(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院,新疆烏魯木齊 830052)
新疆蕪菁(BrassicarapaL.),屬于十字花科(Cruciferae)蕓苔屬(Brassica)草本植物,主產(chǎn)于中國新疆天山西南、塔里木西北地區(qū),在新疆南部種植非常廣泛,是具有較長食用歷史的藥食同源植物[1]?!侗静菥V目》中記載蕪菁“辛、苦、平,無毒,可升可降,能汗能吐,能下能利小便,又能明目解毒,其效甚偉”[2]。藥理學(xué)分析表明,蕪菁中含有黃酮、生育酚、多糖、皂苷等多種植物化學(xué)物質(zhì)[3]。
植物多糖是由醛糖或酮糖組成的生物大分子,分為中性多糖和酸性多糖。果膠多糖是一種酸性多糖,可以分為聚半乳糖醛酸(HG)I型、聚鼠李半乳糖醛酸(RG-I)II型、聚鼠李半乳糖醛酸(RG-II)、木聚半乳糖醛酸(XGA)和芹糖聚半乳糖醛酸(AGA)[4],具有免疫調(diào)節(jié)[5]、抗腫瘤[6]、降膽固醇和血糖[7]等生物活性。新疆蕪菁多糖也越來越受到關(guān)注,張謙筱等[8]采用水提醇沉法提取新疆蕪菁粗多糖,并用Savege法除蛋白,活性炭脫色精制多糖;孫蓮等[1]采用水提醇沉法提取新疆蕪菁多糖,衍生化后采用RP-HPLC分離檢測,結(jié)果表明新疆蕪菁多糖由甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖等6種單糖組成,單糖的摩爾比為1.0∶2.5∶5.4∶2.4∶3.4∶3.7;艾克拜爾江·阿巴斯等[9]研究發(fā)現(xiàn)新疆蕪菁多糖對小鼠具有顯著的降血糖作用;Wang等[10]研究發(fā)現(xiàn),新疆蕪菁多糖對DPPH自由基、羥基自由基具有明顯的清除能力,清除能力與新疆蕪菁多糖含量具有一定的相關(guān)性。然而,目前有關(guān)新疆蕪菁果膠多糖組成分析、免疫調(diào)節(jié)活性的研究尚未見報(bào)道。
因此,本文從新疆蕪菁中分離純化得到果膠多糖純品,采用HPGPC、傅立葉紅外光譜、PMP衍生化分析等技術(shù)對新疆蕪菁果膠多糖的組成進(jìn)行分析,同時(shí)應(yīng)用小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7模型對其免疫活性進(jìn)行評價(jià),以期為新疆蕪菁果膠多糖在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用與開發(fā)提供理論依據(jù)和實(shí)踐指導(dǎo)。
新疆蕪菁 新疆烏魯木齊市北園春農(nóng)貿(mào)市場;小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7 南京中醫(yī)藥大學(xué);甲氮甲唑藍(lán)(MTT)、單糖標(biāo)品(鼠李糖、阿拉伯糖、核糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸及巖藻糖,純度>99%)、不同分子量普魯蘭多糖標(biāo)品(5.9、11.8、22.8、112、212、404及788 kDa) Sigma公司;DMEM培養(yǎng)基、雙抗(青霉素及鏈霉素)、胎牛血清(FBS)、0.25%胰蛋白酶消化液 Gibco公司;細(xì)胞因子(TNF-α、IL-1β和IFN-γ)ELISA測定試劑盒、一氧化氮(NO)檢測試劑盒 南京建成生物工程研究所;乙醚、乙醇、丙酮、三氟乙酸等試劑 均為國產(chǎn)分析純。
101A-1型自動(dòng)恒溫干燥箱 上海實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;H1850R臺式高速冷凍離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司;RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海羌強(qiáng)儀器設(shè)備有限公司;UV-2450紫外分光光度計(jì) 尤尼克有限公司;HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市杰瑞爾電器有限公司;KQ5200E超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;BSZ-16OF自動(dòng)部份收集器 上海精科實(shí)業(yè)有限公司;VERTEX33傅里葉變換紅外光譜儀 Brucker公司;6890N高效液相色譜儀 美國Agilent公司;Synergy-2酶標(biāo)儀 美國Biotek公司;SERIES 3111細(xì)胞培養(yǎng)箱 美國Thermo Scientific公司。
