楊樹(shù)法，李嘉琪，劉欣，司艷梅*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心，北京 100026；2.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與發(fā)育生物學(xué)系，北京 100069)

染色體異常是出生缺陷的常見(jiàn)病因，預(yù)防染色體異常胎兒出生是產(chǎn)前診斷的重要內(nèi)容。21-三體、18-三體、13-三體以及性染色體數(shù)目異常是常見(jiàn)的染色體數(shù)目異常，占產(chǎn)前診斷中染色體異常的50%以上[1]。除染色體數(shù)目異常外，染色體微缺失和微重復(fù)也是導(dǎo)致出生缺陷的重要原因。染色體核型分析長(zhǎng)久以來(lái)作為染色體異常診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但其出具報(bào)告時(shí)間長(zhǎng)、耗費(fèi)人工以及存在不能檢出微缺失和微重復(fù)等缺點(diǎn)。為了克服這些缺點(diǎn)，近年來(lái)誕生了多種基于分子生物學(xué)的檢測(cè)方法，如免疫熒光原位雜交技術(shù)(FISH)、多重?zé)晒饩酆厦告湻磻?yīng)技術(shù)(QF-PCR)等技術(shù)[2]。細(xì)菌人工染色體標(biāo)記-微球鑒別分離技術(shù)(BACs-on-Beads，BoBs)能夠快速診斷上述常見(jiàn)染色體數(shù)目異常以及9種常見(jiàn)微缺失綜合征(Wolf-Hirschhorn綜合征、Cri du Chat綜合征、Williams-Beuren綜合征、Langer-Giedion綜合征、Prader-Willi/Angelman綜合征、Miller-Dieker綜合征、Smith-Magenis綜合征、DiGeorge綜合征Ⅰ型、DiGeorge綜合征Ⅱ型)[3-6]。本研究聯(lián)合BoBs和傳統(tǒng)染色體核型分析對(duì)羊水標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，探討B(tài)oBs在快速診斷常見(jiàn)染色體異常中的應(yīng)用。

資料與方法

一、研究對(duì)象

以2016年6月到2019年3月間在我院產(chǎn)前診斷中心進(jìn)行產(chǎn)前診斷的孕婦為研究對(duì)象。入選標(biāo)準(zhǔn)：(1)具備產(chǎn)前診斷的指征；(2)同時(shí)接受染色體核型分析和BoBs檢測(cè)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)染色體核型分析和BoBs檢測(cè)二者僅進(jìn)行其一或同時(shí)檢測(cè)失敗；(2)羊水標(biāo)本為血性標(biāo)本。

所有入選對(duì)象均簽署知情同意書，同意進(jìn)行羊水穿刺、染色體核型分析以及BoBs檢測(cè)。研究中共收集856例患者標(biāo)本，羊水穿刺指征包括唐氏篩查高風(fēng)險(xiǎn)(498/856，58.18%)、無(wú)創(chuàng)檢查高風(fēng)險(xiǎn)(198/856，23.13%)、高齡(117/856，13.67%)、B超檢查異常(18/856，2.10%)以及其他(25/856，2.92%)。

二、方法

1.染色體核型分析：B超引導(dǎo)下抽取30 ml羊水，分別存放于3支15 ml離心管中，兩支用于染色體核型分析。將羊水離心后的沉淀細(xì)胞接種到全羊水培養(yǎng)基(BIOAMF-2，Biological Industries，以色列)中，培養(yǎng)6～7 d后換液。培養(yǎng)瓶中克隆數(shù)量(直徑大于0.5 cm)在10個(gè)以上時(shí)，在秋水仙素作用下利用消化法制備染色體核型，經(jīng)G帶染色體后，計(jì)數(shù)25個(gè)核型并分析5個(gè)染色體核型結(jié)構(gòu)，按照人類細(xì)胞基因組學(xué)國(guó)際命名體制(ISCN2016)進(jìn)行命名。

2.BoBs檢測(cè)：將10 ml羊水離心取沉淀細(xì)胞，利用QIAamp DNA Blood Mini Kit(Qiagen，美國(guó))試劑盒提取羊水細(xì)胞基因組DNA，按照Prenatal BACs-on-BeadsTM(Perkin Elmer，美國(guó))試劑說(shuō)明書進(jìn)行樣本檢測(cè)。結(jié)合到微球上的熒光強(qiáng)度利用Liminex 200(Luminex，美國(guó))進(jìn)行檢測(cè)，數(shù)據(jù)分析利用BoBsoft分析軟件完成。BoBs的檢測(cè)內(nèi)容如表1所示。

表1 BoBs檢測(cè)范圍

3.結(jié)果分析：依據(jù)產(chǎn)前診斷指征將孕婦進(jìn)行分類，將染色體核型分析的陽(yáng)性結(jié)果和BoBs陽(yáng)性結(jié)果均作為陽(yáng)性結(jié)果，計(jì)算得到不同指征孕婦的陽(yáng)性率。按照染色體異常種類(21-三體、18-三體、13-三體、47，XXY、47，XXX、45，X、47，XYY、嵌合體、平衡易位以及微缺失/微重復(fù))對(duì)兩種檢測(cè)方法檢測(cè)得到的陽(yáng)性結(jié)果進(jìn)行分類，計(jì)算每種染色體異常符合率。符合率=兩種檢測(cè)結(jié)果一致的病例數(shù)/每種染色體異常的病例數(shù)。

