趙媛，羅洪林，劉軍杰，陳苗，黎樂群

(廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，南寧530021)

肝細胞癌(HCC)是目前世界第六大惡性腫瘤，在男性和女性中的致死率分別居第1位、第6位[1]。在我國，每年新發(fā)HCC病例數(shù)約占全球的55%，其中12%～19%的HCC患者為多結(jié)節(jié)HCC患者[2]。多結(jié)節(jié)HCC的起源分為多中心起源和單中心起源。多中心起源HCC各結(jié)節(jié)從彼此獨立的原發(fā)腫瘤灶克隆而來；而單中心起源HCC各結(jié)節(jié)內(nèi)具有相同克隆起源的腫瘤細胞，即肝內(nèi)轉(zhuǎn)移[3]。由于兩種不同起源的多結(jié)節(jié)HCC腫瘤生物學(xué)特性有較大差異，所選擇的治療措施和預(yù)后效果也各不相同。因此，如何精準的區(qū)分多結(jié)節(jié)HCC的起源成為首要任務(wù)[4]。近年來，在應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)鑒別多結(jié)節(jié)HCC克隆起源上取得了較大進展，本文對目前已報道的分子生物學(xué)檢測方法進行綜述。

1 多結(jié)節(jié)HCC的病理學(xué)特征

根據(jù)臨床病理學(xué)特征，結(jié)節(jié)型HCC可細分為三型：單結(jié)節(jié)(SN)型、單結(jié)節(jié)伴結(jié)節(jié)外生長(SNEG)型及多結(jié)節(jié)融合(CM)型。通常將SNEG稱為多結(jié)節(jié)HCC，CM型則不劃分入多結(jié)節(jié)HCC內(nèi)[5]。應(yīng)用組織病理學(xué)特征來確定多結(jié)節(jié)HCC的起源是最簡單的方法，即明確各腫瘤結(jié)節(jié)是單克隆來源還是多克隆來源，對二者進行區(qū)分[6]。

多中心HCC各結(jié)節(jié)的組織學(xué)分級和特征不同，其組織病理學(xué)特征包括：①高分化的早期HCC；②高度和中度分化并存的早期HCC(高度分化的HCC其邊緣中度分化[7])或低分化晚期HCC；③在分化程度和異型性上明顯不同的組織學(xué)分級[8]。

肝內(nèi)轉(zhuǎn)移性HCC腫瘤結(jié)節(jié)均為晚期腫瘤分級的進展性病變，其特征為：①腫瘤明顯從門靜脈血栓中生長；②腫瘤周圍有大的主要腫瘤，有多個衛(wèi)星結(jié)節(jié)；③主要腫瘤附近的小孤立腫瘤，其組織學(xué)上與主要腫瘤相似或較少分化[8]。

按照結(jié)節(jié)在肝炎病毒感染導(dǎo)致肝硬化的肝臟中發(fā)生的時間，可將多中心HCC劃分為同步發(fā)生和異時發(fā)生兩種[9]。同步多中心HCC的病理學(xué)特征包括：分化良好的結(jié)節(jié)和(或)分化良好的癌性結(jié)節(jié)中含有中度分化的腫瘤組織，這表明病變是在原位起源并增殖的，該病例被評估為同步多中心的HCC。在HCC中發(fā)現(xiàn)有腺瘤樣增生或者發(fā)現(xiàn)HCC前體病變的非典型腺瘤樣增生，此時考慮為異時多中心HCC[10]。

通過病理學(xué)特點進行區(qū)分僅適用于分化良好的腫瘤細胞，當腫瘤細胞分化程度低并且數(shù)量少時，應(yīng)用病理學(xué)來分類則比較困難。因此，應(yīng)用分子生物學(xué)檢測方法來補充病理學(xué)診斷非常必要[11]。

2 鑒別多結(jié)節(jié)肝癌克隆起源的分子生物學(xué)技術(shù)

