邢彥，劉海寧

(青島市市立醫(yī)院生殖醫(yī)學科，青島 266000)

多囊卵巢綜合征(PCOS)是一種多起因的女性內分泌系統(tǒng)疾病，典型的特征是高雄激素血癥、排卵障礙和卵巢多囊樣改變，但確切的病因很復雜，并不十分明確。Barker[1]提出了“成人疾病的胎兒起源假說”，認為生命早期在關鍵和敏感的時期受到刺激和損傷會導致遺傳重新編碼，從而導致生理和代謝的長期改變。最近的研究證明，胎兒暴露于宮內高雄激素環(huán)境，會導致子代成年后出現PCOS樣的特征[2]。而卵巢來源的高雄激素是PCOS內分泌紊亂的一個主要表現，有學者認為是卵巢局部過高的雄激素阻斷了卵泡向優(yōu)勢卵泡階段的發(fā)育[3]，從而導致PCOS的各種臨床表現。卵巢顆粒細胞P450芳香化酶(P450aroma)是將雄激素轉化為雌激素的關鍵酶，有研究表明P450aroma mRNA在PCOS大鼠卵巢組織中的表達明顯低于對照組，并推測PCOS的發(fā)生可能與P450aroma的降低有關[4]。故本研究建立妊娠晚期暴露于高雄激素環(huán)境的大鼠動物模型，檢測子代雌鼠卵巢組織P450aroma的表達，從而探討PCOS的早期病因。

材料和方法

一、材料

1.研究對象：選用性成熟雌性Wistar大鼠20只，體重200～220 g，隨機分成實驗組和對照組，每組各10只。按照1∶1比例與雄性Wistar大鼠合籠交配，次日行陰道涂片，找到精子記為妊娠第0天。在妊娠第15～20 d，實驗組大鼠頸部皮下注射丙酸睪丸酮注射液0.6 mg，每日1次；對照組大鼠頸部皮下注射中性茶樹油0.6 mg，每日1次。待其自然分娩，留取其子代雌鼠繼續(xù)飼養(yǎng)至2月齡性成熟期處死，留取卵巢組織。

2.主要試劑：PV6002試劑(北京中山金橋)；P450aroma兔抗鼠多克隆抗體(北京博奧森生物)；RNA fast200總RNA提取試劑盒(上海飛捷生物)；第一鏈合成試劑盒、HSTMTaq Mix、100 bp DNA ladder、瓊脂糖(北京東盛生物)；PCR引物(上海生物工程)。

3.主要儀器：雙目顯微鏡(Olympus，日本)；超凈工作臺(北京半導體設備一廠)；高速離心機(GS-15R，Beckman，美國)；分光光度計(273BRO106，Bio-Rad，美國)；超低溫冰箱(SANYO，日本)；PCR擴增儀(T1 ThermocycIer，Bionetra，德國)；水平電泳儀(DYY-Ⅲ，北京六一儀器廠)；凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad，美國)。

二、方法

1. 取材：實驗組和對照組分別產下雌性大鼠35只和44只。于子代雌鼠2月齡性成熟時，行4%水合氯醛腹腔麻醉(0.3 ml/100 g)后，取雙側卵巢組織。一側卵巢組織置于4%多聚甲醛液中固定24 h用于免疫組化檢測；另一側卵巢組織置于DEPC水處理過的EP管中，并放入-70℃冰箱保存用于RT-PCR檢測。

2. 免疫組織化學檢測P450aroma蛋白表達：運用常規(guī)免疫組織化學PV6002二步法。卵巢組織經4%多聚甲醛固定24 h后組織切片，經烤片、常規(guī)脫蠟脫水、水化后，滴加一抗P450aroma兔抗鼠多克隆抗體(1∶200 PBS液稀釋)，4℃冰箱過夜；PBS液沖洗4次，各1.5 min；除去PBS，滴加新鮮配制的DAB工作液(A、B、C三種液體各50 μl，加入850 μl蒸餾水，混勻)，自來水充分沖洗，蘇木素復染5 min，1%鹽酸酒精分化30 s，氨水返藍10 min，自來水充分沖洗，烤干。以PBS代替P450aroma一抗作為陰性對照。