結(jié) 果

本研究共收集856例同時(shí)進(jìn)行了染色體核型分析和BoBs檢測(cè)的孕婦資料。孕婦平均年齡為(35.23±4.36)歲。

一、不同指征孕婦陽(yáng)性結(jié)果統(tǒng)計(jì)

將不同指征的孕婦資料進(jìn)行分類統(tǒng)計(jì)，統(tǒng)計(jì)每種指征的陽(yáng)性數(shù)量和陽(yáng)性比例。856例孕婦共檢出155例染色體異常病例，總體異常率為18.11%。其中，無(wú)創(chuàng)高風(fēng)險(xiǎn)陽(yáng)性比例最高(78.71%，122/198)，其它陽(yáng)性率從高到低依次為B超異常(11.11%，2/18)、其它(8.11%，2/25)、高齡(5.98%，7/117)以及唐氏篩查高風(fēng)險(xiǎn)(14.19%，22/498)(表2)。

表2 不同指征孕婦陽(yáng)性結(jié)果統(tǒng)計(jì)[n(%)]

二、兩種檢測(cè)方法結(jié)果比較

本研究共檢出155例染色體異常，兩種方法同時(shí)檢出141例染色體異常，包括136例染色體數(shù)目異常和5例嵌合體。BoBs檢出染色體異常146例，其中單獨(dú)檢出異常5例，為染色體微缺失和微重復(fù)；染色體核型分析檢出染色體異常150例，單獨(dú)檢出9例，包括4例嵌合體和5例平衡易位。在染色體數(shù)目異常檢出方面，BoBs和染色體核型分析的一致率為100%，對(duì)嵌合體檢測(cè)的符合率為55.56%，對(duì)平衡易位和微缺失/微重復(fù)檢測(cè)的符合率為0%(表3)。

表3 BoBs和染色體核型分析結(jié)果比較

討 論

檢出致病性染色體異常是產(chǎn)前診斷的主要內(nèi)容，不同的診斷方法優(yōu)缺點(diǎn)各異。染色體核型分析是產(chǎn)前診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，將BoBs與染色體核型分析進(jìn)行比較可以使孕婦充分了解每種診斷方法的優(yōu)缺點(diǎn)，在孕婦知情同意的基礎(chǔ)上，幫助孕婦選擇合理的產(chǎn)前診斷方法。染色體核型分析在羊水取材過(guò)早或過(guò)晚(<15周或>24周)時(shí)，由于可生長(zhǎng)的羊水脫落細(xì)胞數(shù)量減少，容易導(dǎo)致失?。欢鳥(niǎo)oBs失敗主要出現(xiàn)在過(guò)早(<15周)時(shí)，由于羊水脫落細(xì)胞數(shù)量少，可提取的DNA濃度低導(dǎo)致。我們的研究結(jié)果表明，在常見(jiàn)染色體(21號(hào)、18號(hào)、13號(hào)、X以及Y染色體)數(shù)目異常的純合體檢出方面，染色體核型分析和BoBs兩者檢測(cè)的符合率為100%。在嵌合體檢出方面，兩者的符合率為55.56%，BoBs檢出效能低于染色體核型分析。BoBs技術(shù)通過(guò)特定位點(diǎn)探針雜交的方式測(cè)定拷貝數(shù)目的變異，不能檢出染色體平衡易位等結(jié)構(gòu)性變化，在染色體結(jié)構(gòu)異常檢出方面兩者的符合率為0%，BoBs僅能檢出其檢出范圍內(nèi)(見(jiàn)表1)的染色體微缺失和微重復(fù)，而染色體核型分析能夠檢出大片段的染色體結(jié)構(gòu)異常，不能檢出染色體微缺失和微重復(fù)。

一、染色體數(shù)目異常的檢出

染色體核型分析利用G顯帶方法，顯微鏡下確定染色體數(shù)量。與染色體核型分析計(jì)數(shù)染色體數(shù)目原理不同，BoBs通過(guò)待測(cè)染色體(21號(hào)、18號(hào)、13號(hào)以及性染色體)上特定位點(diǎn)探針雜交信號(hào)的強(qiáng)弱來(lái)確定染色體數(shù)目異常。其實(shí)質(zhì)上利用待測(cè)染色體特定位點(diǎn)的拷貝數(shù)代表了整條染色體的拷貝數(shù)。多數(shù)情況下，這幾個(gè)位點(diǎn)的拷貝數(shù)與染色體的拷貝數(shù)相同，少數(shù)情況下也會(huì)出現(xiàn)兩者不一致的情況，利用這幾個(gè)位點(diǎn)代表整個(gè)染色體是存在風(fēng)險(xiǎn)的。以最常見(jiàn)的21-三體為例，BoBs在21號(hào)染色體的探針位置位于21q22.11-21q22.3，這是確定的唐氏綜合征的關(guān)鍵區(qū)域(Down syndrome critical region)[7]，但是一些研究表明，關(guān)鍵區(qū)域以外的21號(hào)染色體出現(xiàn)重復(fù)時(shí)，三體也會(huì)出現(xiàn)唐氏綜合征癥狀[8]，這些胎兒在用BoBs檢測(cè)時(shí)將獲得陰性結(jié)果，出生后表現(xiàn)出21-三體的癥狀。