2.1 乙型肝炎病毒DNA整合方式 HCC的發(fā)生與慢性肝炎和病毒感染引起的肝硬化緊密相關(guān)。其中，乙型肝炎病毒引起的肝硬化是導(dǎo)致HCC發(fā)生最常見的原因之一。乙型肝炎病毒是一種DNA病毒，在大多數(shù)由慢性乙型肝炎病毒攜帶者發(fā)展為肝細胞癌的患者中，病毒基因組被克隆整合入宿主染色體DNA。在已經(jīng)進行過的分子研究中發(fā)現(xiàn)，病毒整合入宿主基因組導(dǎo)致新的融合轉(zhuǎn)錄物和(或)局部基因組不穩(wěn)定，導(dǎo)致宿主和(或)病毒基因組序列的二級缺失、重排、重復(fù)或易位[12]。Ng等[13]研究顯示，應(yīng)用Southern印跡法對多結(jié)節(jié)HCC中HBV整合情況進行分析，其中多中心起源者結(jié)節(jié)之間Southern印跡條帶模式有差異，觀察到不同的HBV整合模式，證明結(jié)節(jié)的不同克隆性。而單中心者在相應(yīng)的結(jié)節(jié)中顯示出幾乎完全相同的條帶模式，揭示了相似或相同的克隆起源。但是該方法來區(qū)分單中心起源和多中心起源的局限性在于僅應(yīng)用于被乙型肝炎病毒感染者或女性患者[14]。

2.2 p53基因突變類型分析 p53是最頻繁突變的人類抑癌基因之一，大多數(shù)突變位于密碼子249的一個核苷酸對處[15]。p53基因突變是導(dǎo)致HCC發(fā)生的主要因素，因為p53基因突變會影響p53蛋白在HCC中的表達.p53蛋白在HCC中起重要作用，其高表達可能表明存在腫瘤轉(zhuǎn)移和門靜脈侵襲，并且可以在晚期腫瘤中明顯觀察到[16]。Oda等[17]研究表明，在大部分多結(jié)節(jié)HCC中，至少在一個結(jié)節(jié)中顯示基因突變。HCC中存在三種不同的p53突變模式，其中模式A-B和A-0分別表示結(jié)節(jié)之間p53突變存在差異，結(jié)節(jié)內(nèi)的細胞克隆來源不同。因此，有顯示為這兩種遺傳模式的病例可以被診斷為多中心起源。而在A-A型病例中顯示出相同遺傳異常的結(jié)節(jié)很可能來源于相同的克隆，說明此時多結(jié)節(jié)HCC為肝內(nèi)轉(zhuǎn)移導(dǎo)致。p53突變的分析在許多缺乏p53突變的HCC患者中受到阻礙，常與其他方法聯(lián)合應(yīng)用[18]。

2.3 甲胎蛋白(AFP)基因低甲基化分析 AFP由胚胎肝細胞合成[19]，在正常肝細胞中不表達，但在HCC細胞中特異性表達，70%～80%的HCC組織中可檢測到其重新表達，可作為診斷HCC的生物標志物[20]。HCC組織中AFP基因的表達有助于血清AFP水平的升高。Peng等[21]研究表明AFP基因的5'區(qū)域低甲基化與肝細胞癌中的AFP基因再表達相關(guān)，并且通過檢測HCC結(jié)節(jié)中AFP mRNA有助于區(qū)分單中心和多中心HCC，在AFP升高的7例多中心HCC中，有5例只在衛(wèi)星結(jié)節(jié)檢測到AFP mRNA，主瘤內(nèi)均檢測不到AFP mRNA。7例帶有衛(wèi)星結(jié)節(jié)的單中心HCC,其中在4例AFP水平升高相關(guān)的HCC所有腫瘤結(jié)節(jié)中檢測到AFP mRNA，但在其余3個AFP水平正常病例中未檢測到AFP mRNA表達。Wang等[22]也有研究表明，單中心起源組中的AFP水平明顯高于多中心起源組。

