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(1.石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,新疆石河子 832003; 2.新疆阜豐生物科技有限公司,新疆烏魯木齊 830001)

自然界中已發(fā)現(xiàn)的維生素K有兩種,即維生素K1(葉綠醌)和維生素K2(甲萘醌),所有維生素K都具有2-甲基-1,4-萘醌母環(huán),區(qū)別僅在于3位的側(cè)鏈不同(圖1所示)[1]。維生素K2結(jié)構(gòu)是由一個(gè)甲基萘醌母環(huán)和一條位于母環(huán)C3位置上的異戊二烯側(cè)鏈組成,根據(jù)側(cè)鏈上異戊二烯單元個(gè)數(shù)差異,維生素K2共分為l4種,以MK-n表示,MK-7即側(cè)鏈上含有7個(gè)異戊二烯單元[2]。維生素K的生理功能一直以來被認(rèn)為與凝血有關(guān),近年來發(fā)現(xiàn)維生素K2可以激活骨鈣素,促使血液中的鈣質(zhì)沉積到骨骼,對(duì)于預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松有重要作用;同時(shí),維生素K2可以活化血管中的蛋白質(zhì)鈣化抑制蛋白基質(zhì)γ-羧基谷氨酸蛋白,因而會(huì)阻礙鈣質(zhì)沉淀于動(dòng)脈血管,防止動(dòng)脈硬化,降低心血管疾病的發(fā)病率[3]。

圖1 維生素K1(a)和K2(b)的分子結(jié)構(gòu)Fig.1 Molecular structure of vitamin K1(a)and K2(b)

維生素K2可以由芽孢桿菌、乳酸菌、黃桿菌等多種細(xì)菌合成[4],在細(xì)菌的氧化磷酸化過程中作為電子傳遞鏈的組分[5-6],國(guó)內(nèi)外研究中,用于合成維生素K2的主要微生物是芽孢桿菌屬微生物和黃桿菌。黃桿菌合成的維生素K2主要以MK-4和MK-6兩種形式存在,芽孢桿菌發(fā)酵生成的維生素K2主要是MK-7。在維生素K2的十四個(gè)同系物中,MK-7的生理活性好,且半衰期比其他同系物都長(zhǎng),因此所需的服用劑量小,是最佳的維生素K2補(bǔ)充物[3]。2006年,維生素K2(MK-7)已經(jīng)被FDA和歐洲食品安全管理局批準(zhǔn)使用,日本也有維生素K2藥品上市。維生素K2已經(jīng)成為國(guó)際上新興的功能性保健食品。國(guó)家衛(wèi)計(jì)委2016年發(fā)布公告批準(zhǔn)發(fā)酵型維生素K2作為食品營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑新品種,并擬將發(fā)酵法生產(chǎn)的維生素K2作為營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑加入調(diào)制乳粉、固體飲料、風(fēng)味發(fā)酵乳和含乳飲料中。

維生素K2作為新興功能性保健食品,正越來越受到關(guān)注。但利用微生物發(fā)酵方法生產(chǎn)維生素K2還處于起步階段,最大制約是菌株的產(chǎn)量較低。土壤中芽孢桿菌資源豐富,本研究從土壤中篩選能夠高產(chǎn)維生素K2的菌株,對(duì)該菌株進(jìn)行鑒定,并對(duì)其提取方法和菌株的發(fā)酵特性進(jìn)行初步研究,為工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

土壤樣品 取自新疆石河子市郊區(qū);維生素K1、K2(MK-7)標(biāo)準(zhǔn)品 日本和光純藥工業(yè)株式會(huì)社(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.);二氯甲烷、正己烷、異丙醇、甲醇 美國(guó)賽默飛世爾公司(Thermo Fisher Scientific Inc.);酵母粉 英國(guó)Oxoid公司;大豆蛋白胨 北京奧博星生物技術(shù)有限公司;其他試劑均為分析純 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;種子培養(yǎng)基(g/L) 牛肉膏5,蛋白胨10,葡萄糖10,NaCl 5;發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L) 甘油50,大豆蛋白胨100,酵母粉0.6,K2HPO40.3,CaCl2·2H2O 0.1,MgSO4·7H2O 0.3;菌種傳代保藏培養(yǎng)基(g/L) 蛋白胨10,酵母提取物5,氯化鈉10,瓊脂粉15。