1.2.1 新疆蕪菁果膠多糖的提取及分離純化 提取:參照宋思圓等[11]的方法,將干燥的新疆蕪菁粉碎后過60目篩,加入80%的乙醇浸提24 h,重復(fù)2次,以去除其中的單糖、低聚糖、色素等雜質(zhì),料渣于25 ℃干燥備用。料渣采用液料比75 mL/g、提取溫度93 ℃、提取時(shí)間4.3 h及提取次數(shù)3次進(jìn)行熱水浸提,浸提液抽濾取上清,50 ℃旋蒸濃縮至1/8原體積,加入3倍體積無水乙醇后置于4 ℃冰箱過夜,3000 r/min 離心10 min取沉淀,25 ℃干燥,得到即為粗多糖。
純化:參照Wang等[10]的方法,稱取100 mg粗多糖溶解于10 mL蒸餾水,上樣至DEAE-Sepharose Fast Flow(2.6 cm×60 cm)纖維素陰離子交換層析柱中,以0.3 mol/L的NaCl溶液洗脫,流速1.0 mL/min,每管收集10 mL,苯酚-硫酸法[12]測定各管多糖含量,將洗脫液濃縮、透析、凍干得到初步純化的新疆蕪菁果膠多糖樣品;稱取150 mg初步純化樣品,溶于3 mL蒸餾水,上樣至Sephacryl S-200 HR凝膠柱(1.6 cm×100 cm)中,蒸餾水洗脫,流速0.2 mL/min,每管5 mL,苯酚-硫酸法[12]測定各管多糖含量,收集洗脫液,濃縮、透析、凍干,即為新疆蕪菁果膠多糖純品。
1.2.2 新疆蕪菁果膠多糖分子量測定
1.2.2.1 樣品處理 純化后的多糖樣品及不同分子量的普魯蘭標(biāo)準(zhǔn)品用去離子水配成2 mg/mL的溶液,過濾后采用高效液相凝膠透析色譜法(HPGPC)進(jìn)行檢測。
1.2.2.2 色譜條件 參照Ye等[13]的方法。高效液相色譜連接示差檢測器(RID)及TSK G4000 PWXL色譜柱;流動(dòng)相:超純水;流速:0.80 mL/min;進(jìn)樣量:20 μL;柱溫:30 ℃。用5.9、11.8、22.8、112、212、404及788 kDa的普魯蘭多糖標(biāo)品制備標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算得新疆蕪菁果膠多糖的分子量。
1.2.3 新疆蕪菁果膠多糖理化性質(zhì)分析 參照Dubois等[12]的方法,采用苯酚-硫酸法測定新疆蕪菁果膠多糖的總糖含量;參照Blumenkrantz等[14]的方法,采用間羥聯(lián)苯法測定新疆蕪菁果膠多糖的糖醛酸含量;參照Bradford等[15]的方法,采用考馬斯亮藍(lán)法測定新疆蕪菁果膠多糖的蛋白含量;參照Kawai等[16]的方法,采用氯化鋇-明膠比色法測定新疆蕪菁果膠多糖的硫酸基含量;參照Li等[17]的方法,采用福林酚比色法測定新疆蕪菁果膠多糖的總酚含量。
1.2.4 新疆蕪菁果膠多糖紅外光譜分析 參照Saleem等[18]的方法,稱取少量的純化多糖樣品(1~5 mg),與適量干燥的KBr粉末(1∶100)混合,研磨均勻后壓片,置于傅立葉紅外光譜儀上在4000~500 cm-1波長范圍內(nèi)進(jìn)行紅外掃描,對采集到紅外吸收圖譜進(jìn)行分析。
1.2.5 新疆蕪菁果膠多糖的單糖組成定量分析
1.2.5.1 樣品水解 參照連紫宛等[19]的方法。稱取5 mg純化多糖樣品于安瓿瓶中,加入2 mol/L的三氟乙酸(TFA)4 mL,將安瓿瓶封口后置于120 ℃下反應(yīng)2 h,冷卻至室溫,減壓旋干后,加入1 mL甲醇混合,繼續(xù)蒸干,重復(fù)2~3次。
1.2.5.2 水解樣品的PMP衍生化 參照連紫宛等[19]的方法。將100 μL酸水解溶液與0.6 mol/L的NaOH溶液等體積混合,加入0.5 mol/L的PMP甲醇溶液200 μL,混勻,置于70 ℃的干式恒溫器中反應(yīng)100 min,冷卻至室溫,再加入0.3 mol/L的HCl溶液100 μL;混合溶液在50 ℃條件下減壓旋干,加入1 mL去離子水重新溶解,另加1 mL氯仿進(jìn)行萃取,吸取水相,過0.45 μm水系濾膜后HPLC檢測。所有的單糖標(biāo)品(鼠李糖、阿拉伯糖、核糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸及巖藻糖)和混合單糖標(biāo)品(將上述所有單糖標(biāo)品按1∶1混合并配制成不同濃度0.5、1、2、3及4 mg/mL)也按照上述步驟進(jìn)行衍生化。
1.2.5.3 色譜條件 高效液相色譜連接二級管陣列檢測器(DAD)及RP-C18色譜柱;柱溫:30 ℃;流動(dòng)相:0.1 mol/L的PBS緩沖液(pH6.7)和乙腈按83∶17 (v/v)混勻;流速:l.0 mL/min;檢測波長:245 nm。
