唐丹，劉勛，楊志惠

(1西南醫(yī)科大學(xué)，四川瀘州646000；2西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院)

結(jié)腸癌(CRC)是我國消化系統(tǒng)好發(fā)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率居腫瘤第3位，致死率居腫瘤第5位[1]。結(jié)腸癌的發(fā)病率及致死率呈逐年上升趨勢，但發(fā)病機制目前仍不清楚。目前結(jié)腸癌的治療多采用手術(shù)聯(lián)合放化療為主，但有部分患者確診時已無手術(shù)指征，靶向治療成為治療結(jié)腸癌的重要突破點。GTP結(jié)合蛋白4(GTPBP4)基因，又名腦紅蛋白基因、核仁G蛋白1基因，定位于人染色體10p15-14[2]。GTPBP4基因在真核生物核糖體60S亞基合成和成熟過程中起關(guān)鍵作用[3]，與秀麗隱桿線蟲的生長發(fā)育、壽命、脂肪代謝等密切相關(guān)，過表達(dá)GTPBP4基因?qū)?dǎo)致其壽命縮短[4]。GTPBP4與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。GTPBP4高表達(dá)與結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)，并且結(jié)直腸癌患者高表達(dá)GTPBP4預(yù)后差[5]。目前有研究發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌細(xì)胞GTPBP4基因敲除后，會引起p53積累，腫瘤細(xì)胞增殖受到抑制[6]。p53基因存在兩種形式，野生型p53是公認(rèn)的腫瘤抑制基因，其過表達(dá)或激活將引發(fā)腫瘤細(xì)胞死亡，低表達(dá)或失活則會導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。抑癌基因p53可以下調(diào)凋亡抑制蛋白survivin的表達(dá)，而這種負(fù)性調(diào)節(jié)作用能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[8]。目前關(guān)于GTPBP4基因在結(jié)腸癌生物學(xué)行為方面的作用及與野生型p53、Survivin相關(guān)性的研究相對較少。2017年6月～2018年2月，本研究將GTPBP4-RNAi干擾慢病毒轉(zhuǎn)染至結(jié)腸癌HT29細(xì)胞，觀察GTPBP4基因沉默后細(xì)胞生物學(xué)行為的改變，并探討與p53、Survivin的聯(lián)系。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑及儀器 結(jié)腸癌細(xì)胞株HT29(上海中科院)；pGCSIL-GFP/GTPBP4-RNAi慢病毒載體(上海吉凱基因科技有限公司)，細(xì)胞周期試劑盒(碧云天公司)，細(xì)胞凋亡試劑盒(上海凱基)，Transwell小室(Costar公司)，CCK-8試劑(同仁化學(xué)研究所)，兔抗人GTPBP4單克隆抗體(Abcam公司)，鼠抗人P53單克隆抗體、兔抗人Survivin單克隆抗體(Cell signaling TEC公司)，鼠抗人GAPDH單克隆抗體(BI公司)；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo公司)，倒置顯微鏡、熒光顯微鏡(日本Olympus)，PCR擴增儀(Roche480)，紫外分光光度計(艾德)，流式細(xì)胞儀(BD公司)。

1.2 HT29細(xì)胞慢病毒轉(zhuǎn)染 胰酶消化對數(shù)生長期的HT29細(xì)胞，離心收集后，以5×104/mL將細(xì)胞懸液接種于6孔板中，于37 ℃、5% CO2的條件培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)30%，隨機分為轉(zhuǎn)染組與陰性對照組，轉(zhuǎn)染組加入適量GTPBP4-RNAi慢病毒(感染復(fù)數(shù)值為10)，陰性對照組轉(zhuǎn)染含有非特異性干擾序列的陰性病毒。感染48～72 h觀察該細(xì)胞熒光的表達(dá)情況，當(dāng)熒光表達(dá)率大于80%，收集細(xì)胞提取RNA和蛋白，以Real-time PCR和Western blotting證實轉(zhuǎn)染成功。

1.3 細(xì)胞增殖能力檢測 采用CCK8法。取感染72 h后兩組細(xì)胞，胰酶消化制成細(xì)胞懸液，分別接種到96孔板中，每孔接種體積100 μL，細(xì)胞數(shù)約1 000個，每組設(shè)6個復(fù)孔；96孔板放入孵箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72、96 h后，更換新鮮無血清培養(yǎng)基100 μL，各加入CCK-8 10 μL，放入37 ℃孵箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h，用酶標(biāo)儀檢測450 nm波長處的吸光度。

