撒玉良,劉盼盼,張敏敏,陳 文

(石河子大學(xué)藥學(xué)院,新疆植物藥資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,新疆石河子 832002)

薰衣草(LavandulaangustifoliaMill.)別名香水植物,是一種珍貴的天然香料,主要分布于地中海沿岸的國家,新疆伊犁是中國薰衣草的最大的生產(chǎn)基地。薰衣草精油提取自花穗,香氣宜人,因此作為賦香的主要成分在化妝品和醫(yī)藥方面有廣泛的用途[1]。近年來有關(guān)薰衣草精油在鎮(zhèn)靜助眠、抗焦慮、止痛等藥理作用方面有大量研究[2-5]。它是一種復(fù)雜的混合物,其中以芳樟醇和乙酸芳樟脂的含量最多[6],兩者總含量達(dá)到60%以上。

緩釋制劑是指通過延緩藥物從制劑中的釋放速率,降低藥物進(jìn)入體內(nèi)的吸收速率,從而起到更好的治療效果的制劑。對于精油的緩釋制劑主要是通過包合物、脂質(zhì)體等方法增加精油的穩(wěn)定性,減緩精油揮發(fā)速率,當(dāng)前精油緩釋制劑對于精油的釋放速率的控制還沒有較好的控制方法,對于精油的外用制劑研究較少,因此,本文通過采用不同材料包合與外用制劑自身對精油的緩釋作用,制備具有恒速釋放的精油外用制劑[7-8]。

本文針對薰衣草精油在外用制劑中的研究現(xiàn)狀,結(jié)合增加薰衣草精油穩(wěn)定性的包合技術(shù),研究薰衣草精油以及β-環(huán)糊精(β-CD)包合物、羥丙基-β-環(huán)糊精(Hp-β-CD)包合物在4種軟膏基質(zhì)中的釋放特點(diǎn),調(diào)整三者加入比例,構(gòu)建一種初期速釋后期恒速釋放的精油軟膏系統(tǒng),為薰衣草精油以及其他揮發(fā)性成分在外用制劑中的應(yīng)用奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

薰衣草精油 新疆伊犁;昆明小鼠 健康雄性,48只,5～6周齡,體重為20～23 g,購買于新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,許可證號:SCXK(新)-2019-0003;羊毛脂 天津福晨化學(xué)試劑廠;凡士林 天津市福晨化學(xué)試劑廠;β-CD、PEG4000、十八醇、Hp-β-CD 天津市盛奧化學(xué)試劑有限公司;液狀石蠟、三乙醇胺 天津市東天正精細(xì)化學(xué)試劑;硬脂酸 天津市東天正精細(xì)化學(xué)試劑;吐溫80、司盤80、丙三醇 天津市富宇精細(xì)化工有限公司;PEG600、尼泊爾金乙酯 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所;蒸餾水 自制;5-羥色胺(5-HT)、多巴胺(DA)、去甲腎上腺素(NE)試劑盒 上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

KQ-500DE數(shù)字化超聲清洗儀 昆山市超聲儀器有限公司;6890氣相色譜儀 美國Agilent公司;DB-YSD-1C小動(dòng)物自主活動(dòng)測定儀 北京智鼠多寶生物科技有限責(zé)任公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 薰衣草精油含量測定

1.2.1.1 氣相色譜條件 色譜柱:HP-5 30 m×0.25 mm×0.25 μm;載氣:氮?dú)?流速為2.0 mL/min,進(jìn)樣口溫度為250 ℃,柱箱升溫程序?yàn)?初始柱溫80 ℃,以15 ℃·min-1的速率升溫至150 ℃(保持1 min),繼續(xù)以15 ℃·min-1的速率升至260 ℃(保持1 min),分流比為35∶1,進(jìn)樣體積1 μL,FID檢測器溫度為300 ℃,氮?dú)饬髁?5 mL·min-1,空氣流量350 mL·min-1,氫氣流量35 mL·min-1,隔墊吹掃為3 mL·min-1。

1.2.1.2 芳樟醇對照品線性考察 精密稱取芳樟醇對照品8.5 mg置于10 mL的容量瓶中,用一定量的丙酮稀釋并定容至刻度線,即得對照品溶液母液。精密量取一定量的芳樟醇對照品母液于5 mL的容量瓶中,分別配制成質(zhì)量濃度為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg·mL-1的對照品溶液,通過0.22 μm的微孔有機(jī)濾膜進(jìn)行過濾,備用。

1.2.1.3 專屬性試驗(yàn) 精密吸取芳樟醇對照品溶液、薰衣草精油溶液、以及空白對照(丙酮),按照1.2.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣,進(jìn)行圖譜對比。