1.2.6 新疆蕪菁果膠多糖的免疫調(diào)節(jié)活性研究 將處于對數(shù)生長期的小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7用胰蛋白酶消化后,配成濃度為(5~10)×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液,接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(100 μL/孔),置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)使細(xì)胞重新貼壁。24 h后,吸棄培養(yǎng)基,加入100 μL不同濃度(12.5、25、50、100、200 μg/mL)的新疆蕪菁果膠多糖溶液,陽性對照組加入10 μg/mL的脂多糖100 μL(LPS),空白組加入100 μL的DMEM培養(yǎng)基,每組設(shè)3個(gè)平行孔。采用MTT法[20]檢測新疆蕪菁果膠多糖對小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7增殖活性及吞噬能力的影響;采用NO檢測試劑盒和酶聯(lián)免疫試劑盒(ELISA)對小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7的NO及不同細(xì)胞因子(TNF-α、IL-1β、IFN-γ)釋放量進(jìn)行測定。
所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示,繪圖采用Origin 8.5軟件,顯著性分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件單因素方差分析(One-way ANOVA)中的Tukey檢驗(yàn)。
采用HPGPC法對新疆蕪菁果膠多糖分子量進(jìn)行檢測,結(jié)果如圖1所示。
圖1 新疆蕪菁果膠多糖的HPGPC圖譜Fig.1 HPGPC profile of BRP
由圖1可知,新疆蕪菁果膠多糖出現(xiàn)了單一對稱的色譜峰,表明其具有較高的純度;普魯蘭多糖標(biāo)準(zhǔn)品的線性回歸方程為lg Mw=-0.4182t+8.9855,相關(guān)系數(shù)R2=0.9936,根據(jù)新疆蕪菁果膠多糖的出峰時(shí)間計(jì)算得出其平均分子量為838 kDa。
通過理化分析,結(jié)果表明新疆蕪菁果膠多糖的總糖含量為78.86%±1.01%、糖醛酸的含量為15.82%±1.05%、硫酸基的含量為0.14%±0.05%,但不含有蛋白質(zhì)和總酚。
采用傅立葉紅外光譜分析儀對新疆蕪菁果膠多糖進(jìn)行掃描,主要的吸收峰波數(shù)位置如圖2所示。
圖2 新疆蕪菁果膠多糖的紅外光譜圖Fig.2 FT-IR spectras of BRP
紅外光譜法是用來研究不同原子之間和極性鍵間的振動(dòng),是糖類物質(zhì)結(jié)構(gòu)研究的一個(gè)重要手段。如圖2,新疆蕪菁果膠多糖在3403 cm-1處出現(xiàn)峰型較寬的吸收峰,是由于糖鏈中非游離O-H伸縮振動(dòng)引起的;2941 cm-1處的吸收峰是由于C-H非對稱伸縮振動(dòng)引起的;1616 cm-1處的吸收峰是由于結(jié)合水的存在與COO-的非對稱伸縮振動(dòng)共同引起;1413 cm-1處的吸收峰是由于O-H變角振動(dòng)和C-O的伸縮振動(dòng)引起的[21];1101 cm-1是由于糖鏈中吡喃環(huán)的伸縮振動(dòng)引起的[22];每種多糖在915~810 cm-1范圍內(nèi)都有特征吸收峰,而896及833 cm-1處的吸收峰表明新疆蕪菁果膠多糖同時(shí)含有α-構(gòu)型糖苷鍵及β-構(gòu)型糖苷鍵[23]。由此可初步證明此樣品為多糖結(jié)構(gòu),特征峰明顯,無其他結(jié)構(gòu)特征峰,應(yīng)為多糖純品。
采用PMP衍生化法對新疆蕪菁果膠多糖的單糖組成進(jìn)行分析,混合標(biāo)準(zhǔn)單糖PMP衍生色譜圖如圖3所示,果膠多糖PMP衍生化色譜圖如圖4所示。
圖3 混合標(biāo)準(zhǔn)單糖的PMP衍生化色譜圖Fig.3 Chromatogram of PMP derivatives of mixed monosaccharide standards
圖4 新疆蕪菁果膠多糖的PMP衍生化色譜圖Fig.4 Chromatogram of PMP derivatives of BRP
圖5 新疆蕪菁果膠多糖對小鼠巨噬細(xì)胞 RAW264.7增殖活性的影響Fig.5 Effect of BRP on proliferation activity of RAW264.7 cell注:不同小寫字母代表差異顯著(P<0.05),圖5~圖10同。
由圖4可知,根據(jù)樣品在色譜圖中出峰時(shí)間及峰面積,新疆蕪菁果膠多糖由鼠李糖與半乳糖醛酸兩種單糖組成,且主要為半乳糖醛酸,其對應(yīng)的摩爾比為1.94∶98.06。該結(jié)果不同于Xie等[24]的研究發(fā)現(xiàn),從西藏蕪菁中純化得到的多糖組分都不含有半乳糖醛酸。
2.5.1 新疆蕪菁果膠多糖對小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7增殖活性的影響 巨噬細(xì)胞的增殖活性一般被認(rèn)為是多糖免疫調(diào)節(jié)活性的標(biāo)志[25]。新疆蕪菁果膠多糖對小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7增殖活性的影響如圖5所示。
