潘虹，陳蓓麗，李騰龑，馬旭*

(1.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院研究生院，北京 100730；2.國家衛(wèi)生健康委科學(xué)技術(shù)研究所，北京 100081；3.安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，合肥 230022)

卵巢功能不全(premature ovarian insufficiency，POI)又稱為卵巢早衰(premature ovarian failure，POF)，是一種嚴(yán)重影響女性生殖健康的疾病，臨床表現(xiàn)為40歲以前停經(jīng)并伴隨血漿促性腺激素水平增加[1]。其可能的病理機(jī)制包括原始卵泡池的初始減少或原始卵泡未能成熟[2]。多種因素可導(dǎo)致POI的發(fā)生，然而，大多數(shù)POI病例被認(rèn)為是特發(fā)性的，可能與遺傳因素相關(guān)。目前，經(jīng)過大量工作已經(jīng)鑒定若干非綜合征型POI相關(guān)基因，如FSHR、LHCGR、NR5A1、NOBOX、FOXL2、FIGLA、BMP15、NANOS3、STAG3、ADAMTS19和BMPR2，極大促進(jìn)了我們對POI發(fā)病機(jī)制的了解[3]。

微小RNA(miRNA)參與卵母細(xì)胞成熟和卵泡發(fā)生的過程，其表達(dá)改變可能影響POI的發(fā)生[4-5]。MIR449B(miR-449b)是miR-449簇的成員，具有強(qiáng)烈的組織表達(dá)特異性，在睪丸和卵巢中具有較高水平[6]。目前，已經(jīng)鑒定了許多miR-449b靶基因，例如SIRT1、CCNE2、MET、GMNN、HDAC1、CDK4、CDC25A和CDK6，在多種生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用[7]。Rs10061133 A>G是miR-449b成熟區(qū)(hsa-miR-449b-5p)一個(gè)高度保守的多態(tài)性位點(diǎn)，為研究該多態(tài)性位點(diǎn)與POI發(fā)病的相關(guān)性，我們之前通過質(zhì)譜的方法對miR-449b rs10061133多態(tài)位點(diǎn)進(jìn)行基因分型，關(guān)聯(lián)分析結(jié)果顯示rs10061133 AA基因型攜帶者患POI的風(fēng)險(xiǎn)高[8]。但目前尚不清楚miR-449b參與POI的具體機(jī)制，本研究擬通過預(yù)測鑒定其與POI相關(guān)下游靶基因，了解其參與POI的可能作用方式。

資料與方法

一、預(yù)測miR-449b的潛在靶基因

miRWalk(http：∥mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/)在線預(yù)測miR-449b的潛在靶基因[9]。TargetScanHuman 7.2(http：∥www.targetscan.org/vert_72/)用于預(yù)測miR-449b的結(jié)合位點(diǎn)。文獻(xiàn)檢索這些潛在靶基因與POI發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性，找到可能與POI相關(guān)的miR-449b潛在靶基因。

二、質(zhì)粒構(gòu)建和定點(diǎn)突變

對照載體、miR-449b(rs10061133 AA基因型)、miRNA抑制劑對照和miR-449b抑制劑購自GeneCopoeia(Rockville，Maryland，美國)。以miR-449b(AA基因型)表達(dá)質(zhì)粒為模板，使用適當(dāng)?shù)囊锿ㄟ^定點(diǎn)突變獲得miR-449b的rs10061133(GG基因型)表達(dá)質(zhì)粒。黃體生成素/絨毛膜促性腺激素受體(luteinizing hormone/choriogonadotropin receptor，LHCGR)的野生型3’UTR片段通過以人細(xì)胞系HEK 293TcDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得。將包括預(yù)測結(jié)合位點(diǎn)的413-bp擴(kuò)增產(chǎn)物(LHCGR-luc)克隆到pGL3-Control載體(Promega，Madison，美國)luc+基因下游的XbaI位點(diǎn)。用適當(dāng)?shù)囊锿ㄟ^定點(diǎn)突變獲得miR-449b結(jié)合位點(diǎn)區(qū)域缺失(AGTGTAGTCTATGACCACTGCCA/-)的突變型LHCGR 3’UTR片段(LHCGR-luc-del)。通過Sanger測序驗(yàn)證所有構(gòu)建質(zhì)粒。所有引物信息見表1，質(zhì)粒構(gòu)建和定點(diǎn)突變示意圖如圖1所示。