2.4 線粒體DNA(mtDNA)D-環(huán)區(qū)(D-Loop)突變分析 mtDNA包含1個獨特的非編碼D-Loop，該區(qū)域控制著轉(zhuǎn)錄和mtDNA的復(fù)制[23]。mtDNA的D-Loop區(qū)突變發(fā)生在大多數(shù)癌癥中，該區(qū)的突變也是確定多結(jié)節(jié)HCC的細胞克隆起源的有用標記。通過對各結(jié)節(jié)腫瘤組織和門靜脈腫瘤栓子中mtDNA D-Loop區(qū)的序列檢測，顯示該區(qū)域具有相同的變異，證明組織來源于相同的原發(fā)性腫瘤結(jié)節(jié)，即可確定多結(jié)節(jié)HCC為單中心來源。在這種情況下，mtDNA D-Loop區(qū)序列的測定對于區(qū)分MO和IM是有效的、可行的，即可以確定多結(jié)節(jié)HCC的細胞克隆起源[24]。但mtDNA D-loop區(qū)突變可能發(fā)生在HCC發(fā)展過程中的任何階段，難以確定每個結(jié)節(jié)的細胞克隆來源[25]。

2.5 比較基因組雜交(CGH)技術(shù) CGH技術(shù)是一種具有高度特異性的分子細胞遺傳學(xué)方法，在整個基因組中進行DNA序列增益和損失的位置識別[26]。其為HCC的細胞遺傳學(xué)及多中心生長與轉(zhuǎn)移性擴散的提供了新的見解。Wilkens等[27]研究表明，某些染色體的改變在單中心起源和多中心起源的各個腫瘤結(jié)節(jié)內(nèi)并無明顯差異，而特定染色體內(nèi)的畸變模式在此兩種起源的多結(jié)節(jié)HCC中則有明顯不同。利用cDNA微陣列對單中心起源和多中心起源的多結(jié)節(jié)HCC進行分析從而達到區(qū)分目的，發(fā)現(xiàn)原發(fā)性腫瘤相同的不同轉(zhuǎn)移瘤中，基因表達的總體模式是相似的，意味著轉(zhuǎn)移性進展是從原發(fā)性腫瘤中開始的。而多中心起源的基因表達模式則各不相同[28]，CGH與先前用于區(qū)分多結(jié)節(jié)HCC肝內(nèi)轉(zhuǎn)移與多中心生長的其他方法相比具有明顯優(yōu)勢，但CGH在實施上有難度，具有一定的局限性[27]。

2.6 蛋白組學(xué)技術(shù) 應(yīng)用蛋白組學(xué)技術(shù)，可觀察到HCC患者組織中某些已被用為鑒定HCC的潛在標志物蛋白質(zhì)表達上調(diào)，如過氧化物酶3、骨橋蛋白、AFP等[29]。分析兩種不同起源多結(jié)節(jié)HCC的蛋白質(zhì)組表達譜，來鑒定不同蛋白分子在單中心起源和多中心起源中起到的作用，同時為篩選蛋白質(zhì)標記物以區(qū)分HCC起源和建立診斷模型提供基礎(chǔ)。也可通過蛋白組學(xué)來篩選不同細胞克隆起源的多結(jié)節(jié)HCC的差異蛋白表達譜，可在多種因素的影響下鑒定腫瘤細胞的蛋白質(zhì)組變化，并尋找直接參與腫瘤的發(fā)生、進展、侵襲、轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵蛋白質(zhì)分子[2]。但不同蛋白質(zhì)生物標記物的靈敏性與特異性各不相同，利用蛋白質(zhì)標記物的組合來創(chuàng)建更靈敏的生物標記物組可以改善檢測性能[29]。與基因組分析不同，蛋白組學(xué)分析直接由蛋白質(zhì)表達水平?jīng)Q定，這能更好地檢測細胞功能。因此，蛋白質(zhì)譜分析是確定HCC發(fā)生、進展和化療耐藥性潛在分子機制的首選方法。