1200型高效液相色譜儀(配有可變波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器及色譜工作站) 美國(guó)安捷倫公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種篩選方法 將采集的土壤樣品用無菌水稀釋后在95 ℃水浴30 min,然后在種子培養(yǎng)基上劃線分離純化獲得單菌落。挑取單菌落連續(xù)劃線分離三次后進(jìn)行初篩。初篩時(shí)將單菌落進(jìn)行斜面培養(yǎng)后接入發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶發(fā)酵,發(fā)酵結(jié)束檢測(cè)其MK-7的含量。將含量較高的菌株斜面保存于4 ℃冰箱,再次傳斜面活化后進(jìn)行復(fù)篩。復(fù)篩時(shí)首先將斜面菌種接入種子培養(yǎng)基培養(yǎng),種子培養(yǎng)成熟后接入發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng),發(fā)酵結(jié)束檢測(cè)其MK-7的含量,保留產(chǎn)量穩(wěn)定的菌株制備甘油冷凍管(菌液添加20%甘油)保存于-80 ℃冰箱。

1.2.2 培養(yǎng)方法 平板與斜面培養(yǎng):將篩選獲得的菌種在種子培養(yǎng)基斜面上劃線并放在恒溫箱中37 ℃條件下培養(yǎng)8～12 h。

種子培養(yǎng):取30 mL種子培養(yǎng)基置于250 mL錐形瓶,將斜面培養(yǎng)后的菌種接種到種子培養(yǎng)基中,放置在搖床中37 ℃下200 r/min培養(yǎng)16～18 h。

發(fā)酵培養(yǎng):取30 mL發(fā)酵培養(yǎng)基置于250 mL錐形瓶,按10%的接種量,用移液管將培養(yǎng)好的種子接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中,放置在搖床中37 ℃下200 r/min培養(yǎng)4 d。

1.2.3 菌種鑒定方法 對(duì)篩選獲得的菌株分別采用16S rRNA基因和gyrB基因序列進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。將菌株采用CTAB法提取基因組DNA,以其為模板,設(shè)計(jì)正向引物和反向引物,進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后由上海生工生物工程完成測(cè)序。將測(cè)得的基因序列在GenBank中進(jìn)行搜索Blast比對(duì),尋找與其同源性最高且已知分類地位的菌種,并采用MEGA6.0軟件以鄰接(Neighbor Joining)法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[7]。PCR擴(kuò)增引物采用Prime premier 6軟件設(shè)計(jì)。擴(kuò)增16S rRNA基因所用引物為細(xì)菌通用引物,引物序列為:27F:AGAG TTTGATCCTGGCTCAG,1492R:GGTTACCTTGTTA CGACTT。擴(kuò)增gyrB基因所用引物為:F:CCCAA GCTTAACTGCACTGGGAAATYGTHGAYAAYAG,R:CGGAATTCGGATCC ACRTCGGCRTCBGTCATRAT。擴(kuò)增條件:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性30 s,55 ℃退火45 s,72 ℃延伸1 min;34個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。將PCR擴(kuò)增片段回收后送上海生工生物工程有限公司測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫對(duì)比,繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 發(fā)酵樣品中MK-7提取方法 按1.2.2發(fā)酵培養(yǎng)方法進(jìn)行發(fā)酵,采用有機(jī)溶劑液液萃取方式從發(fā)酵液中提取MK-7,選取正己烷與異丙醇(體積比為2∶1)作為萃取液,通過改變水相(發(fā)酵液)與有機(jī)相(萃取液)的比例,按水相:有機(jī)相體積比為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4進(jìn)行提取,確定最佳比例,后續(xù)提取均采用最佳比例進(jìn)行。萃取時(shí)將混合物置于渦旋振蕩儀上振蕩5 min,再將混合物3000 r/min離心10 min,吸取上層液體進(jìn)行濃縮。利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀對(duì)有機(jī)相進(jìn)行濃縮5 min,用錫箔紙包裹蒸發(fā)瓶進(jìn)行操作,濃縮后得到黃色油狀液體,加2 mL異丙醇溶解,放于1.5 mL離心管中,用錫箔紙包裹進(jìn)行避光保存,用于HPLC分析[8]。

1.2.5 樣品中MK-7的分析方法 采用高效液相色譜(HPLC)法對(duì)MK-7含量進(jìn)行測(cè)定。色譜柱為安捷倫ZORBAX Eclipse XDB-C18;流動(dòng)相為甲醇∶二氯甲烷(9∶1);流速:1.0 mL/min;柱溫:40 ℃;進(jìn)樣量:20 μL;紫外檢測(cè)波長(zhǎng):248 nm。將按照上所述提取方法得到的提取液經(jīng)微孔濾過膜(0.45 nm)過濾后進(jìn)樣。所有操作避光進(jìn)行[9]。