采用MTT法檢測細(xì)胞增殖活性時(shí),用增殖指數(shù)表示樣品對小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7增殖活性的影響。當(dāng)細(xì)胞增殖指數(shù)大于1時(shí),表示細(xì)胞增殖;當(dāng)細(xì)胞增殖指數(shù)小于1時(shí),表示細(xì)胞生長受到抑制。如圖5所示,與空白組相比,當(dāng)樣品濃度在12.5~100 μg/mL時(shí),不同濃度的新疆蕪菁果膠多糖均可以顯著提高(P<0.05)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7的增殖活性,多糖濃度為100 μg/mL時(shí),增殖指數(shù)達(dá)到1.57,呈現(xiàn)明顯的劑量效應(yīng)。但當(dāng)多糖濃度為200 μg/mL時(shí),差異不顯著(與空白組相比,P>0.05)。以上結(jié)果表明新疆蕪菁果膠多糖具有免疫調(diào)節(jié)活性。
2.5.2 新疆蕪菁果膠多糖對小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7吞噬能力的影響 激活巨噬細(xì)胞最顯著的特征是增加其吞噬能力[26],從而起到保護(hù)機(jī)體和清除異物的功效。新疆蕪菁果膠多糖對小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7吞噬能力的影響如圖6所示。
圖6 新疆蕪菁果膠多糖對小鼠巨噬細(xì)胞 RAW264.7吞噬能力的影響Fig.6 Effect of BRP on phagocytosis of RAW264.7 cell
采用MTT法檢測細(xì)胞吞噬能力時(shí),用吞噬指數(shù)表示樣品對小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7吞噬能力的影響。當(dāng)細(xì)胞吞噬指數(shù)大于1時(shí),表示細(xì)胞吞噬能力增強(qiáng);當(dāng)細(xì)胞吞噬指數(shù)小于1時(shí),表示細(xì)胞吞噬能力被抑制。如圖6所示,與空白組相比,當(dāng)樣品濃度在12.5~100 μg/mL時(shí),不同濃度的新疆蕪菁果膠多糖均可以顯著提高(P<0.05)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7的吞噬能力,多糖濃度為100 μg/mL時(shí),吞噬指數(shù)達(dá)到1.55,呈現(xiàn)明顯的劑量效應(yīng)。但當(dāng)多糖濃度為200 μg/mL時(shí),差異不顯著(與空白組相比,P>0.05)。以上結(jié)果表明新疆蕪菁果膠多糖具有免疫調(diào)節(jié)活性。
2.5.3 新疆蕪菁果膠多糖對小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7的NO釋放量影響 NO是具有高活性自由基性質(zhì)的效應(yīng)分子,在宿主免疫應(yīng)答及機(jī)體防御中起著非常關(guān)鍵的作用[27]。新疆蕪菁果膠多糖對小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7的NO釋放量影響如圖7所示。
圖7 新疆蕪菁果膠多糖對小鼠巨噬細(xì)胞 RAW264.7的NO釋放量影響Fig.7 Effect of BRP on production of NO of RAW264.7 cell
由圖7可知,與空白組相比,當(dāng)新疆蕪菁果膠多糖濃度在12.5~100 μg/mL時(shí),均可以顯著促進(jìn)(P<0.05)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7的NO釋放量,多糖濃度為100 μg/mL時(shí),NO的釋放量達(dá)到7.29 μmol/L,呈現(xiàn)明顯的劑量效應(yīng),但仍然顯著低于(P<0.05)10 μg/mL的LPS陽性對照組(9.09 μmol/L)。
2.5.4 新疆蕪菁果膠多糖對小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7的TNF-α釋放量影響 TNF-α主要源自激活的巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞所釋放的重要細(xì)胞因子,具有抵御致病因子及參與免疫應(yīng)答等生物效應(yīng)[28]。新疆蕪菁果膠多糖對小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7的TNF-α釋放量影響如圖8所示。