2.7 下一代測序技術(shù) 目前有關(guān)癌癥的基因組研究主要集中在編碼區(qū)的突變，而其他類型的突變?nèi)绶蔷幋a區(qū)的堿基置換或插入以及結(jié)構(gòu)變異通常被忽略，因其對癌癥發(fā)展的影響難以評估和解釋。評估編碼區(qū)突變有害性的一種方法是檢查這些基因組改變及轉(zhuǎn)錄結(jié)果，應(yīng)用下一代測序能夠通過全基因組測序(WGS)、外顯子組測序(WES)和轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-Seq)等技術(shù)大規(guī)模全面分析癌癥基因組[4]，以確定不同腫瘤部位或多個腫瘤結(jié)節(jié)中的遺傳異質(zhì)性及其可能具有的功能，為治療及預(yù)后提供建議。

Shi等[30]對1名同時患有2例同時性多結(jié)節(jié)HCC(HCC-A、HCC-B)、1例肝內(nèi)膽管癌(ICC)和2例復(fù)發(fā)性HCC的患者進行多區(qū)域WES，以了解各腫瘤的克隆性和異質(zhì)性。3例原發(fā)腫瘤在突變和拷貝數(shù)變異中幾乎無重疊，各腫瘤多區(qū)域測序數(shù)據(jù)顯示不同的腫瘤內(nèi)異質(zhì)性(HCC-A中21.6%、HCC-B中20.4%、ICC中53.2%)，則2例同時性多結(jié)節(jié)HCC為同時性多中心HCC。2例復(fù)發(fā)性腫瘤的突變特征顯示與HCC-A明顯相似(分別為86.7%和86.6%)，表明其起源極有可能同為HCC-A。結(jié)果表明，通過WES可以確定同步性HCC克隆起源是否相同，甚至可以確定復(fù)發(fā)腫瘤起源于何種原發(fā)腫瘤，對鑒別多結(jié)節(jié)HCC的克隆起源有重要價值。

WGS可在單細胞水平上確定多結(jié)節(jié)HCC的克隆起源，為癌癥生物多樣性提供新的見解[31]。通過WGS和RNA-Seq更深入地了解癌癥基因組中的基因組突變和轉(zhuǎn)錄異常之間的關(guān)系，二者綜合分析是解釋癌癥基因組和了解癌癥生物學(xué)潛在基因組改變的關(guān)鍵途徑。但WGS過程復(fù)雜，費用較昂貴，超過了絕大多數(shù)單位可接受的程度，所以暫時不能得到廣泛推廣使用。

WGS和WES均已用于大規(guī)模檢測單核苷酸變異。雖然WGS可以檢測整個癌癥基因組中的全部變異譜、拷貝數(shù)變異和結(jié)構(gòu)變異體，其在1%～2%編碼功能蛋白基因組中檢測單核苷酸變異和插入缺失時更具成本效益。外顯子組織中單核苷酸變異是許多疾病的病因，因此WES已廣泛應(yīng)用于研究和臨床[32]。

利用分子生物學(xué)技術(shù)確定多結(jié)節(jié)HCC的克隆起源，從實用方面來說，若想確定HCC是多中心起源還是單中心起源，需對每個結(jié)節(jié)進行檢測。因結(jié)節(jié)之間可能存在異質(zhì)性，只對一個結(jié)節(jié)的克隆起源進行評估無法確定其他結(jié)節(jié)的起源。這必然加大檢測的復(fù)雜程度。應(yīng)考慮聯(lián)合應(yīng)用已有的分子生物學(xué)鑒別手段，以彌補單一檢測方法存在的缺陷，從而達到最佳的鑒別效果。另外，實現(xiàn)精準鑒別多結(jié)節(jié)HCC克隆起源，需不斷探索發(fā)現(xiàn)新的分子生物學(xué)標記物。