鏡下觀察以卵巢顆粒細胞胞漿內出現黃色細顆粒為P450aroma表達陽性。結果判斷標準參照Fromowitz陽性細胞半定量分級法：隨機觀察5個高倍視野，每個視野計數100個細胞。先根據陽性細胞數所占的百分數計分：<5%計0分，5%～25%計1分，26%～50%計2分，51%～75%計3分，>75%計4分；再根據陽性細胞染色強度計分：無著色計0分，淡黃色計1分，棕黃色計2分，棕褐色計3分。最后根據兩者相加所得總分判定結果：0～1分(-)，2～3分(+)，4～5分(++)，6～7分(+++) 。

3. RT-PCR檢測P450aroma mRNA表達：總RNA的提取以及mRNA逆轉錄成cDNA(第一鏈的合成)采用試劑盒，嚴格按照說明書操作。PCR采用10 μl反應體系：cDNA 1.2 μl、Primer1 0.4 μl、Primer2 0.4 μl、HSTMTaq Mix 5 μl、超純水3 μl。PCR循環(huán)參數：94℃充分變性5 min；94℃變性30 s、50℃退火30 s、72℃延伸1 min，39個循環(huán)；72℃充分延伸10 min。PCR產物行1.2%瓊脂糖凝膠電泳(120 V，30 min)，EB染色20 min，在長波紫外燈下觀察，凝膠成像系統(tǒng)照相。用Quantity one軟件分析電泳條帶進行光密度掃描，以P450aroma與內參照β-actin電泳條帶DNA含量值之比作為評價P450aroma基因mRNA的相對表達量。PCR引物使用Primer Premier5.0軟件設計，由上海生工生物有限公司合成(表1)。

表1 RT-PCR引物序列及產物大小

三、統(tǒng)計分析

采用SPSS 19.0軟件。計數資料比較采用χ2檢驗，計量資料比較采用獨立樣本t檢驗；以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、免疫組化檢測結果

P450aroma蛋白在竇狀卵泡顆粒細胞、黃體和卵巢間質中均有表達。比較卵泡顆粒細胞胞漿內P450aroma蛋白的表達發(fā)現，實驗組P450aroma蛋白表達顯著低于對照組(P<0.05)(表2，圖1)。

表2 P450aroma蛋白在子鼠成熟卵泡顆粒細胞中的表達

A：實驗組；B：對照組圖1 P450aroma蛋白在子鼠成熟卵泡顆粒細胞中的表達(免疫組化PV6002法，蘇木素復染，×100)

二、RT-PCR結果

實驗組與對照組卵泡顆粒細胞中P450aroma mRNA的相對表達量分別為(0.217 7±0.008 3)和(0.413 2±0.010 3)，實驗組P450aroma mRNA的相對表達量顯著低于對照組(P<0.05)(表3，圖2)。

表3 P450aroma mRNA在兩組子鼠卵巢組織中的相對表達量比較(-±s)

M：100 bp DNA marker； 1.實驗組P450aroma； 2.實驗組β-actin； 3.對照組P450aroma； 4.對照組β-actin； 5.空白對照圖2 RT-PCR產物瓊脂糖凝膠電泳圖

討 論

大鼠為晚成雛哺乳動物，在出生前后內生殖器和神經系統(tǒng)對雄激素反應敏感，故我們選擇在妊娠晚期給大鼠皮下注射丙酸睪丸酮[5]，建立宮內高雄激素環(huán)境的動物模型，研究對子代雌鼠的影響。在前期的研究中我們發(fā)現，宮內暴露于高雄激素環(huán)境的子鼠，其表觀遺傳學發(fā)生了一些改變，包括出生體重低于對照組、出生后100 d體重高于對照組、出生后100 d乳房數低于對照組。我們的數據還發(fā)現宮內暴露于高雄激素環(huán)境的子鼠臍帶血睪酮濃度高于對照組，且成年后動情周期明顯少于對照組[6]。