標(biāo)準(zhǔn)品的配制:準(zhǔn)確稱取10 mg MK7標(biāo)準(zhǔn)品于50 mL棕色容量瓶中,加入30 mL異丙醇充分溶解定容,并在恒溫水浴鍋振蕩1 h。然后按梯度稀釋成濃度分別為1、4、8、16和32 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液,用0.45 μm微孔濾膜過濾,液相色譜測(cè)定,以峰面積和標(biāo)準(zhǔn)品濃度制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

發(fā)酵液中的MK-7用1.2.4方法提取后用液相色譜測(cè)定,發(fā)酵液的MK-7濃度用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算獲得。

圖2 基于16S rRNA和gyrB基因的菌株ND系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 16S rRNA and gyrB gene sequence based phylogenetic tree for strain ND

1.2.6 發(fā)酵條件優(yōu)化方法 對(duì)高產(chǎn)菌種的碳源、氮源和無機(jī)鹽進(jìn)行單因素優(yōu)化。發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加不同種類的碳源甘油5%、蔗糖5%、葡萄糖5%和可溶性淀粉(5%),根據(jù)最終發(fā)酵液中MK-7的濃度確定最佳碳源種類,并對(duì)最佳碳源的使用濃度進(jìn)行考察,添加量設(shè)為5%、10%、15%、20%進(jìn)行發(fā)酵,確定最佳碳源濃度。

發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加8%、10%、12%、14%、16%大豆蛋白胨,根據(jù)發(fā)酵后MK-7的產(chǎn)量確定最佳氮源。

在添加最優(yōu)濃度的碳源和氮源條件下,對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基中的K2HPO4、CaCl2·2H2O、MgSO4·7H2O三種無機(jī)鹽的濃度進(jìn)行優(yōu)化。K2HPO4的濃度梯度設(shè)置為0.1、0.3、0.5、0.7和1.0 g/L,CaCl2·2H2O的濃度設(shè)置為0、0.1、0.2、0.3和0.4 g/L,MgSO4·7H2O的濃度設(shè)置為0.1、0.3、0.5和0.7 g/L。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次,取三次實(shí)驗(yàn)的平均值,采用Excel(Microsoft office 2010)軟件計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)誤并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)維生素K2菌株的篩選與鑒定

由于合成MK-7的主要菌種為芽孢桿菌屬微生物,本研究以芽孢桿菌屬微生物為篩選目標(biāo)[10-11],經(jīng)過初篩和復(fù)篩,獲得產(chǎn)量較高的5株菌(表1)。后續(xù)實(shí)驗(yàn)選定產(chǎn)量最高的菌株ND,并對(duì)其進(jìn)行分子生物學(xué)方法進(jìn)行鑒定。

表1 篩選出的菌株及其MK-7產(chǎn)量Table 1 Selected strains and its MK-7 yield

因?yàn)?6S rRNA的高度保守性,對(duì)相似率極高的近緣種無法做進(jìn)一步區(qū)分,而gyrB基因相對(duì)于16S rRNA基因具有較高的堿基替換率,因此比較適合親緣關(guān)系較近的菌種的區(qū)別和鑒定[12]。本研究采用兩種基因序列比對(duì)進(jìn)行菌種的鑒定。通過PCR擴(kuò)增分別獲得兩個(gè)基因序列,測(cè)序后與NCBI數(shù)據(jù)庫的序列進(jìn)行Blast比對(duì),并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。以16S rRNA序列構(gòu)建的進(jìn)化樹結(jié)果如圖2。從這兩種鑒定方法所獲得的結(jié)果來看,本實(shí)驗(yàn)所獲得的菌株ND屬于芽孢桿菌屬的一個(gè)分支,且與解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)的菌株同屬于一個(gè)類群。

2.2 樣品中MK-7的定性與定量測(cè)定

采用高效液相色譜對(duì)發(fā)酵液的提取物進(jìn)行定性和定量。取菌株ND的發(fā)酵液,按1.2.4所描述的方法對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行提取,并利用高效液相色譜檢測(cè)提取物中的MK-7,結(jié)果見圖3,圖中發(fā)酵產(chǎn)物特征峰保留時(shí)間在14.1 min,與MK-7標(biāo)準(zhǔn)品的液相色譜圖對(duì)比,兩峰保留時(shí)間相同,發(fā)酵產(chǎn)物特征峰為目標(biāo)產(chǎn)物MK-7。

圖3 發(fā)酵提取物和MK-7標(biāo)準(zhǔn)品的液相色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of fermented extracts and MK-7 standard