1.2.1.4 精密度考察 吸取高、中、低質(zhì)量濃度(0.05、0.40、0.85 mg·mL-1)的芳樟醇對照品溶液,連續(xù)進(jìn)樣6次,分別記錄芳樟醇的峰面積,并計(jì)算其RSD。

1.2.1.5 穩(wěn)定性考察 吸取中等質(zhì)量濃度的芳樟醇對照品溶液(0.40 mg·mL-1),在制備后的0、2、4、6、8、10、12、18和24 h,按照1.2.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣,記錄芳樟醇在不同時(shí)間點(diǎn)的色譜峰峰面積,計(jì)算其RSD。

1.2.1.6 加樣回收率 精密量取薰衣草精油5份,每份2.0 mL,分別加入一定濃度的芳樟醇對照品溶液各1 mL,按照1.2.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣,計(jì)算芳樟醇的加樣回收率。

1.2.2 不同基質(zhì)薰衣草精油軟膏的制備

1.2.2.1 油性軟膏基質(zhì)的制備 稱取凡士林8.0 g,羊毛脂2.0 g,液體石蠟2.0 g,將稱取的凡士林、羊毛脂、液體石蠟置于燒杯中,于80 ℃的恒溫水浴鍋中加熱融化后混合均勻,慢慢加入薰衣草精油1.5 g,持續(xù)攪拌至冷凝,即得薰衣草精油油性軟膏[9]。

1.2.2.2 水性軟膏基質(zhì)的制備 按PEG600與PEG4000質(zhì)量比為6∶4分別稱取PEG600 7.2 g,PEG4000 4.8 g,置于燒杯中與80 ℃水浴條件下加熱熔融,混合均勻后,加入薰衣草精油1.5 g,在不停攪拌下冷卻至室溫,即得薰衣草精油水溶性軟膏。

1.2.2.3 水包油(O/W)軟膏基質(zhì)的制備 稱取凡士林3.0 g、硬脂酸1.0 g、單硬脂酸甘油酯1.0 g置于適當(dāng)?shù)臒?加熱至80 ℃左右融化,向其中加入1.5 g薰衣草精油,混合均勻。另取吐溫80 2.0 g、丙三醇2.0 g、水4.0 g,將其加熱至油相相同的溫度,將油相在600 r/min攪拌條件下緩慢加入水箱中,直至全部乳化后,置于室溫條件下攪拌至冷凝即得[10]。

1.2.2.4 油包水(W/O)軟膏基質(zhì)的制備 稱取羊毛脂3.0 g、凡士林3.0 g、液體石蠟3.0 g、單硬脂酸甘油酯1.0 g加熱至80 ℃熔融,再加入薰衣草精油1.5 g,混合均勻;另取司盤80 1.2 g、甘油2.0 g、水2.0 g混合溶解并加熱至同樣的溫度,在600 r/min的攪拌條件下,將水相緩慢加入油相中,直至全部乳化后放置冷卻即得。

1.2.3 薰衣草精油軟膏釋放度測定方法及釋放曲線繪制 稱取已制備好的軟膏同等質(zhì)量,均勻涂抹在口徑為5 cm的10個(gè)稱量瓶中,將稱量瓶置于37 ℃的水浴鍋中,在恒溫條件下釋放一定的時(shí)間,分別在0、0.5、1、2、3、4、6、8、10 h向稱量瓶中加入5 mL的丙酮溶液,在500 W的超聲條件下超聲萃取20 min,將超聲處理后的軟膏丙酮溶液,采用微孔濾膜進(jìn)行過濾,采用GC法進(jìn)行測定,繪制釋放曲線。

測定不同時(shí)刻的薰衣草精油在油性基質(zhì)、水溶性基質(zhì)、水包油基質(zhì)以及油包水基質(zhì)中殘留量,將所測定的色譜峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中求出丙酮萃取液中薰衣草精油的濃度,按照以下公式計(jì)算累計(jì)釋放率:

其中:C0、V0為釋放0 h時(shí)丙酮萃取液的濃度(mg/mL)及體積(mL),Ci、Vi分別為某個(gè)時(shí)間萃取液的濃度(mg/mL)及體積(mL)。

1.2.4 薰衣草精油釋放評價(jià)方法 根據(jù)《中國藥典》對于緩控釋制劑的指導(dǎo)原則,采用綜合評分的方法,對處方中1、6、10 h的累計(jì)釋放度分別為30%、50%、80%作為考察指標(biāo),對其進(jìn)行加權(quán)評價(jià),評分公式為:

