張瑤堯，黃榮師，郭晉宏，潘劍，陳承曉，黃天明，覃秋紅，羅國容

(廣西醫(yī)科大學(xué)，南寧530021)

衰老標(biāo)記蛋白30(SMP30)最早作為一種鈣調(diào)節(jié)蛋白被日本學(xué)者Yamaguchi等[1]發(fā)現(xiàn)。隨后，F(xiàn)ujita等[2]發(fā)現(xiàn)，SMP30是一種隨年齡增加而水平不斷下降、相對分子質(zhì)量約為34 kD的抗衰老蛋白。人SMP30主要存在于肝細(xì)胞中。在不同的脊椎動物中SMP30的氨基酸序列具有高度的保守性，即其同源性可達70%～90%。SMP30具有多種生物學(xué)功能，其中包括對肝細(xì)胞的保護作用和對肝細(xì)胞再生的調(diào)節(jié)作用[3]。我們在前期研究中用SEREX技術(shù)篩選出編號為HCC-22-5的人肝細(xì)胞癌(HCC)相關(guān)抗原與人SMP30羧基端100%同源，血清學(xué)初篩結(jié)果顯示在HCC患者血清中存在HCC-22-5抗原的相應(yīng)抗體，從而最先提出SMP30是一種人肝癌相關(guān)抗原，具有良好的免疫原性[4]。用人SMP30重組蛋白致敏人外周血血樹突狀細(xì)胞(DC)后可對DC的成熟起到促進作用，且能有效刺激自體T淋巴細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)生成對人肝癌細(xì)胞株BEL-7404有殺傷作用的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)，但致敏時間有限[5]。用與人肝癌相關(guān)抗原SMP30同源性很高的小鼠SMP30構(gòu)建慢病毒載體，體外轉(zhuǎn)染小鼠外周DC并使其穩(wěn)定表達SMP30蛋白，證明小鼠SMP30重組慢病毒體外轉(zhuǎn)染小鼠外周血DC對其成熟起到一定促進作用[6]。2017年7月～2018年7月，我們進一步用人肝癌相關(guān)抗原SMP30重組慢病毒轉(zhuǎn)染人外周血DC，觀察其對DC成熟的影響，為后續(xù)進一步研制人肝癌相關(guān)抗原DC疫苗提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 人外周血淋巴細(xì)胞分離液購自北京索萊寶科技有限公司；人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、白細(xì)胞介素4(IL-4)購自廣州賽業(yè)生物科技有限公司；人肝癌相關(guān)抗原SMP30重組慢病毒和空載慢病毒由課題組配合廣州復(fù)能基因有限公司制備；哺乳動物蛋白試劑盒和BCA蛋白定量試劑盒購自杭州弗德生物科技有限公司；Western blotting檢測試劑盒購自賽默飛世爾科技有限公司；PVDF膜購自美國BD公司；兔抗人SMP30多克隆抗體、兔抗人GAPDH多克隆抗體和HRP標(biāo)記的山羊抗兔 IgG抗體購自美國Novus公司；白細(xì)胞介素12(IL-12)和干擾素γ(INF-γ)的ELISA檢測試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司；人Fitc-CD1a、Fitc-CD80、PE-CD86流式標(biāo)記抗體購自美國BioLegend公司；R/MINI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶和雙抗購自美國Giboco公司。超凈工作臺購自蘇州尚田潔凈技術(shù)有限公司；二氧化碳培養(yǎng)箱購自美國Thermo Fisher Scientific公司；臺式高速離心機TG16-WS購自上海盧湘儀離心機儀器有限公司；Beckman 64R 高速冷凍離心機購自上海普迪生物技術(shù)有限公司；全自動熒光倒置及相差倒置顯微鏡購自日本Olympus公司；酶標(biāo)儀購自美國Thermo公司；流式細(xì)胞儀購自美國BD公司；UVI 凝膠成像分析系統(tǒng)購自日本Olympus公司。