按1.2.5的方法對(duì)MK-7進(jìn)行液相色譜測(cè)定,以MK-7標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo),色譜峰面積為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)果見圖4。MK-7與峰面積具有良好的線性關(guān)系,其線性回歸方程為y=34.051x+8.7149,R2為0.9994。該線性方程可用來計(jì)算樣品中的MK-7濃度。

圖4 MK-7標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Standard calibration curve of MK-7

2.3 萃取液比例對(duì)MK-7提取的影響

MK-7是一種脂溶性維生素,所以提取MK-7主要通過使用有機(jī)溶劑液-液萃取的方式。常用的有機(jī)溶劑為異丙醇與正己烷的混合液[13-14]。為了確定萃取時(shí)最佳的萃取液與發(fā)酵液的比例,測(cè)定了不同比例下萃取效果,結(jié)果如圖5所示。在1∶1～1∶2時(shí)，隨著有機(jī)相體積比例增加,MK-7在有機(jī)相中的萃取效果逐漸提高,水相與有機(jī)相比例為1∶2時(shí)MK-7萃取效果最好,在水相∶有機(jī)相=1∶4時(shí)萃取效果最差,增大有機(jī)溶劑體積并不能提高M(jìn)K-7的萃取效果。萃取時(shí)需要對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行強(qiáng)烈渦旋震蕩,而添加過多的有機(jī)溶劑可能不利于震蕩時(shí)與發(fā)酵液及菌體充分混合和接觸,后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇萃取比例為水相與有機(jī)相比例為1∶2。

圖5 萃取過程中不同的水相 和有機(jī)相比例對(duì)MK-7提取的影響Fig.5 Effects of different proportion of water and organic on extraction of MK-7 phase

2.4 MK-7在菌體胞內(nèi)和胞外的分布

將發(fā)酵液離心分離菌體,將菌體和上清液分別進(jìn)行萃取和測(cè)定MK-7含量,確定MK-7在菌體胞內(nèi)外的分布,結(jié)果見圖6。MK-7大部分存在于細(xì)胞外,少量存在于細(xì)胞內(nèi)。將發(fā)酵液直接萃取獲得的MK-7產(chǎn)量比將菌體和發(fā)酵上清液分別萃取略低。上述結(jié)果提示大部分MK-7合成后分泌到細(xì)胞外。Sato等[15]在枯草芽孢桿菌中發(fā)現(xiàn)40%～65%的MK-7分泌到了細(xì)胞外,周子民等[16]也在納豆芽孢桿菌中發(fā)現(xiàn)有MK-7在發(fā)酵過程中有68%的分泌率,本研究的結(jié)果與其報(bào)道一致。

圖6 菌體胞內(nèi)和胞外MK-7的含量Fig.6 Concentration of MK-7 in intracellular and extracellular

2.5 發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.5.1 碳源對(duì)解淀粉芽孢桿菌ND合成MK-7的影響 比較了5%添加量的甘油、蔗糖、葡萄糖和可溶性淀粉幾種解淀粉芽孢桿菌的常用碳源對(duì)MK-7產(chǎn)量的影響,比較結(jié)果見圖7。使用甘油作為碳源其效果最為理想。部分文獻(xiàn)報(bào)道甘油是合成MK-7的最佳碳源,本論文結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致[14-16]。根據(jù)對(duì)解淀粉芽孢桿菌和MK-7的代謝途徑分析推測(cè),甘油分解后產(chǎn)生的3-磷酸甘油醛可以與丙酮酸通過DXP途徑合成MK-7的異戊二烯側(cè)鏈部分[17-18],因此推測(cè)甘油除了供微生物生長(zhǎng)之外,還為MK-7的合成提供前體,促進(jìn)菌體合成MK-7,故選擇甘油作為最佳碳源。

圖7 不同碳源對(duì)菌株ND合成MK-7的影響Fig.7 Effects of different carbon source on the yield of MK-7 production by ND

對(duì)甘油的使用濃度進(jìn)行了考察,從圖8可以看出,當(dāng)甘油濃度為5%時(shí),MK-7產(chǎn)量最高,因此選擇5%濃度的甘油作為發(fā)酵碳源。甘油濃度較高并不利于MK-7合成,可能高濃度甘油對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)有一定的抑制作用,在其他種類微生物中已有報(bào)道[19-20],碳源最終選擇濃度為濃度為5%。

圖8 碳源濃度對(duì)菌株ND合成MK-7的影響Fig.8 Effects of carbon source concentration on the yield of MK-7 production by ND