L=|L1-30%|×100+|L6-50%|×100+|L10-80%|×100

其中,L值越小,越接近于藥典規(guī)定的緩控釋制劑的釋放過程,其緩釋系統(tǒng)越好[11]。

1.2.5 薰衣草精油包合物的制備及表征

1.2.5.1 薰衣草精油β-CD包合物的制備 準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量的β-CD,置于適宜容積的燒杯中,加入一定量的蒸餾水,在80 ℃水浴條件下攪拌配制成飽和水溶液,按照芯材比為1∶5稱取薰衣草精油,并用相同體積的無水乙醇稀釋后,在攪拌溫度為45 ℃,攪拌速率為400 r·min-1的條件下緩慢加入已制備好的β-CD的飽和溶液中,包合2.0 h后冷卻至室溫,放置于4 ℃的冰箱中過夜,抽濾,將濾餅用無水乙醇沖洗3次后,在50 ℃的鼓風(fēng)干燥箱中干燥,即得β-環(huán)糊精包合物[12-14]。

1.2.5.2 薰衣草精油Hp-β-CD包合物的制備 精密稱取Hp-β-CD 4.0 g,加入40 mL的蒸餾水中,在35 ℃條件下攪拌,制備成澄清溶液,取精油1.0 g,用同樣體積的無水乙醇稀釋混勻,在攪拌速率為400 r·min-1,水浴溫度為35 ℃條件下緩慢加入已制備好的Hp-β-環(huán)糊精溶液中,包合1.5 h后,冷卻至室溫,在4 ℃條件下放置過夜,在-92 ℃條件下冷凍干燥,將干燥產(chǎn)物用丙酮洗滌3次,干燥即得Hp-β-環(huán)糊精包合物[15-16]。

1.2.5.3 包合物紅外表征 采用KBr壓片法。光譜條件:分辨率:4 cm-1,掃描速度:0.6329 cm-1/s,光圈:100 μm×100 μm,光譜范圍:4000～400 cm-1。分別對薰衣草精油、β-CD(Hp-β-CD)、β-CD(Hp-β-CD)與薰衣草精油的物理混合物以及薰衣草精油β-CD(Hp-β-CD)包合物樣品紅外區(qū)間吸收峰的變化進(jìn)行分析。

1.2.6 精油包合物加入對薰衣草精油軟膏釋放的影響

1.2.6.1 不同環(huán)糊精類型的包合物對精油釋放的影響 根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選擇O/W乳膏基質(zhì)作為研究對象,按照1.2.2項(xiàng)下的水性乳膏制備方法制備乳膏基質(zhì),在制備的乳膏基質(zhì)中加入精油以及相等于精油質(zhì)量的Hp-β-CD包合物和β-CD包合物,并按照1.2.3項(xiàng)下的釋放方法進(jìn)行測定,并對其結(jié)果進(jìn)行綜合評分和分析。

1.2.6.2 不同比例的精油與β-CD包合物加入乳膏基質(zhì)對精油釋放的影響 根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,將釋放速率最快的精油和釋放速率最慢的β-CD包合物按照一定的比例(精油與包合物中所含精油的質(zhì)量比)加入乳膏基質(zhì)中,依次按照精油:β-CD包合物為1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1制備乳膏,并測定其累計(jì)釋放率,計(jì)算綜合評分L。

1.2.6.3 不同比例的精油與Hp-β-CD包合物加入乳膏基質(zhì)對精油釋放的影響 根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,將釋放速率最快的精油和釋放速率最慢的Hp-β-CD包合物按照一定的比例(精油與包合物中所含精油的質(zhì)量比)加入乳膏基質(zhì)中,依次按照精油:Hp-β-CD包合物為1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1制備乳膏,并測定其累計(jì)釋放率,計(jì)算綜合評分L。

1.2.6.4 不同比例的精油與兩種包合物加入乳膏基質(zhì)對精油釋放的影響 根據(jù)以上對精油和兩種包合物在乳膏中的比例選擇結(jié)果可知,當(dāng)加入精油過多時(shí),釋放過程中會出現(xiàn)突釋現(xiàn)象,而包合物比例過高,精油10 h累計(jì)釋放量不能滿足緩釋制劑的要求,結(jié)合以上結(jié)果推斷精油比例為70%～85%時(shí),制備的乳膏緩釋效果較好。因此,根據(jù)精油和兩種環(huán)糊精包合物在O/W乳膏中的釋放速率不同,改變精油:Hp-β-CD包合物:β-CD包合物為5∶1∶1、6∶1∶1、10∶2∶1、20∶3∶2、25∶4∶1,分別制備乳膏,測定其累計(jì)釋放率計(jì)算累計(jì)釋放率綜合評分L。