圖8 新疆蕪菁果膠多糖對小鼠巨噬細(xì)胞 RAW264.7的TNF-α分泌量影響Fig.8 Effect of BRP on production of TNF-α of RAW264.7 cell
由圖8可知,與空白組相比,當(dāng)多糖濃度在12.5~200 μg/mL時(shí),新疆蕪菁果膠多糖均可以顯著提高(P<0.05)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7的TNF-α釋放量,呈現(xiàn)明顯的劑量效應(yīng);當(dāng)其濃度為200 μg/mL時(shí),TNF-α的釋放量達(dá)到最大,釋放量為35.15 ng/L,表明新疆蕪菁果膠多糖具有免疫調(diào)節(jié)活性。
2.5.5 新疆蕪菁果膠多糖對小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7的IL-1β釋放量影響 IL-1β對激活與調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞發(fā)揮著重要的作用[29]。新疆蕪菁果膠多糖對小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7的IL-1β釋放量影響如圖9所示。
圖9 新疆蕪菁果膠多糖對小鼠巨噬細(xì)胞 RAW264.7的IL-1β分泌量影響Fig.9 Effect of BRP on production of IL-1β of RAW264.7 cell
由圖9可知,與空白組相比,隨著多糖濃度的不斷增大,新疆蕪菁果膠多糖均可以顯著提高(P<0.05)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7的IL-1β釋放量,呈現(xiàn)明顯的劑量效應(yīng);當(dāng)其濃度為200 μg/mL時(shí),IL-1β的釋放量達(dá)到最大,釋放量為3.21 ng/L,但仍然顯著低于(P<0.05)10 μg/mL的LPS陽性對照組。
2.5.6 新疆蕪菁果膠多糖對小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7的IFN-γ釋放量影響 IFN-γ是具有多種生物學(xué)功能的糖蛋白,也是重要的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子,可以增強(qiáng)巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的活力,起到免疫調(diào)節(jié)作用[30]。新疆蕪菁果膠多糖對小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7的IFN-γ釋放量影響如圖10所示。
圖10 新疆蕪菁果膠多糖對小鼠巨噬細(xì)胞 RAW264.7的IFN-γ分泌量影響Fig.10 Effect of BRP on production of IFN-γ of RAW264.7 cell
由圖10可知,與空白組相比,當(dāng)多糖濃度在12.5~100 μg/mL時(shí),不同濃度的新疆蕪菁果膠多糖均可以顯著促進(jìn)(P<0.05)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7的IFN-γ釋放量,呈現(xiàn)明顯的劑量效應(yīng);當(dāng)其濃度為100 μg/mL時(shí),IFN-γ的釋放量達(dá)到最大,釋放量為28.25 ng/L,但仍然顯著低于(P<0.05)10 μg/mL的LPS陽性對照組。
本論文采用水提醇沉法結(jié)合不同凝膠柱色譜分離純化新疆蕪菁果膠多糖,并對其進(jìn)行組成分析及免疫活性評價(jià)。理化分析表明:新疆蕪菁果膠多糖總糖含量為78.86%±1.01%、糖醛酸的含量為15.82%±1.05%、硫酸基的含量為0.14%±0.05%,但不含有蛋白質(zhì)和總酚;傅立葉紅外光譜、HPGPC及PMP衍生化分析表明:新疆蕪菁果膠多糖為同時(shí)含有α-及β-構(gòu)型糖苷鍵的吡喃糖,分子量為838 kDa,由鼠李糖與半乳糖醛酸兩種單糖組成,其摩爾比為1.94∶98.06;RAW264.7細(xì)胞模型結(jié)果表明:當(dāng)新疆蕪菁果膠多糖濃度在12.5~100 μg/mL時(shí),小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7的增殖活性、吞噬能力、NO及不同細(xì)胞因子的釋放量隨著新疆蕪菁果膠多糖濃度的升高而升高,呈現(xiàn)明顯的劑量效應(yīng),說明新疆蕪菁果膠多糖具有很強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)活性。本文的研究結(jié)果為新疆蕪菁果膠多糖類產(chǎn)品的開發(fā)和利用提供了一定的科學(xué)證據(jù)和研究思路。