1.2 人外周血DC的分離與體外培養(yǎng) 采用Ficoll密度梯度離心法。抽取健康志愿者外周血100 mL，加等量的PBS緩沖液稀釋。將稀釋好的血液緩慢沿離心管壁加到等量的人外周血淋巴細(xì)胞分離液上，室溫避光靜置20 min。室溫下2 000 r/min離心25 min，吸取白膜層。加等量PBS緩沖液清洗，室溫下1 500 r/min離心10 min后移去上清液，再加PBS緩沖液重復(fù)清洗1次。用R/MINI-1640完全培養(yǎng)基重懸分離得到的人外周血單個核細(xì)胞，接種于6孔板中，約5×106/孔，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，移去非貼壁細(xì)胞，用PBS緩沖液清洗2次貼壁細(xì)胞，加入含100 ng/mL GM-CSF和50 ng/mL IL-4的R/MINI-1640完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，隔天半量換液。

1.3 人外周血DC的鑒定 在普通光學(xué)顯微鏡下觀察、記錄細(xì)胞形態(tài)變化。收集培養(yǎng)第5天的細(xì)胞，對細(xì)胞進行計數(shù)，細(xì)胞數(shù)約為5×105個，PBS緩沖液清洗2次，離心后移去上清液，用預(yù)冷的PBS緩沖液100 μL重懸細(xì)胞，加入Fitc-CD1a流式標(biāo)志抗體5 μL，冰上避光孵育30 min，1 000 r/min離心5 min后移去上清液，PBS緩沖液清洗細(xì)胞1次，每管加入PBS緩沖液500 μL重懸細(xì)胞，在1 h 內(nèi)用流式細(xì)胞儀進行檢測。

1.4 慢病毒體外轉(zhuǎn)染 DC培養(yǎng)第6天，將其隨機分為SMP30慢病毒組、空載慢病毒組和空白對照組，分別用人肝癌相關(guān)抗原SMP30重組慢病毒和空載慢病毒(感染復(fù)數(shù)=85)進行體外轉(zhuǎn)染，并加入2 μg/mL的polybrene，每組設(shè)3個復(fù)孔。轉(zhuǎn)染12 h，于普通光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)，細(xì)胞無異常繼續(xù)培養(yǎng)至轉(zhuǎn)染24 h后，換新鮮的R/MINI-1640完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，72 h后開始用熒光顯微鏡觀察EGFP綠色熒光蛋白的表達情況。

1.5 DC中SMP30蛋白表達檢測 采用Western blotting法。在熒光顯微鏡下觀察到明顯綠色熒光后，用哺乳動物蛋白試劑盒提取各組DC的總蛋白，BCA蛋白定量法檢測提取的各組DC總蛋白濃度。具體實驗步驟按試劑盒操作說明進行。Western blotting檢測各組DC表達SMP30蛋白的表達情況。實驗前1 d制備5% SDS-PAGE濃縮膠和10% SDS-PAGE分離膠，4 ℃冰箱保存；加樣到5% SDS-PAGE濃縮膠和10% SDS-PAGE分離膠上在100 V穩(wěn)電壓下電泳1.5 h；根據(jù)一抗SMP30和內(nèi)參GAPDH的大小進行切膠；100 mA穩(wěn)電流轉(zhuǎn)到PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜時間為1.5 h；5%脫脂牛奶室溫下封閉2 h；PBST洗膜3次、清洗時間為10 min/次；4 ℃下孵育一抗(兔抗人SMP30多克隆抗體，1∶600稀釋和內(nèi)參抗體兔抗人GAPDH多克隆抗體，1∶2 000稀釋)過夜；PBST洗膜3次、10 min/次；室溫下孵育二抗(山羊抗兔 IgG抗體，1∶10 000稀釋)2 h；PBST洗膜3次、10 min/次；在PVDF膜上滴上新鮮配好的ECL發(fā)光液，用UVI凝膠成像分析結(jié)果。