1.2.7 薰衣草精油緩釋乳膏藥效學(xué)評價(jià)

1.2.7.1 失眠模型的建立及判斷 PCPA溶液配制:根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,以小鼠腹腔注射劑量為350 mg·kg-1,用生理鹽水進(jìn)行溶解,用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH為7～8,配制成給藥體積為0.01 mL·g-1的PCPA混懸液,在每天早上10點(diǎn)左右,除對照組小鼠外,其余小鼠通過腹腔注射PCPA混懸液進(jìn)行失眠模型的建立,連續(xù)注射2 d,第一次腹腔注射PCPA混懸液后,28～30 h后,小鼠出現(xiàn)晝夜節(jié)律消失,白天活動(dòng)不停,睡眠時(shí)間減少,食量減少以及飲水量增加。在第一次給藥36 h后,對照組及造模組進(jìn)行戊巴比妥鈉翻正實(shí)驗(yàn),記錄對照組和模型組的睡眠潛伏期和睡眠持續(xù)時(shí)間,根據(jù)兩組中的睡眠潛伏期和睡眠持續(xù)時(shí)間判斷失眠模型是否復(fù)制成功[17-18]。

1.2.7.2 實(shí)驗(yàn)分組及方法 取健康昆明小鼠48只,采用隨機(jī)數(shù)字表法分為4組,每組12只,分為對照組(生理鹽水)、模型組(空白乳膏基質(zhì))、薰衣草精油組(50 mg純精油加30 mL的溫開水配制成的香薰液)以及緩釋乳膏組(相當(dāng)于50 mg薰衣草精油的緩釋乳膏),每天10點(diǎn)進(jìn)行香薰,香薰8 h,連續(xù)香薰5 d[19-20]。

1.2.7.3 小鼠體重變化 PCPA藥物造模法復(fù)制的失眠模型造成小鼠失眠后,會出現(xiàn)食量減少,飲水增多,毛色發(fā)黃,具有攻擊性等特點(diǎn),在造模前和香薰結(jié)束時(shí),分別稱取各組小鼠體重,對比體重增加量。

1.2.7.4 薰衣草精油緩釋乳膏對戊巴比妥鈉小鼠睡眠時(shí)間的影響 在通過戊巴比妥鈉翻正實(shí)驗(yàn)睡眠潛伏期和睡眠持續(xù)時(shí)間的對比,確定造模成功后,除對照組和模型組不進(jìn)行香薰外,薰衣草精油組和緩釋乳膏組在香薰盒中分別以含有50 mg的薰衣草精油香薰液以及相當(dāng)于50 mg精油的緩釋乳膏,通過加熱裝置在37 ℃條件下,香薰8 h,連續(xù)香薰5 d,在最后一次香薰結(jié)束1 h后,通過腹腔注射給予小鼠50 mg·kg-1戊巴比妥鈉(通過前期預(yù)實(shí)驗(yàn)所得到的引起100%小鼠睡眠的最小劑量),分別觀察和記錄各組小鼠的睡眠潛伏期和睡眠持續(xù)時(shí)間,進(jìn)行比較。

1.2.7.5 薰衣草精油緩釋乳膏對小鼠自主活動(dòng)的影響 將各組小鼠連續(xù)香薰5 d,每天8 h,在最后一次香薰結(jié)束后30 min 內(nèi),將小鼠置于一個(gè)干凈的鼠籠中,適應(yīng)2 min 后,打開小鼠自主活動(dòng)測定儀,測定和記錄5 min內(nèi)小鼠活動(dòng)的次數(shù),比較各組自主活動(dòng)差異性。

1.2.7.6 小鼠下丘腦中5-HT、NE以及DA含量變化 在連續(xù)香薰5 d后,快速斷頭處死,在冰塊上快速剝離小鼠腦組織,稱重后置于已準(zhǔn)備好的冷凍管中,放入液氮中進(jìn)行快速冷凍后,將其移至-80 ℃的超低溫冰箱中,采用ELISA試劑盒進(jìn)行三種神經(jīng)遞質(zhì)測定,測定方法按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行測定,對各組小鼠腦組織中的5-HT、DA和NE的含量進(jìn)行比較[21]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用SPAA 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間比較用單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 薰衣草精油方法學(xué)考察

2.1.1 線性考察 按照1.2.1項(xiàng)下的實(shí)驗(yàn)方法,以縱坐標(biāo)為氣相色譜峰峰面積,橫坐標(biāo)為兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,芳樟醇標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為A=20052c+228.8,R2=0.9992。