1.4 細(xì)胞遷移能力檢測 采用劃痕實驗。接種細(xì)胞前用記號筆在6孔板背后均勻地劃橫線，每孔5條線。將感染后的兩組細(xì)胞消化離心后，每孔加入約5×105個細(xì)胞。第2天用10 μL槍頭垂直于背后的橫線劃痕。用PBS洗細(xì)胞3次，去除劃下的細(xì)胞，再加入無血清培養(yǎng)基。放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。按0、24、48 h觀察細(xì)胞劃痕愈合情況，拍照。

1.5 細(xì)胞侵襲能力檢測 采用Transwell實驗。取轉(zhuǎn)染后處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，胰酶消化后制成細(xì)胞懸液，向準(zhǔn)備好的Transwell小室上層中加入1×105個細(xì)胞。下室中加入500 μL含10% FBS的完全培養(yǎng)基，每組設(shè)立5個復(fù)孔，培養(yǎng)24 h。4%多聚甲醛固定小室15 min，倒轉(zhuǎn)放置，風(fēng)干。0.1%結(jié)晶紫染色20 min，PBS洗3次。顯微鏡下觀察，隨機計數(shù)10個高倍視野穿過基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)，取平均值。

1.6 細(xì)胞周期檢測 采用流式細(xì)胞術(shù)。取處于對數(shù)生長期的兩組細(xì)胞，胰酶消化后，以2 000 r/min離心5 min收集細(xì)胞沉淀，PBS洗滌離心3次后，進(jìn)行PI染色，室溫避光孵育，流式細(xì)胞儀上機檢測。

1.7 細(xì)胞凋亡檢測 采用AnnexinⅤ-APC單染法。取處于對數(shù)生長期的兩組細(xì)胞，胰酶消化后，PBS洗滌離心，收集細(xì)胞沉淀；1×binding buffer液洗滌細(xì)胞沉淀1次，以2 000 r/min離心5 min，收集細(xì)胞；細(xì)胞沉淀加入1 mL 1×staining buffer重懸；取細(xì)胞懸液100 μL(1×105～1×106個細(xì)胞)，加入AnnexinV-APC 5 μL進(jìn)行染色，室溫避光孵育15 min后，轉(zhuǎn)移至流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，每組重復(fù)3次。

1.8 細(xì)胞克隆形成實驗 胰酶消化法收集對數(shù)生長期的兩組細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，重懸后進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。6孔板每孔接種1×104個細(xì)胞，每個轉(zhuǎn)染組設(shè)3個復(fù)孔。于CO2恒溫孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞，培養(yǎng)期間每3天觀察一次細(xì)胞生長狀態(tài)并且換液，細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)2周后終止；用PBS洗滌后每孔加入1 mL多聚甲醛液，固定30～60 min后，PBS 洗滌。再每孔加入無雜質(zhì)結(jié)晶紫染液500 μL，染色20 min，ddH2O洗滌多余染料后，計數(shù)，拍照。

1.9 細(xì)胞內(nèi)p53、Survivin蛋白表達(dá)檢測 采用Western blotting。RIPA裂解法提取細(xì)胞總蛋白，采用BCA法對蛋白進(jìn)行定量，加入PBS和Loading Buffer 補齊，99 ℃變性10 min。 配置10%的分離膠和5%的濃縮膠，經(jīng)恒壓60 V電泳0.5 h后轉(zhuǎn)為恒壓120 V繼續(xù)電泳1.5 h，電轉(zhuǎn)100 V 2 h至PVDF膜，5%的脫脂奶粉(或BSA)封閉2 h，根據(jù)相關(guān)蛋白的分子量切膠后，分別加入p53、Survivin抗體(1∶1 000)及GAPDH抗體(1∶2 000)，4 ℃搖床孵育過夜。1×TBST洗膜4次，每次5 min，加入二抗后室溫下?lián)u床孵育1 h，再次1×TBST洗膜4次，并運用ECL法檢測。Image J軟件分析各條帶灰度值。蛋白相對表達(dá)量=目的基因灰度值/內(nèi)參灰度值。