表1 用于定點(diǎn)突變和質(zhì)粒構(gòu)建的引物

圖1 質(zhì)粒構(gòu)建和定點(diǎn)突變示意圖

三、細(xì)胞培養(yǎng)，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和雙熒光素酶檢測

HEK293T細(xì)胞(本室保存)培養(yǎng)在含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中，取對數(shù)生長期細(xì)胞，接種細(xì)胞到96孔培養(yǎng)板，待匯合度達(dá)到約50%～60%轉(zhuǎn)染。海腎熒光素酶(pRL-TK)作為內(nèi)對照，消除每個(gè)孔轉(zhuǎn)染效率不同的影響。使用Lipofectamine 2000(Invitrogen，Carlsbad，CA，美國)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后48 h，洗滌并裂解細(xì)胞，利用雙熒光素酶報(bào)告檢測系統(tǒng)(Promega，Madison，WI，美國)在Promega發(fā)光檢測儀上測量熒光素酶活性。操作按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。

四、統(tǒng)計(jì)分析

雙熒光素酶測定值代表3次獨(dú)立重復(fù)的平均值。所有分析均使用GraphPad Prism 5進(jìn)行。使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)計(jì)算，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、與POI相關(guān)的miR-449b潛在靶基因LHCGR

為了探究miR-449b與POI相關(guān)的可能機(jī)制，我們使用miRWalk預(yù)測其潛在靶基因。我們還搜索了所有已發(fā)表的相關(guān)文獻(xiàn)，以確定可能的POI相關(guān)基因。在軟件預(yù)測的miR-449b的所有潛在靶基因中，我們選擇可能與POI相關(guān)的基因LHCGR作為miR-449b的潛在靶基因。使用TargetScanHuman 7.2，我們預(yù)測LHCGR的3’UTR(人LHCGR NM_000233 3’UTR長度：923 bp)161-168序列作為miR-449b的潛在結(jié)合靶點(diǎn)。

二、miR-449b靶向LHCGR的3’UTR

為了確定LHCGR是否是miR-449b的靶基因，在雙熒光素酶測定中使用野生型和突變型LHCGR3’UTR(LHCGR-luc和LHCGR-luc-del)作為報(bào)告基因。我們的結(jié)果顯示，與對照載體相比，miR-449b顯著減弱野生型3’UTR的熒光素酶活性(圖2A)。相反，突變型3’UTR對miR-449b幾乎沒有應(yīng)答(圖2B)，表明LHCGR可能是miR-449b的直接靶基因。

A：對照載體、miR-449b、miRNA抑制劑對照或miR-449b抑制劑分別與LHCGR 3’UTR野生型(LHCGR-luc)共轉(zhuǎn)染HEK 293T細(xì)胞：與miRNA抑制劑對照比較，**P<0.01；與對照載體比較，***P<0.001。B：LHCGR 3’UTR野生型(LHCGR-luc)或突變型(預(yù)測靶位點(diǎn)缺失，LHCGR-luc-del)分別與miR-449b共轉(zhuǎn)染HEK 293T細(xì)胞：與pGL3-control比較，**P<0.01；與LHCGR-luc比較，##P<0.01圖2 HEK 293T細(xì)胞中雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)顯示LHCGR是miR-449b的直接靶基因(pRL-TK共轉(zhuǎn)染作為內(nèi)參)