圖1 芳樟醇標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Linalool standard curve

2.1.2 專屬性考察 根據(jù)1.2.1項(xiàng)下的專屬性考察方法和色譜條件進(jìn)樣測定,其色譜圖見圖2,結(jié)果顯示在該色譜條件下,對照品與薰衣草精油溶液中的芳樟醇出峰位置一致,均為6.1 min,而空白試劑丙酮對其出峰無影響。

圖2 薰衣草精油(A)、芳樟醇(B)和陰性對照色譜圖Fig.2 Chromatograms of lavender essential oil(A), linalool(B)and negative control注:A:薰衣草精油溶液;B:芳樟醇對照品溶液; C:丙酮;1:丙酮;2:芳樟醇對照品。

2.1.3 精密度考察 吸取高、中、低三個(gè)質(zhì)量濃度的芳樟醇對照品溶液,連續(xù)進(jìn)樣6次,結(jié)果顯示其峰面積RSD分別為1.35%、0.59%、2.85%(n=6),表明精密度良好。

2.1.4 穩(wěn)定性考察 根據(jù)1.2.1項(xiàng)下的穩(wěn)定性考察方法和色譜條件進(jìn)行測定,結(jié)果顯示在對照品溶液制備后0、2、4、6、8、10、12、18和24 h其色譜峰面積RSD為2.4%,表明芳樟醇在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.5 加樣回收率 根據(jù)1.2.1項(xiàng)下的加樣回收率考察方法和色譜條件,得到芳樟醇平均加樣回收率為98%±1.2%(n=5)。

2.2 薰衣草精油軟膏釋放度測定方法及釋放曲線繪制

采用1.2.1項(xiàng)下精油釋放及測定方法所得精油及其在不同軟膏基質(zhì)中的釋放曲線見圖3,計(jì)算各種基質(zhì)軟膏的累計(jì)釋放綜合評分,其結(jié)果見表1。

表1 不同基質(zhì)累計(jì)釋放率綜合評分Table 1 Comprehensive scores of cumulative release rates of different substrates

圖3 薰衣草精油在不同基質(zhì)中的釋放曲線Fig.3 Release curve of lavender essential oil in different matrices

由圖3的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出,將薰衣草精油加入4種基質(zhì)中的任何一種機(jī)制,其對于精油的釋放均有一定的緩釋作用,純薰衣草精油在4 h釋放95%以上,而且其在0～2 h時(shí)的釋放速率較快,能夠很快達(dá)到一定濃度,在4 h以后精油的釋放基本結(jié)束,不具有緩釋作用。將薰衣草精油加入不同類型的基質(zhì)中,其釋放速率具有明顯的減弱,能夠達(dá)到一定的緩釋作用。根據(jù)表1的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),L值越小,表示精油在該基質(zhì)中的釋放越接近于《中國藥典》規(guī)定的緩釋制劑的釋放規(guī)律,根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)該選擇W/O基質(zhì)作為研究對象,但是W/O基質(zhì)在使用過程中有難以清洗、容易污染,以及不利于皮膚通透性等缺點(diǎn),因此選擇O/W乳膏基質(zhì)作為研究對象,進(jìn)一步薰衣草精油緩釋系統(tǒng)進(jìn)行研究。

2.3 薰衣草精油包合物紅外表征

薰衣草精油包合物若衛(wèi)星城,則基本為兩者的混合物IR圖形,主要呈現(xiàn)兩者光譜的疊加,若包合物已形成,則揮發(fā)油分子的紅外振動(dòng)受到限制,整個(gè)包合物主要應(yīng)呈現(xiàn)β-CD、Hp-β-CD的IR圖形。利用這種性質(zhì),可以判斷包合物是否包合成功。由圖4、圖5可知，薰衣草精油特征峰在1744 cm-1處,β-CD和Hp-β-CD在此處沒有特征吸收峰,薰衣草精油與β-CD、Hp-β-CD的混合物在1742 cm-1處有薰衣草經(jīng)的特征吸收峰,而薰衣草精油β-CD包合物中這些吸收峰明顯減弱,表明薰衣草精油與β-CD、Hp-β-CD結(jié)合生成了新的物相,而非簡單的物理混合。

圖4 β-CD包合物紅外色譜圖Fig.4 Infrared chromatograms of β-CD inclusion complex注:A：精油;B:物理混合物; C:薰衣草精油β-CD包合物;D:β-CD。