1.6 DC細(xì)胞因子的分泌情況檢測 采用ELISA法。轉(zhuǎn)染后第8天吸取各組DC的培養(yǎng)上清液，4 ℃、14 000 r/min離心5 min后取上清液，用ELISA試劑盒檢測各組DC細(xì)胞因子IL-12、INF-γ的分泌情況。

1.7 DC表面分子CD80、CD86表達檢測 采用流式細(xì)胞術(shù)。收集各組DC，用PBS緩沖液清洗2遍，用預(yù)冷的PBS緩沖液重懸細(xì)胞后對細(xì)胞進行計數(shù)，確保每個EP管中100 μL細(xì)胞懸液中含5×105個細(xì)胞，各管分別加入帶Fitc-CD80和PE-CD86流式標(biāo)記抗體5 μL，冰上避光孵育30 min，1 000 r/min離心5 min后移去上清液，PBS緩沖液清洗細(xì)胞1次，每管加入PBS緩沖液500 μL重懸細(xì)胞，在1 h 內(nèi)用流式細(xì)胞儀測算CD80、CD86表達率。

2 結(jié)果

2.1 人外周血DC的體外培養(yǎng)與鑒定結(jié)果 分離人外周血獲得單個核細(xì)胞后，用細(xì)胞因子GM-CSF和IL-4誘導(dǎo)其生成DC。普通光學(xué)顯微鏡下觀察到未成熟的DC細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞集落明顯，貼附在孔板壁上生長；成熟的DC細(xì)胞形態(tài)呈類圓形，集落不再明顯，細(xì)胞表面有短的毛刺狀突起，多呈懸浮生長。誘導(dǎo)培養(yǎng)第5天，流式細(xì)胞術(shù)檢測DC表面分子CD1a的表達率為68.2%，說明成功將人外周血單個核細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)成DC。

2.2 慢病毒轉(zhuǎn)染人外周血DC結(jié)果 轉(zhuǎn)染第5天在熒光顯微鏡下可觀察到SMP30慢病毒組和空白對照組出現(xiàn)少量綠色熒光，第7天熒光蛋白表達趨于穩(wěn)定，DC轉(zhuǎn)染率75%左右，空白對照組熒光顯微鏡下未觀察到綠色熒光。

2.3 各組SMP30蛋白表達比較 SMP30慢病毒組在34 kD處出現(xiàn)明顯反應(yīng)條帶，與目的SMP30蛋白的相對分子質(zhì)量大小一致；而空載慢病毒組和空白對照組無明顯反應(yīng)條帶。SMP30慢病毒組成功過表達目的蛋白SMP30。

2.4 各組細(xì)胞因子分泌情況比較 SMP30慢病毒組、空載慢病毒組和空白對照組上清液中IL-12水平分別為(32.56±2.93)、(21.13±1.55)、(15.68±1.73)pg/mL，INF-γ水平分別為(42.34±5.82)、(21.68±2.23)、(14.14±2.16)pg/mL。SMP30慢病毒組上清液中IL-12、INF-γ水平高于空載慢病毒組、空白對照組(P均<0.05)。

2.5 各組CD80、CD86表達比較 SMP30慢病毒組、空載慢病毒組和空白對照組上清液中CD80表達率分別為48.7%、32.4%、18.1%，CD86表達率分別為21.0%、18.0%、10.2%。SMP30慢病毒組CD80、CD86表達率高于空載慢病毒組、空白對照組(P均<0.05)。