三、不同基因型對LHCGR 3’UTR表達(dá)的影響

為了確定miR-449b rs10061133不同基因型對LHCGR3’UTR的影響，進(jìn)行了進(jìn)一步的雙熒光素酶測定。我們的結(jié)果顯示，miR-449b AA基因型的LHCGR-luc表達(dá)顯著低于GG基因型(P<0.05)(圖3)。表明miR-449b的rs10061133 AA基因型比GG基因型更明顯地抑制靶基因LHCGR表達(dá)。

rs10061133 AA或GG基因型分別與LHCGR 3’UTR野生型(LHCGR-Luc)共轉(zhuǎn)染HEK 293T細(xì)胞。pRL-TK共轉(zhuǎn)染作為內(nèi)對照。與對照載體比較，**P<0.01；與rs10061133 AA比較，#P<0.05圖3 miR-449b不同基因型對LHCGR-luc表達(dá)的影響

討 論

LHCGR基因編碼黃體生成素/絨毛膜促性腺激素受體，主要在睪丸和卵巢中表達(dá)[6]。LHCGR在卵泡發(fā)育過程中起關(guān)鍵作用，通過人卵巢組織的免疫組織化學(xué)染色和蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該蛋白開始出現(xiàn)在早期竇卵泡的顆粒細(xì)胞和卵泡膜細(xì)胞中，并且在卵丘細(xì)胞中亦有表達(dá)[10]。動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)顯示小鼠Lhcgr基因靶向敲除可以導(dǎo)致小鼠不育，雄性和雌性小鼠的內(nèi)外生殖器發(fā)育均嚴(yán)重不足，其中雌性小鼠竇前卵泡生長停滯[11]。LH通過LHCGR在卵泡生長和卵母細(xì)胞成熟中起重要作用。在顆粒細(xì)胞分化期間誘導(dǎo)LHCGR允許排卵前卵泡對中期LH峰作出應(yīng)答并且LH是排卵所必需的[12]。LHCGR的異常表達(dá)將導(dǎo)致部分卵巢功能衰竭，攜帶LHCGR基因失活突變的女性具有LH增加、卵巢增大、月經(jīng)稀發(fā)和不育的臨床特征[13-14]。Fonseca等[3]通過二代測序在2名POI患者中發(fā)現(xiàn)2個(gè)LHCGR基因突變位點(diǎn)(c.296A/G和c.526C/T)。因此，LHCGR可能是POI的候選致病基因?？傊^低的LHCGR表達(dá)或LHCGR突變可能與POI發(fā)生相關(guān)。miRNA成熟序列中的多態(tài)性位點(diǎn)(SNP)可影響靶基因結(jié)合或miRNA成熟過程[15-17]。我們的前期研究結(jié)果表明，miR-449b rs10061133 AA基因型可能是POI的風(fēng)險(xiǎn)因素[8]。為了進(jìn)一步探索miR-449b多態(tài)性與POI的相關(guān)性，使用生物信息學(xué)預(yù)測和熒光素酶雙報(bào)告基因檢測尋找與POI相關(guān)的miR-449b靶基因，軟件預(yù)測和實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明LHCGR為miR-449b的靶基因并且miR-449b rs10061133不同基因型(AA和GG)對LHCGR抑制作用程度不同。miR-449b與LHCGR3’UTR的結(jié)合在AA基因型下可以比GG基因型更穩(wěn)定和有效，并因此導(dǎo)致更少的LHCGR表達(dá)，miR-449b多肽位點(diǎn)rs10061133 A>G與POI的相關(guān)性可能通過差異調(diào)控其靶基因LHCGR的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)。

綜上所述，我們的結(jié)果證實(shí)miR-449b可能通過靶向POI相關(guān)基因LHCGR參與POI的發(fā)生，并且AA基因型可能對其靶基因LHCGR具有比GG基因型更強(qiáng)的抑制作用。更大規(guī)模的樣本研究和進(jìn)一步的功能實(shí)驗(yàn)，將有助于了解miR-449b rs10061133 A>G和POI的相關(guān)性。