圖5 Hp-β-CD包合物紅外光譜圖Fig.5 Infrared chromatograms of Hp-β-CD inclusion complex注:A:薰衣草精油;B:物理混合; C:Hp-β-CD包合物;D:Hp-β-CD。

2.4 精油包合物加入對于薰衣草精油軟膏釋放的影響

2.4.1 不同環(huán)糊精類型的包合物對精油釋放的影響 采用1.2.6項(xiàng)下的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn),將不同的乳膏進(jìn)行體外釋放,并進(jìn)行釋放曲線的擬合,計(jì)算曲線的累計(jì)釋放綜合評分,結(jié)果見圖6。

圖6 不同類型環(huán)糊精包合物對精油釋放的影響Fig.6 Effects of different types of cyclodextrin inclusion complexes on essential oil release

通過圖6可知,精油乳膏、Hp-β-CD包合物乳膏以及β-CD包合物乳膏對于薰衣草精油的釋放都具有一定的緩釋作用,其緩釋效果依次為β-CD包合物乳膏、Hp-β-CD包合物乳膏以及精油乳膏,其中β-CD包合物乳膏和Hp-β-CD乳膏可能是由于其精油釋放過程要通過兩次釋放,因此對精油的緩釋作用更強(qiáng),而Hp-β-CD較β-CD其水溶性較好,因此釋放速度快于β-CD包合物乳膏。薰衣草精油、精油乳膏、Hp-β-CD包合物乳膏、β-CD包合物乳膏綜合評分L值分別為93.60、66.95、67.08、103.69,Hp-β-CD包合物乳膏的釋放,最接近藥典規(guī)定的緩釋制劑,其L值為67.08,而β-CD包合物乳膏因其釋放速率最慢,而不符合緩釋制劑的釋放過程。因此可以利用三種不同類型的乳膏的釋放速率,改變精油、β-CD包合物、Hp-β-CD包合物的比例,建立一個(gè)良好的薰衣草精油緩釋系統(tǒng)。

2.4.2 不同比例的精油與β-CD包合物加入乳膏基質(zhì)對精油釋放的影響 采用1.2.6項(xiàng)下的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn),將不同的乳膏進(jìn)行體外釋放,并進(jìn)行釋放曲線的擬合,計(jì)算曲線的累計(jì)釋放綜合評分,其結(jié)果見圖7。

圖7 不同比例的精油與β-CD包合物對精油釋放的影響Fig.7 Effects of different proportions of essential oils and β-CD inclusion complex on essential oil release

由圖7可知,按照不同比例向乳膏基質(zhì)中加入薰衣草精油與β-CD包合物,因精油本身揮發(fā)性較高,所以乳膏中精油的釋放速率隨著精油所占比例的增加而加快,而且精油含量較高的乳膏,其在10 h精油的累計(jì)釋放率最高,由圖7的釋放曲線還可以得出,包合物的比例較高時(shí),其曲線趨近于零級釋放曲線,釋放速率趨近于恒速,而精油比例增加時(shí),其釋放曲線趨近于一級釋放,其釋放速率呈現(xiàn)逐漸減小的趨勢。隨著精油比例增加綜合評分L值依次為83.21、70.91、57.7、41.33、28.49,隨著入乳膏中精油的比例增加,其體外釋放越接近于《中國藥典》規(guī)定的緩釋制劑,因此精油與β-CD包合物的比例為5∶1時(shí),作為緩釋制劑更為適合。

2.4.3 不同比例的精油與Hp-β-CD包合物加入乳膏基質(zhì)對精油釋放的影響 采用1.2.6項(xiàng)下的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn),將不同的乳膏進(jìn)行體外釋放,并進(jìn)行釋放曲線的擬合,計(jì)算曲線的累計(jì)釋放綜合評分,其結(jié)果見圖8。

圖8 不同比例的精油與Hp-β-CD包合物 對精油釋放的影響Fig.8 Effects of different proportions of essential oils and Hp-β-CD inclusion complex on essential oil release

根據(jù)圖8所示的釋放曲線可知,隨著乳膏中的純薰衣草精油的比例不斷的增加,釋放過程的前4 h的釋放速率再明顯增大,而且其10 h的累計(jì)釋放量也在不斷的增加,隨精油比例增加,乳膏的釋放越接近于緩釋制劑釋放的規(guī)律,如果精油的比例繼續(xù)增大,綜合評分L值依次為44.52、28.44、28.98、26.08、21.21,因此精油與Hp-β-CD包合物的比例不能再增大,選擇精油與Hp-β-CD的比例為5∶1,進(jìn)一步研究。