在很多情況下，PCOS的發(fā)病具有明顯的遺傳特征，但是目前為止，對于PCOS的相關基因研究還未取得明確進展[7]。目前最流行的假說是宮內發(fā)育胎兒過度暴露于雄激素環(huán)境可導致表觀遺傳改變，尤其是女性胎兒期暴露于高雄激素環(huán)境，可影響胎兒相關靶基因表達，主要與卵巢甾體激素、胰島素的合成及GnRH脈沖分泌有關[8]，與PCOS的發(fā)生關系緊密，成年后可表現為稀發(fā)/無排卵、高雄激素血癥、卵巢多囊樣改變以及胰島素抵抗。卵巢來源的高雄激素血癥是PCOS的主要表現之一，Harada等[9]認為卵巢顆粒細胞中P450aroma的缺陷與高雄激素血癥有關，芳香化酶調控機制的改變是引起PCOS的原因。

細胞色素P450aroma是CYP19基因的產物，是將雄激素轉化為雌激素的限速酶。芳香化酶的表達與胎兒性腺的發(fā)育、卵泡的發(fā)育密切相關[10]。近年來已有動物實驗證實PCOS患者卵巢組織中P450aroma的表達異常，可能是卵巢激素分泌紊亂，干擾卵巢正常排卵的原因，表現為P450aroma合成減少導致雄激素增高[11]。在正常情況下，雄激素是FSH誘導的芳香化酶的底物，低濃度的雄激素可以增強芳香化酶的活性，促進雄激素轉化為雌激素。當卵泡中雄激素水平過高時，則是促進雄激素向活性更高的5α-還原型雄激素-雙氫睪酮轉化，可刺激小卵泡生長，阻斷卵泡向優(yōu)勢卵泡階段發(fā)育成熟，從而形成卵巢多囊樣改變[12]。而已有實驗表明PCOS患者血清和羊水中睪酮濃度明顯高于對照組[13]。本實驗通過檢測孕期高雄激素環(huán)境下實驗組子代雌鼠與對照組子代雌鼠卵巢P450aroma的mRNA表達和蛋白表達，發(fā)現兩者在基因水平和蛋白水平均是實驗組顯著低于對照組(P<0.05)。進一步證明在卵巢發(fā)育和卵母細胞發(fā)生早期階段暴露于高雄激素環(huán)境，會導致子代雌鼠卵巢芳香化酶表達和合成下降，雄激素升高，進而推測是PCOS相關生殖紊亂的原因之一。還有研究表明，宮內暴露于高雄激素環(huán)境的雌性后代可能發(fā)生非常罕見的P450aroma基因突變導致功能喪失，從而出現高雄激素血癥和卵巢多囊樣改變的表現[14]。

另外，胎兒某一敏感時期暴露于高雄激素環(huán)境干擾了下丘腦的Kiss1系統(tǒng)，Kisspeptin是由KISS1基因編碼、下丘腦分泌的多肽，是一種作用于GnRH上游的新發(fā)現的神經調質，對類固醇激素的反饋調節(jié)和代謝反應敏感[15]。GnRH脈沖頻率增加，引起LH分泌增加、FSH分泌減少，而正常卵巢顆粒細胞內芳香化酶是FSH誘導的，進而導致顆粒細胞內P450aroma活性受限，雄激素向雌激素轉化受限，雄激素水平增高，出現PCOS樣臨床表現[16]。

PCOS發(fā)病機制復雜，至今尚未明確。本實驗發(fā)現宮內暴露于高雄激素環(huán)境的子代雌鼠出生后P450aroma表達和合成下降，推測可能是導致PCOS的早期原因之一，進一步提示胎兒宮內暴露于高雄激素環(huán)境可能是PCOS病因中的重要因素之一。