3 討論

腫瘤免疫治療近年來受到了眾多學(xué)者的關(guān)注，主要原因是腫瘤免疫治療可以減少手術(shù)、放療、化療等傳統(tǒng)常規(guī)療法對腫瘤患者免疫系統(tǒng)的損傷，并對晚期腫瘤患者的療效優(yōu)于傳統(tǒng)常規(guī)療法。DC是目前發(fā)現(xiàn)的機體內(nèi)功能最強大的抗原呈遞細(xì)胞，在免疫應(yīng)答過程中具有無法取代的地位，并且DC可在體外成功培養(yǎng)，使得以DC為基礎(chǔ)的腫瘤免疫治療成為國內(nèi)外的研究熱點[7]。Sipμleucel-T 在2010年成為第一個被FDA批準(zhǔn)的治療性腫瘤DC疫苗[8]。

目前，用于腫瘤免疫治療的DC疫苗大致分為腫瘤抗原或多肽致敏的DC疫苗和基因修飾的DC疫苗兩類[9]。本課題組在前期實驗中證明人肝癌相關(guān)抗原SMP30重組蛋白致敏人外周血DC后可促進DC的成熟和活化，但是這種方式獲得的DC疫苗持續(xù)作用時間有限。與腫瘤抗原或多肽致敏的DC疫苗相比，基因修飾的DC疫苗具有可長期表達抗原和細(xì)胞因子或共刺激分子、促進DC的成熟和活化、增強DC的抗原呈遞能力、誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞生成特異性CTL以及對抗腫瘤對DC的抑制等優(yōu)點[10，11]?；蛐揎椀腄C疫苗是借助分子生物學(xué)手段將外源性基因以基因轉(zhuǎn)移的方式導(dǎo)入DC內(nèi)部來獲得的，目前最為常用的方式之一是用慢病毒載體將目的基因轉(zhuǎn)至DC[12]。主要原因為慢病毒載體具有可轉(zhuǎn)染非分裂細(xì)胞、轉(zhuǎn)染率高、可承載較大的外源基因片段且穩(wěn)定表達的優(yōu)點[13]。本課題通過用構(gòu)建肝癌相關(guān)抗原SMP30慢病毒載體后再用其轉(zhuǎn)染DC的方式，以求獲得SMP30相關(guān)的更穩(wěn)定、更持續(xù)作用的DC疫苗。在前期實驗中，本課題組發(fā)現(xiàn)用與人SMP30有高度同源性的小鼠SMP30慢病毒轉(zhuǎn)染小鼠DC后可以促進DC的成熟，且比SMP30蛋白致敏的DC疫苗持續(xù)時間更長。在此研究基礎(chǔ)上，本研究用人肝癌相關(guān)抗原SMP30重組慢病毒在體外轉(zhuǎn)染人外周血DC后，檢測其對DC功能的成熟狀況的影響，從而探討該種方式是否適用于人。CD1a是目前最常用來鑒定人DC細(xì)胞的檢測指標(biāo)，在人外周血DC誘導(dǎo)培養(yǎng)的過程中，先通過對細(xì)胞形態(tài)的觀察和流式細(xì)胞術(shù)鑒定DC表面因子CD1a的表達情況來確定了人外周血DC的成功培養(yǎng)。結(jié)果說明成功用人SMP30重組慢病毒在體外轉(zhuǎn)染人外周血DC，并且使DC成功過表達目的蛋白SMP30。DC在不同的狀態(tài)下表達的表面免疫分子和分泌的細(xì)胞因子有所不同，其中，只有成熟的DC才會高表達協(xié)同刺激分子(CD80、CD86)、黏附分子、特征性標(biāo)記等，并分泌IL-12、TNF-α、IFN-α、IFN-γ等細(xì)胞因子[14]。本研究采用ELISA和流式細(xì)胞術(shù)來檢測DC的成熟情況，兩種檢測結(jié)果均顯示人SMP30慢病毒轉(zhuǎn)染人外周血DC后能促進DC的成熟。該結(jié)果與本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)的小鼠SMP30慢病毒可以促進小鼠DC成熟具有一致性，為后續(xù)實驗進一步研究人肝癌相關(guān)抗原SMP30致敏的DC疫苗及其對肝癌的殺傷作用提供了實驗基礎(chǔ)。