2.4.4 不同比例的精油與兩種包合物加入乳膏基質(zhì)對精油釋放的影響 采用1.2.6項(xiàng)下的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行乳膏制備,將不同的乳膏進(jìn)行體外釋放,并進(jìn)行釋放曲線的擬合,計(jì)算曲線的累計(jì)釋放綜合評分,其結(jié)果見圖9。

圖9 不同比例的精油與兩種包合物對精油釋放的影響Fig.9 Effects of different proportions of essential oils and two inclusion complexes on essential oil release

如圖9所示,在不改變Hp-β-CD包合物與β-CD包合物的比例時(shí),只增加精油的量,前期釋放速率增加,而后期釋放速率變化不大,總的累計(jì)釋放率幾乎無變化;在增加精油比例的同時(shí),增加Hp-β-CD包合物的比例時(shí),其前期釋放速率和中期釋放速率均有所增加;增加β-CD包合物的比例時(shí),后期釋放速率未見顯著增加,因此在整個(gè)系統(tǒng)中β-CD包合物的比例不宜太高,不然會影響總累計(jì)釋放率。當(dāng)比例為10∶2∶1時(shí),綜合評分為20.53,其釋放規(guī)律最符合《中國藥典》規(guī)定的緩釋制劑的釋放過程,因此,選擇薰衣草精油:Hp-β-CD包合物:β-CD包合物比例為10∶2∶1加入O/W乳膏基質(zhì)作為精油的緩釋系統(tǒng),即當(dāng)三者之間薰衣草精油百分比為75%、15%和10%時(shí),該緩釋乳膏系統(tǒng)對精油釋放效果最好。

2.5 薰衣草精油緩釋乳膏藥效學(xué)評價(jià)

2.5.1 失眠模型的建立 根據(jù)1.2.7項(xiàng)下的方法建立失眠模型,采用戊巴比妥鈉翻正實(shí)驗(yàn)根據(jù)對照組和造模組睡眠潛伏期和睡眠持續(xù)時(shí)間的變化,確定小鼠失眠模型是否復(fù)制成功,各組睡眠時(shí)間見表2。

表2 對照組和模型組造模結(jié)束后翻正實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of the correction test after the end of modeling in the control group and the model group

注:與對照組相比,*表示差異顯著,P<0.05;**表示差異極顯著,P<0.01。

根據(jù)表2可知,對照組和造模組之間通過腹腔注射戊巴比妥鈉引起的睡眠潛伏期和睡眠持續(xù)時(shí)間之間均存在極顯著性差異(P<0.01),實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明,失眠模型復(fù)制成功。

2.5.2 小鼠體重變化 在小鼠造模前和香薰實(shí)驗(yàn)結(jié)束后分別稱量每組小鼠的體重,并進(jìn)行記錄,通過體重差異計(jì)算各組小鼠體重增加量,其結(jié)果見表3。

表3 各組小鼠體重增加量Table 3 Weight gain of each group of mice

注:與對照組相比,*代表差異顯著，P<0.05,**代表差異極顯著，P<0.01;與模型組相比,#代表差異顯著，P<0.05,##代表差異極顯著，P<0.01；表4～表6同。

通過SPSS數(shù)據(jù)分析軟件對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析,采用方差分析,4個(gè)組整體比較有顯著性差異,對各組單因素方差分析,模型組與對照組比,體重增加量極顯著減少(P<0.01),薰衣草精油組和乳膏組與模型組相比,體重增加量明顯,存在顯著性差異(P<0.05)。

2.5.3 薰衣草精油緩釋乳膏對小鼠睡眠時(shí)間的影響 通過1.2.7項(xiàng)下的給藥方法,連續(xù)香薰5 d 后,在最后一次給藥結(jié)束60 min后,通過腹腔注射戊巴比妥鈉溶液,分別記錄各組小鼠睡眠潛伏期和睡眠持續(xù)時(shí)間,其結(jié)果見表4所示。

表4 各組小鼠香薰實(shí)驗(yàn)結(jié)束后戊巴比妥鈉睡眠時(shí)間結(jié)果Table 4 Results of the correction of pentobarbital sodium after the end of the aromatherapy experiment in each group of mice

表6 不同處理組小鼠下丘腦中5-HT、DA、NE的表達(dá)值Table 6 Expression of 5-HT,DA and NE in the hypothalamus of mice in different treatment groups