1.10 細(xì)胞內(nèi)p53、Survivin蛋白定位檢測 采用細(xì)胞免疫熒光法。取感染后處于對數(shù)生長期的兩組細(xì)胞，胰酶消化離心，按每孔5×105個細(xì)胞接種于裝有蓋玻片的6孔板中，待細(xì)胞貼壁后加入30 mg/L DADS。繼續(xù)培養(yǎng)24 h。取出蓋玻片，PBS洗滌，用多聚甲醛固定30 min。0.5% Triton X-100通透細(xì)胞20 min，PBS洗滌3次。山羊血清封閉30 min。加入一抗，4 ℃孵育過夜。PBS清洗后，加入二抗，室溫濕盒內(nèi)避光孵育2 h。PBS洗滌。DAPI避光下復(fù)染細(xì)胞核10 min。最后封片，顯微鏡檢測熒光表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1 沉默GTPBP4基因?qū)T29細(xì)胞增殖能力的影響 培養(yǎng)24、48、72、96 h轉(zhuǎn)染組OD值分別為0.77±0.01、1.06±0.02、1.64±0.02、2.10±0.06，陰性對照組分別為0.92±0.03、1.34±0.04、2.27±0.02、3.17±0.09。各時間點轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖能力較陰性對照組低(P均<0.05)。

2.2 沉默GTPBP4基因?qū)T29細(xì)胞遷移能力的影響 劃痕后48 h，轉(zhuǎn)染組相對遷移距離(500.01±1.82)較陰性對照組(781.23±10.51)短(P<0.05)。

2.3 沉默GTPBP4基因?qū)T29細(xì)胞侵襲能力的影響 接種48 h后，轉(zhuǎn)染組穿膜細(xì)胞數(shù)(91±4)個/5HPF，陰性對照組為(263±12)個/5HPF，轉(zhuǎn)染組穿膜細(xì)胞數(shù)較陰性對照組少(P<0.05)。

2.4 沉默GTPBP4基因?qū)T29細(xì)胞周期的影響 轉(zhuǎn)染組G1期細(xì)胞比例(82.16%)較陰性對照組(62.56%)高，G2期細(xì)胞細(xì)胞比例(5.91%)較陰性對照組(6.17%)低，S期細(xì)胞比例(11.93%)較陰性對照組(31.27%)低。兩組各周期細(xì)胞分布比例比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。

2.5 沉默GTPBP4基因?qū)T29細(xì)胞凋亡的影響 轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率(30.09%)較陰性對照組細(xì)胞(9.41%)高(P<0.05)。

2.6 沉默GTPBP4基因?qū)?xì)胞克隆形成的影響 轉(zhuǎn)染組克隆形成的細(xì)胞集落數(shù)目為(68±2)個/孔，陰性對照組為(115±3)個/孔，轉(zhuǎn)染組克隆形成的細(xì)胞集落數(shù)目較陰性對照組少(P<0.05)。

2.7 沉默GTPBP4基因?qū)?xì)胞內(nèi)p53及Survivin蛋白表達(dá)的影響 轉(zhuǎn)染組p53及Survivin蛋白相對表達(dá)量分別為1.339 8±0.013 6、0.453 3±0.027 5，陰性對照組分別為0.747 1±0.100 9、0.856 8±0.079 0。與陰性對照組比較，轉(zhuǎn)染組p53蛋白相對表達(dá)量高(P<0.05)，Survivin蛋白相對表達(dá)量低(P<0.05)。

2.8 兩組蛋白定位情況 兩組p53、Survivin蛋白均主要表達(dá)于細(xì)胞核，未發(fā)生表達(dá)位置改變。

3 討論

GTPBP4編碼的GTP結(jié)合蛋白4，是由633個氨基酸組成的重要功能蛋白[8]，定位于細(xì)胞核。GTPBP4在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中扮演重要角色。GTPBP4在神經(jīng)鞘瘤中結(jié)合merlin，通過抑制cyclinD1表達(dá)，最終抑制腫瘤細(xì)胞增殖[9]。與以上研究結(jié)果相反，Lunardi[6]等發(fā)現(xiàn)GTPBP4的表達(dá)與野生型p53乳腺癌患者生存率呈負(fù)相關(guān)。GTPBP4高表達(dá)與結(jié)直腸[5]、肝癌[10]細(xì)胞遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)，并且GTPBP4高表達(dá)患者預(yù)后差。本研究發(fā)現(xiàn)，在有效敲減GTPBP4基因后，結(jié)腸癌細(xì)胞的周期阻滯、克隆形成明顯減少，細(xì)胞凋亡率升高，細(xì)胞侵襲能力減弱。提示GTPBP4可能是癌基因。