二、嵌合體檢出

染色體核型分析是檢出染色體異常的金標(biāo)準(zhǔn)，也是國(guó)內(nèi)產(chǎn)前診斷的主要方法。該方法需要培養(yǎng)、制片以及閱片等檢測(cè)過(guò)程，由于分析過(guò)程以單個(gè)中期染色體核型為單位，保留了每個(gè)細(xì)胞的染色體信息，從而保證了其對(duì)嵌合體的檢出。而B(niǎo)oBs檢測(cè)通過(guò)將細(xì)胞裂解提取DNA，失去了每個(gè)細(xì)胞染色體信息，通過(guò)分析整體標(biāo)本的信號(hào)強(qiáng)度，然后根據(jù)參考值范圍判定結(jié)果，這決定了嵌合體比例在一定范圍內(nèi)能夠檢出，而超出該范圍則會(huì)判定為純合，部分病例會(huì)處于灰度區(qū)間內(nèi)。嵌合體斷定是BoBs在臨床應(yīng)用上的主要缺點(diǎn)，Grati等[9]研究表明產(chǎn)前BoBs能檢出嵌合比例在30%以上的嵌合體，也就是說(shuō)低比例嵌合體將被判定為染色體正常純合或染色體異常純合。國(guó)內(nèi)多項(xiàng)研究也證實(shí)BoBs在嵌合體檢出方面與染色體核型結(jié)果不完全一致[10-12]。Cheng等[13]對(duì)BoBs和QF-PCR的研究表明，BoBs檢出嵌合體的敏感度為44.4%，QF-PCR為33.3%，BoBs檢出效能優(yōu)于QF-PCR(28.6% vs. 0%)；Choy等[14]的研究結(jié)果與之類似。

本研究中染色體核型分析檢出的9例嵌合體中有5例被BoBs檢出，兩者的符合率為55.56%；被兩種方法同時(shí)檢出的5例為真性嵌合體。另外的4例嵌合體未被BoBs檢出的原因可能是：(1)嵌合體比例小于30%；(2)培養(yǎng)過(guò)程中出現(xiàn)的假性嵌合體。雖然染色體核型分析過(guò)程中將嵌合體比例定義為3%以上，以排除培養(yǎng)和制片過(guò)程中可能出現(xiàn)的假性嵌合體，但是也不能完全避免假性嵌合體。

三、染色體微缺失/微重復(fù)的檢出

BoBs能夠檢出染色體核型分析不能檢出的部分微缺失/微重復(fù)(見(jiàn)表1)，微缺失/微重復(fù)又稱為亞染色體拷貝數(shù)變異(sub-chromosomal copy number variations，CNVs)，可以從無(wú)癥狀(或輕中度癥狀)父母遺傳得到，也可以為新發(fā)生(de novo)。微缺失的發(fā)生率低于微重復(fù)，在胎兒的總體發(fā)生率為1.0%到1.7%之間，多數(shù)病例在孕期缺少B超可見(jiàn)的形態(tài)學(xué)改變[15]，是產(chǎn)前診斷中篩查的盲區(qū)，目前也缺少臨床路徑進(jìn)行診斷。微缺失/微重復(fù)檢出方法包括基因組芯片、FISH、QF-PCR以及MLPA(Multiplex ligation-dependent probe amplification)等[16]，不同的方法優(yōu)缺點(diǎn)各異，對(duì)不同方法的適當(dāng)選擇是檢出微缺失/微重復(fù)的關(guān)鍵。BoBs技術(shù)能夠檢出常見(jiàn)的微缺失/微重復(fù)，為產(chǎn)前階段診斷微缺失/微重復(fù)綜合征提供了很好的途徑。

與傳統(tǒng)的染色體核型分析相比，BoBs檢測(cè)技術(shù)具有快速檢測(cè)常見(jiàn)染色體數(shù)目異常及部分染色體微缺失/微重復(fù)、節(jié)省人工以及便于大批量操作的優(yōu)點(diǎn)。但BoBs利用染色體上的幾個(gè)位點(diǎn)代表整條染色體，存在漏診的風(fēng)險(xiǎn)；對(duì)嵌合體檢出能力較弱，并不具備對(duì)染色體整體結(jié)構(gòu)評(píng)價(jià)的能力，必要時(shí)需通過(guò)FISH和核型分析的方法加以確認(rèn)。僅根據(jù)BoBs檢測(cè)結(jié)果對(duì)胎兒進(jìn)行進(jìn)一步處理，存在較大的風(fēng)險(xiǎn)，而其與染色體核型分析聯(lián)合應(yīng)用可以快速診斷某些染色畸形并且避免醫(yī)療糾紛。