由山東省精子庫提供。

本研究的開展獲得本醫(yī)院倫理委員會的批準，所有患者均簽署知情同意書。

二、方法

1. IVM培養(yǎng)液的配制：IVM培養(yǎng)液需要提前一天配制，在TCM-199(sigma，美國)中加入10%人血清白蛋白(vitrolife，瑞典)、0.29 mmol/L丙酮酸鈉(sigma，美國)、50 U/ml青霉素、50 U/ml鏈霉素，置于37℃、6%CO2的培養(yǎng)箱中平衡過夜；第2天收集未成熟卵母細胞前4 h左右在培養(yǎng)液中依次加入10 ng/ml EGF(sigma，美國)、75 U/L FSH(serono，瑞士)、150 U/L HCG(serono，瑞士)。

半胱胺(sigma，美國)配制成20 mmol/L的儲存液，胱氨酸(sigma，美國)配制成50 mmol/L的儲存液，分裝后于-20℃冰箱保存，使用前用IVM培養(yǎng)液稀釋到所需濃度。

2. 未成熟卵母細胞的獲得：收集患者的卵母細胞，在37℃、6%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 2～5 h 后，用透明質(zhì)酸酶消化掉卵母細胞周圍的黏液團和顆粒細胞，判斷卵母細胞成熟情況，成熟卵母細胞用于正常的ICSI治療。收集經(jīng)確認后的未成熟卵母細胞，包括減數(shù)分裂Ⅰ(metaphase Ⅰ，MⅠ)期和有生發(fā)泡(germinal vesicle，GV)期的卵母細胞，將其隨機分為添加組和不添加組，添加組的卵母細胞培養(yǎng)時需在IVM培養(yǎng)液中添加100 μmol/L半胱胺和200 μmol/L胱氨酸；不添加組的卵母細胞培養(yǎng)時，單純使用IVM培養(yǎng)液。所有未成熟卵母細胞均過夜培養(yǎng)，24～28 h 后觀察卵母細胞成熟情況，以可見第一極體為卵母細胞成熟的標(biāo)志。

3. 體外培養(yǎng)成熟后ICSI和胚胎培養(yǎng)：成熟卵母細胞用供精行ICSI，18～20 h后觀察卵母細胞受精情況，出現(xiàn)2個原核為正常受精(2PN)。卵裂率為正常受精卵分裂的比例。胚胎培養(yǎng)至第3天(D3)，卵裂球為7～10個細胞或者融合胚，碎片小于30%為D3優(yōu)胚；胚胎發(fā)育至D5、D6進行囊胚評估[13]，評分為4BC及以上者為優(yōu)質(zhì)囊胚[14]。2PN分裂為優(yōu)質(zhì)胚胎的比例為優(yōu)胚率。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件包對實驗數(shù)據(jù)進行，數(shù)據(jù)比較采用χ2檢驗。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、一般資料

共收集超促排卵周期中未成熟卵母細胞584枚，其中MⅠ期卵母細胞278枚，添加組141枚，不添加組137 枚；GV期卵母細胞306枚，添加組158枚，不添加組 148枚。

二、半胱胺和胱氨酸對GV期卵母細胞IVM及發(fā)育的影響

GV期卵母細胞IVM培養(yǎng)后，添加組卵母細胞成熟率為67.1%，不添加組卵母細胞成熟率為57.4%，兩組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。添加組D3優(yōu)胚率(46.7%)和優(yōu)質(zhì)囊胚形成率(26.7%)均顯著高于不添加組(分別為22.6%、9.7%)(P<0.05)；兩組的受精率和卵裂率比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(表1)。

三、半胱胺和胱氨酸對MⅠ期卵母細胞IVM及發(fā)育的影響

MⅠ期卵母細胞經(jīng)IVM培養(yǎng)后，添加組卵母細胞的D3優(yōu)胚率(55.4% vs. 28.4%)和優(yōu)質(zhì)囊胚形成率(25.7% vs. 9.5%)均顯著高于不添加組(P<0.05)；但兩組的成熟率、受精率和卵裂率比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(表2)。

表1 半胱胺和胱氨酸對GV期卵母細胞IVM及發(fā)育的影響(%)