p53是一種腫瘤抑制因子，常在人類腫瘤中發(fā)生突變[11]，突變后的p53由癌基因轉(zhuǎn)變?yōu)橐职┗颍哂写龠M(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、生長，而抑制腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，可以抵消野生型p53的正常功能[12,13]。本研究沉默GTPBP4基因后，HT29細(xì)胞內(nèi)p53蛋白表達(dá)升高，細(xì)胞一系列的生物學(xué)行為受到抑制。同時有研究指出藥物刺激等外界因素作用，能使HT29細(xì)胞的突變型p53恢復(fù)為野生型p53[14]。據(jù)此推測，沉默GTPBP4基因后，細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的p53蛋白可能主要以野生型為主。在后續(xù)實驗中可通過檢測野生型p53下游靶基因P21、Hdm2等的表達(dá)加以驗證。研究顯示GTPBP4是p53的陰性調(diào)控子，能直接結(jié)合p53，導(dǎo)致其腫瘤抑制作用減弱[6]。沉默GTPBP4后，腫瘤細(xì)胞的增殖能力降低，而凋亡增加，p53蛋白表達(dá)上調(diào)，Survivin蛋白表達(dá)降低。可能由于GTPBP4對p53的抑制作用減弱，引起p53表達(dá)上調(diào)。另外，由于GTPBP4是核糖體60S晚期生物合成和成熟的關(guān)鍵因素，則GTPBP4可能通過核糖體-Mdm2-p53信號軸增強p53的核內(nèi)表達(dá)，進(jìn)而影響細(xì)胞增殖和凋亡。當(dāng)各種原因?qū)е潞颂求wRNA合成減少，核仁處于應(yīng)激狀態(tài)時，核糖體-Mdm2-p53通路被觸發(fā)，即核糖體與MDM2相互作用激活p53。在應(yīng)激條件下，磷酸化的p53從MDM2-p53復(fù)合物中解離，而MDM2是p53的負(fù)性調(diào)節(jié)蛋白以及E3泛素化連接酶，磷酸化的p53進(jìn)一步抑制MDM2-P53的結(jié)合，MDM2介導(dǎo)的p53泛素化降解反應(yīng)受到抑制后，p53表達(dá)上調(diào)[15]。細(xì)胞表達(dá)野生型p53或p21(Cip1)使細(xì)胞周期阻滯在G1期。也有研究表明野生型p53能抑制Survivin的mRNA及蛋白表達(dá)水平，對survivin有負(fù)性調(diào)節(jié)作用，其機制是p53對Survivin啟動子中染色質(zhì)的修飾，致使其沉默[16]。Survivin屬于凋亡抑制蛋白家族成員之一，能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、血管生成，并具有抗凋亡等生物學(xué)功能[17]。已經(jīng)證明下調(diào)Survivin在動物體內(nèi)的表達(dá)，能夠抑制腫瘤生長。本研究發(fā)現(xiàn)，沉默GTPBP4基因，p53蛋白表達(dá)量增加，而Survivin蛋白表達(dá)量降低，并且二者表達(dá)定位仍然在細(xì)胞核內(nèi)。表明GTPBP4基因在結(jié)直腸癌細(xì)胞核可能與p53、Survivin存在相互作用，共同參與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，GTPBP4基因沉默后，可能對p53抑制作用減弱和影響核糖體蛋白的生物合成觸發(fā)了RP-Mdm2-p53這一信號通路，使抑癌基因p53被激活，抑制抗凋亡蛋白Survivin表達(dá)，最終發(fā)揮抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖誘導(dǎo)其凋亡的作用。當(dāng)然這一結(jié)論還需結(jié)合體內(nèi)實驗來進(jìn)一步驗證。GTPBP4的表達(dá)與結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)，值得關(guān)注的是其與結(jié)腸癌患者預(yù)后也有一定的相關(guān)性。因此，對GTPBP4的研究為今后腫瘤的靶向治療及預(yù)后評估奠定基礎(chǔ)。