2.5.2 氮源濃度對(duì)解淀粉芽孢桿菌ND合成MK-7的影響 一些MK-7含量較豐富的發(fā)酵食品,例如日本傳統(tǒng)發(fā)酵食品納豆[21-22],通常以大豆作為原料進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵,而在大多數(shù)文獻(xiàn)中,大豆蛋白胨是合成 MK-7的最佳氮源[13-16],因此選用大豆蛋白胨作為氮源,研究了不同的大豆蛋白胨濃度對(duì)菌體合成MK-7產(chǎn)量的影響,結(jié)果見圖9。12%的大豆蛋白胨作為氮源,MK-7產(chǎn)量最高,達(dá)到了63 mg/L。大豆蛋白胨中含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、生長(zhǎng)因子,作為氮源能促進(jìn)微生物生長(zhǎng),但氮源濃度過高,導(dǎo)致碳氮比失衡菌體過度生長(zhǎng),其他養(yǎng)分被過早耗盡,菌體衰老而不利于產(chǎn)物的合成[23],因此MK-7產(chǎn)量隨之下降。

圖9 氮源濃度對(duì)菌株ND合成MK-7的影響Fig.9 Effects of carbon source concentration on the yield of MK-7 production by ND

2.5.3 無機(jī)鹽濃度對(duì)解淀粉芽孢桿菌ND合成MK-7的影響 在獲得最佳碳源和氮源的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步考察了無機(jī)鹽對(duì)維生素K2合成的影響，結(jié)果見圖10～圖12。結(jié)果表明三種無機(jī)鹽均對(duì)MK-7的合成具有一定的影響,最佳的添加濃度分別是K2HPO4濃度為0.7 g/L,CaCl2·2H2O濃度為0.2 g/L,MgSO4·7H2O濃度為0.5 g/L。適當(dāng)濃度的鈣離子和鎂離子都對(duì)MK-7合成具有一定的促進(jìn)作用。添加0.2 g/L CaCl2·2H2O,菌株ND合成MK-7的產(chǎn)量達(dá)到70 mg/L以上,高于多數(shù)被報(bào)道過的芽孢桿菌屬微生物[24-25]。磷酸鹽是菌體生長(zhǎng)的主要營(yíng)養(yǎng)成分之一,適量的磷酸鹽在發(fā)酵過程中可以促進(jìn)菌體生長(zhǎng),也能夠直接或間接影響代謝物的合成。金屬離子一般通過影響某些酶的活性而影響產(chǎn)物的合成[23]。有不少文獻(xiàn)報(bào)道了金屬離子對(duì)微生物發(fā)酵的影響,無機(jī)鹽一般在低濃度是對(duì)微生物生長(zhǎng)有促進(jìn)作用,在高濃度時(shí)有抑制作用,不同微生物對(duì)無機(jī)鹽的需求范圍不同[26-27]。

圖10 K2HPO4濃度對(duì)MK-7產(chǎn)量的影響Fig.10 Effects of K2HPO4 concentration on the yield of MK-7

圖11 CaCl2·2H2O濃度對(duì)MK-7產(chǎn)量的影響Fig.11 Effects of CaCl2·2H2O concentration on the yield of MK-7

圖12 MgSO4·7H2O濃度對(duì)MK-7產(chǎn)量的影響Fig.12 Effects of MgSO4·7H2O concentration on the yield of MK-7

3 結(jié)論

本研究通過篩選獲得一株高產(chǎn)MK-7的微生物,將該菌的gyrB基因和16S rRNA與其他微生物的基因進(jìn)行比對(duì),確定該菌株屬于芽孢桿菌屬,且與解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)的菌株同屬于一個(gè)類群。對(duì)該MK-7高產(chǎn)菌株的產(chǎn)物提取進(jìn)行優(yōu)化,最優(yōu)提取溶劑比例為有機(jī)相(正己烷∶異丙醇=2∶1):水相(發(fā)酵液)=2∶1。將發(fā)酵液的菌體和上清液分別進(jìn)行萃取和測(cè)定MK-7含量,確定MK-7大部分分泌到胞外。對(duì)培養(yǎng)基中的幾個(gè)重要組分(碳源、氮源和無機(jī)鹽)及使用濃度進(jìn)行單因素優(yōu)化,甘油是MK-7合成的最佳碳源,添加的最適濃度為5%;大豆蛋白胨最適濃度為12%。適當(dāng)濃度的磷酸鹽和金屬離子Ca2+、Mg2+對(duì)MK-7合成有促進(jìn)作用,添加的最適濃度分別是K2HPO40.7 g/L,CaCl2·2H2O 0.2 g/L,MgSO4·7H2O 0.5 g/L。利用優(yōu)化后的培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng),最終該菌株合成MK-7的最高產(chǎn)量達(dá)到70 mg/L以上。