表2 半胱胺和胱氨酸對MⅠ期卵母細胞IVM及發(fā)育的影響(%)

討 論

隨著人類生育年齡的推遲和二胎政策的放開，女性生育要求日趨強烈，但是不孕癥、卵巢儲備功能不足、卵泡發(fā)育遲緩等女性生殖疾病的發(fā)生率也呈逐年上升趨勢，許多不孕不育患者選擇人類輔助生殖技術(shù)繁衍后代。IVM 技術(shù)不僅能充分利用常規(guī)IVF和ICSI技術(shù)中的未成熟卵母細胞、提高卵母細胞利用率，且能減少卵巢過度刺激綜合征(OHSS)的發(fā)生，是治療多囊卵巢綜合征(PCOS)性不孕癥的有效方法[15]，為贈卵及女性生育力保存提供了更多選擇，具有很好的發(fā)展前景[16-17]。 IVM 作為新的助孕技術(shù)，目前在臨床和實驗室研究方面取得了一定的進展。IVM能夠充分利用IVF/ICSI中約15%的未成熟卵母細胞，提高了累積妊娠率和抱嬰率。對PCOS患者，IVM可以降低促排卵藥物的使用，避免 OHSS的發(fā)生。對于年輕尚未生育的腫瘤患者，IVM聯(lián)合IVF-ET能夠保存生育力，使其實現(xiàn)生育夢想。但IVM仍面臨成熟率、受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率及妊娠率低等問題[18]。

與體內(nèi)成熟的卵母細胞相比，IVM的卵母細胞由于缺乏體內(nèi)成熟的條件，核成熟和細胞質(zhì)成熟不同步，從而影響卵母細胞的質(zhì)量，所以目前IVM 培養(yǎng)液培養(yǎng)的卵母細胞，其胚胎種植率、臨床妊娠率、活產(chǎn)率均顯著低于成熟卵新鮮ICSI 周期。影響IVM的因素很多，常見的有：(1)培養(yǎng)時間：適當(dāng)延長 IVM 時間可提高未成熟卵母細胞的細胞成熟率。(2)激素的添加：促性腺激素在卵泡發(fā)育中發(fā)揮重要作用，可刺激卵母細胞的成熟，有大量研究在IVM培養(yǎng)液中加入FSH[19]、LH、HCG或E2[20]等。(3)抗氧化劑的添加：IVM過程中卵母細胞容易發(fā)生氧化應(yīng)激，從而導(dǎo)致體外成熟障礙，在卵母細胞IVM培養(yǎng)體系中添加某些抗氧化物質(zhì)[21]可以提高培養(yǎng)效率。目前動物研究中常通過在IVM培養(yǎng)基中加入褪黑激素、谷氨酰胺、白藜蘆醇、肌醇、E-64、抗壞血酸和生育酚等以降低卵母細胞內(nèi)活性氧水平[22-23]，從而降低氧化應(yīng)激對卵母細胞的損害，但是在人卵母細胞IVM培養(yǎng)液中的相關(guān)研究則較少。

在本實驗中，我們在人卵母細胞IVM培養(yǎng)液中加入了100 μmol/L半胱胺和200 μmol/L胱氨酸，研究了半胱胺和胱氨酸對人未成熟卵母細胞IVM、受精和胚胎發(fā)育的影響。結(jié)果表明，無論對于GV期還是MI期卵母細胞，半胱胺和胱氨酸均能顯著提高D3優(yōu)胚率和優(yōu)質(zhì)囊胚形成率，這與我們前期研究[10-11]得出的結(jié)論相符?？赡艿脑驗镮VM培養(yǎng)液中添加的半胱胺和胱氨酸提高了未成熟卵母細胞中的谷胱甘肽(GSH)水平，改善了卵母細胞的細胞質(zhì)量，從而提高了胚胎的發(fā)育能力。

綜上，本研究的結(jié)果為進一步優(yōu)化體外培養(yǎng)系統(tǒng)提供了重要線索，提高了常規(guī)IVF-ET周期未成熟卵母細胞的胚胎發(fā)育潛能，具有一定的臨床應(yīng)用價值。但是對于半胱胺和胱氨酸提高胚胎發(fā)育潛能的機理仍有待于進一步的研究。