通過對不同處理方法處理的小鼠睡眠潛伏期和睡眠時(shí)間進(jìn)行比較,從睡眠潛伏期分析,模型組與對照組相比,模型組小鼠睡眠潛伏期較長,存在極顯著性差異(P<0.01);薰衣草精油組和乳膏組與模型組相比,薰小鼠睡眠潛伏期明顯縮短,存在極顯著性差異(P<0.01)。從睡眠持續(xù)時(shí)間進(jìn)行分析,模型組與對照組相比,睡眠持續(xù)時(shí)間均縮短,存在極顯著性差異(P<0.01);薰衣草精油組和乳膏組與模型組相比,睡眠持續(xù)時(shí)間增加,存在顯著性差異(P<0.05)。

2.5.4 薰衣草精油緩釋軟膏對小鼠自主活動(dòng)性的影響 將各組以不同的處理方法處理后的小鼠,分別放入自主活動(dòng)測定箱中適應(yīng)2 min后,打開檢測設(shè)備,記錄小鼠5 min內(nèi)活動(dòng)次數(shù),進(jìn)行顯著性比較,其結(jié)果見表5。

表5 薰衣草精油緩釋乳膏對小鼠自主活動(dòng)的影響Table 5 Effect of lavender essential oil sustained-release cream on spontaneous activity of mice

采用方差分析,方差齊整體比較具有顯著性差異(F=124.9,P<0.01),對各組進(jìn)行單因素方差分析,模型組與對照組相比小鼠自主活動(dòng)性顯著增加,存在極顯著性差異(P<0.01),薰衣草精油組和緩釋乳膏組與模型組相比,出自主活動(dòng)性明顯減低,存在極顯著性差異(P<0.01)。

2.5.5 小鼠下丘腦中5-HT、NE、以及DA含量變化 采用ELISA試劑盒進(jìn)行三種神經(jīng)遞質(zhì)測定,測定方法按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行測定,對各組小鼠腦組織中的5-HT、DA和NE的含量進(jìn)行比較，結(jié)果見表6。

根據(jù)各組小鼠腦內(nèi)5-HT進(jìn)行單因素方差分析,檢測統(tǒng)計(jì)量F值為17.53(P<0.01),說明各組小鼠腦內(nèi)5-HT含量總體均值存在差異。模型組與對照組相比較,小鼠腦內(nèi)的5-HT含量顯著減小,存在極顯著性差異(P<0.01);薰衣草精油組和乳膏組與模型組相比,薰衣草精油組與緩釋乳膏組小鼠腦內(nèi)5-HT含量均顯著增加,存在極顯著差異(P<0.01),說明PCPA能夠減少小鼠腦內(nèi)5-HT的含量。

根據(jù)各組小鼠腦內(nèi)DA進(jìn)行單因素方差分析,檢測統(tǒng)計(jì)量F值為9.69,P<0.01,說明各組小鼠腦內(nèi)DA含量總體均值存在差異。模型組與對照組相比,小鼠腦內(nèi)的DA含量顯著增加,存在極顯著性差異(P<0.01);薰衣草精油組和緩釋乳膏組與模型組相比,小鼠腦內(nèi)DA含量均顯著減少,存在極顯著差異(P<0.01),說明PCPA能夠增加的小鼠腦內(nèi)的DA含量。

根據(jù)各組小鼠腦內(nèi)NE進(jìn)行單因素方差分析,檢測統(tǒng)計(jì)量F值為15.60(P<0.01),說明各組小鼠腦內(nèi)NE含量總體均值存在差異。對各組小鼠腦中NE進(jìn)行多重比較結(jié)果,模型組與對照組相比,小鼠腦內(nèi)的NE含量顯著增加,存在極顯著性差異(P<0.01);薰衣草精油組和乳膏組與模型組相比,小鼠腦內(nèi)NE含量顯著或極顯著減少(P<0.05或P<0.01),說明PCPA能夠增加的小鼠腦內(nèi)的NE含量。

3 結(jié)論

薰衣草精油是一種易揮發(fā)的物質(zhì),本實(shí)驗(yàn)對薰衣草精油的外用劑型-緩釋乳膏進(jìn)行了研究,制備了以薰衣草精油β-包合物、Hp-β-CD包合物以及精油作為主藥加入形式,當(dāng)精油、Hp-β-CD包合物精油、β-CD包合物精油比例分別為75%、15%、10%時(shí),緩釋乳膏系統(tǒng)對精油的緩釋作用較好,釋放規(guī)律呈現(xiàn)先速釋后恒速釋放。通過對小鼠進(jìn)行藥效學(xué)評價(jià),該緩釋乳膏能夠增加小鼠腦內(nèi)5-HT,減少腦內(nèi)DA和NE的水平發(fā)揮鎮(zhèn)靜催眠作用,對于PCPA引起的小鼠失眠具有顯著的改善作用[22-23]。